Xác định các đột biến trên gen KATG liên quan đến tính kháng thuốc isoniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam - pdf 15

Download miễn phí Luận văn Xác định các đột biến trên gen KATG liên quan đến tính kháng thuốc isoniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam

MỤC LỤC
MƠ ̉ ĐÂ ̀ U:. 1
CHưƠNG 1: TÔ ̉ NG QUAN TA ̀ I LIÊ ̣ U . 3
1.1. Tình hình bệnh lao . 3
1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới . 3
1.1.2. Tình hi ̀ nh bê ̣ nh lao ơ ̉ Viê ̣ t Nam . 5
1.1.3. Tình hình lao kháng thuốc . 8
1.2. Vi khuâ ̉ n lao . 10
1.2.1. Đặc điểm phân loại . 10
1.2.2. Đặc điểm hình thể . 10
1.2.3. Khả năng gây bệnh . 10
1.2.4. Hê ̣ gen cu ̉ a vi khuâ ̉ n lao . 11
1.3. Gen KatG va ̀ ti ́ nh kha ́ ng thuô ́ c isoniazid ơ ̉ vi khuâ ̉ n lao . 12
1.4. Châ ̉ n đoa ́ n vi khuâ ̉ n lao kha ́ ng Isoniazid . 12
CHưƠNG 2: ĐỐI TưỢNG , VÂ ̣ T LIÊ ̣ U VA ̀ PHưƠNG PHA ́ P
NGHIÊN Cư ́ U . 14
2.1. Đối tượng nghiên cứu . 14
2.2. Vâ ̣ t liê ̣ u thiê ́ t bi ̣ va ̀ du ̣ ng cu ̣ nghiên cư ́ u . 15
2.2.1. Các sinh phâ ̉ m ho ́ a châ ́ t chi ́ nh . 15
2.2.2. Các máy và thiết bị chính . 16
2.2.3. Các mồi dùng trong nghiên cứu . 16
2.3. Phương pha ́ p nghiên cư ́ u . 17
2.3.1. Thiê ́ t kê ́ nghiên cư ́ u . 17
2.3.2.1. Kỹ thuật nhân bản đoạn gen katG sử dụng mồi đặc hiệu . 18
2.3.2.3. Phương pha ́ p đo ̣ c tri ̀ nh tư ̣ DNA theo Sanger trên ma ́ y
đo ̣ c tri ̀ nh tư ̣ tư ̣ đô ̣ ng phân ti ́ ch kê ́ t qua ̉ bă ̀ ng ca ́ c phâ ̀ n mê ̀ m chuyên du ̣ ng . 24
CHưƠNG 3: KÊ ́ T QUA ̉ NGHIÊN Cư ́ U VA ̀ THA ̉ O LUÂ ̣ N . 25
3.1. Kê ́ t qua ̉ nhân bản gen katG các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu . 25
3.2. Kê ́ t qua ̉ biê ́ n na ̣ p vector ta ́ i tô ̉ hơ ̣ p va ̀ o tê ́ ba ̀ o kha ̉ biê ́ n E . coli
DH5α . 26
3.3. Kê ́ t qua ̉ ta ́ ch do ̀ ng gen katG . 28
KÊ ́ T LUÂ ̣ N VA ̀ KIÊ ́ N NGHI ̣ . 42
1. Kê ́ t luâ ̣ n . 42
1.1. Nhân ba ̉ n tha ̀ nh công gen katG tư ̀ ca ́ c chu ̉ ng vi khuâ ̉ n lao . 42
1.2. Đột biến trên gene katG liên quan đến tính kháng Isoniazid ở
vi khuâ ̉ n lao . 42
2. Kiê ́ n nghi ̣ . 42

Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí

Tóm tắt nội dung tài liệu:

Sigma (Mỹ)
Sigma (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Applied BioSciences (Mỹ)
Applied BioSciences (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
16
2.2.2. Các máy và thiết bị chính
Bảng 2.3: Các máy và thiết bị chính
Tên máy, thiết bị Hãng sản xuất
Tủ ấm ổn nhiệt
Máy PCR (GenAmp PCR System 9700)
Máy PCR (Thermo cycle)
Máy ly tâm (Biofuge Primo R)
Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320)
Máy chụp ảnh Gel-Doc
Tủ lạnh -200C, -800C
Lò vi sóng
Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire
Bể ổn nhiệt
Máy lắc Gyromax 737R
Máy quang phổ tử ngoại khả biến Nano Drop
Máy phân tích trình tự DNA ABI 3100-
Avant
Sanyo (Nhật Bản)
Applied BioSciences (Mỹ)
Bio-rad (Pháp)
Heraeus (Mỹ)
Thommas Scientific (Mỹ)
Dolphin (Mỹ)
Nuaire (Mỹ)
Sanyo (Nhật Bản)
Nuaire (Mỹ)
Memmert (Đức)
Amerex Instrument (Đức)
Analitika (Đức)
Applied BioSciences (Mỹ)
2.2.3. Các mồi dùng trong nghiên cứu
Các mồi đặc hiệu cho phát hiện trực khuẩn lao và lao kháng thuốc được
sử dụng cho phản ứng PCR n hân các đoạn gen đích có trình tự tương ứng là :
- Cặp mồi dùng cho nhân trình tự gen katG:
KatG F: 5'-GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG-3'
KatG R: 5'-ACA AGC TGA TCC ACC GAG AC-3'
- Cặp mồi dùng cho giải trình tự gen katG:
M13 F: 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'
M13 R: 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'
Các trình tự này được gửi tổng hợp ở công ty Invitrogen , Hồng Kông .
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u
2.3.1. Thiết kế nghiên cƣ́u
Tiến hành nghiên cứu theo phương pháp :
- Dịch tễ học mô tả , điều tra cắt ngang, có đối chứng.
- Thực nghiệm labo có đối chứng .
Sơ đồ nghiên cƣ́u
DNA (Tách từ vi khuẩn
lao đã đƣợc xác định tính
kháng thuốc)
Nhân bản đoạn gen katG
sƣ̉ dụng mồi đặc hiệu
Sản phẩm gen KatG
Tách dòng gen KatG
Sản phẩm vector có đoạn
gen KatG
Giải trình tự gen KatG
Xác định đột biến liên
quan đến tính kháng INH
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18
2.3.2. Các kỹ thuật cụ thể
2.3.2.1. Kỹ thuật nhân bản đoạn gen katG sử dụng mồi đặc hiệu
Sơ đồ qui trình nhân bản đoạn gen KatG
Cụ thể:
1. Sau khi đo nồng độ DNA khuô n, tính và tạo các nồng độ DNA của
các mẫu như nha u để khi đưa vào hỗn hợp sản phẩm cùng một thể tích DNA
khuôn, và đạt khoảng 100 ng/thể tích 25µl phản ứng .
2. Tính các giá trị của các thành phần khác .
Đo nồng độ DNA của mẫu
nghiên cƣ́u
Tính toán giá trị các thành
phần phản ứng PCR
Tạo hỗn hợp phản ứng
Nhân gen theo chu trình
nhiệt đã đƣợc tối ƣu hóa
Điện di kiểm tra vạch đặc
hiệu
Sƣ̉ dụng sản phẩm PCR làm
DNA chèn vào plasmid
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19
Bảng 2.4: Tính toán các thành phần cho phản ứng PCR
Thành phần phản ứng PCR Thể tích (µl) Nồng độ
Nước 10,25
MgCl2 (25 mM) 2,5 2 mM
PCR bufer (10X) 2,5 1 X
dNTP mix (5mM) 2,5 0,2 mM
Mồi KatG F 1 0,5 µM
Mồi KatG R 1 0,5 µM
Taq Polymerase 0,25 1 unit
DNA khuôn 5
Tổng 25
Các thành phần này ở phản ứng của các mẫu bệnh phẩm đều giống
nhau. Có đối chứng âm khi tiến hành phản ứng .
3. Chu trình nhiệt như sau :
4. Điện di sản phẩm PCR trên a garose 1,5%, nhuộm Ethidium bromide
và đọc kết quả trên máy Gel - Doc.
95
0
C
5 phút
95
0
C
1 phút
56
0
C
45 giây
72
0
C
1 phút
72
0
C
4 phút
4
0
C
60 phút
35 chu kỳ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
20
2.3.2.2. Kỹ thuật tách dòng (cloning), tạo sản phẩm phục vụ giải trình tự gen
katG
Sơ đồ qui trình tách dòng
Sau khi nhân bản thành công đoạn gen katG, chúng tui tiến hành làm
sạch (thôi gel) bằng bộ kit QIAquick Gel Extraction . Trong quá trình thao tác
trên đèn tím rất có thể bị đứt gẫy các nucleotide sẽ gây ảnh hưởng k hông tốt
tới sản phẩm kết nối , vì vậy trước k hi thực hiện phản ứng kết nối chúng tui
tiến hành thực hiện phản ứng nối đầu A . Thành phần phản ứng được trình
bày ở bảng 2.5.
Tinh sạch và gắn đoạn gen vào vector tách
dòng pBT tạo vector tái tổ hợp
Đƣa vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Nuôi cấy tế bào có vector
Lƣ̣a chọn tế bào mang vector tái tổ hợp theo
nguyên tắc chọn lọc khuẩn lạc xanh trắng
Kiểm tra và tách plasmid
Thu plasmid, kiểm tra đoạn gen
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
21
Bảng 2.5: Tính toán các thành phần cho phản ứng nối đầu A
Thành phần phản ứng PCR Thể tích (µl) Nồng độ
Nước 5,25
MgCl2 (25 mM) 2,5 2 mM
PCR bufer (10X) 2,5 1 X
dNTP mix (5mM) 2,5 0,2 mM
Taq Polymerase 0,25 1 unit
DNA khuôn 7
Tổng 20
Sản phẩm được tiến hành trên máy PCR ở 720C trong 10 phút.
Sau đó tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR theo qui trình của nhà sản xuất.
Qui trình :
- Thêm 100 µl building buffer và o các Eppendorf chứa mẫu vừa được
nối đầu A. Vortex nhẹ.
- Hút hết sản phẩm trên sang các Eppendorf có bổ sung cột lọc.
- Ly tâm 13000 vòng/phút/40C. Đổ dịch lỏng, thu cặn bám trên cột lọc.
- Thêm 500 µl Washing buffer vào Eppendorf. Ly tâm 13000
vòng/phút/40C. Đổ dịch, thu cặn bám trên cột lọc.
- Lặp lại bước trên.
- Làm khô bằng cách ly tâm thêm 1 lần nữa.
- Thêm 15 µl nước deion vào . Đợi trong vòng 1 phút.
- Thu dịch, loại bỏ cột lọc.
Sau đó thực hiện các bước sau:
1. Tạo sản phẩm kết nối
Kết nối đoạn gen katG cần nghiên cứ u với vector pBT theo qui trình
của nhà sản xuất .
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22
Qui trình :
- 2X Papid Ligation Buffer 1 µl
- T4 DNA Ligase 1 µl
- pBT Vector 1
- PCR product 5 µl
- Nước cất khử ion vừa đủ 10 µl.
Sau đó sản phẩm được tiến hành trên máy PCR ở 220C trong vòng 60 phút.
2. Biến nạp và nuôi cấy tế bào có vector tái tổ hợp
Biến nạp sản phẩm kết nối trên vào tế bào khả biến E.coli DH5α theo
phương pháp sốc nhiệt [15]. Nuôi cấy tế bào và kiểm tra sự có mặt của vector
tái tổ hợp trong tế bào theo qui trình sau :
- Lấy tế bào khả biến ra khỏi tủ âm , để trong nước đá (40C) trong vòng
10-15 phút.
- Hút 5 µl sản phẩm kết nối cho vào các ống tế bào khả biến (có đảo nhẹ).
- Để ống tế bào khả biến trong nước đá (40C) 30 phút, sốc nhiệt ở 420C
trong vòng 90 giây.
- Tiếp tục giữ ở 40C trong vòng 1-2 phút.
- Thêm 100 µl LB lỏng vào các ống tế bào khả biến trên (có đảo nhẹ ),
cho ngay các ống tế bào khả b iến này vào tủ nuôi cấy lắc , để ở 370C và 220
vòng/phút trong 1 giờ.
- Hút 150 µl dịch khuẩn đã nuôi lắc cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có
carbenicillin, X-gal, IPTG.
- Giữ sản phẩm ở tủ ổn nhiệt 370C qua đêm (18-24 giờ).
- Khi trên bề mặt đĩa thạch xuất hiện các tế ba

Yêu cầu Download

Tài liệu, ebook tham khảo khác

Xác định các đột biến trên gen KATG liên quan đến tính kháng thuốc isoniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam - pdf 15

Tóm tắt nội dung tài liệu:

Tài liệu, ebook tham khảo khác

Học thêm