Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối
Trang
LỜI CẢM ƠN . i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . ii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU . iii
DANH MỤC CÁC HÌNH .iv
DANH MỤC CÁCĐỒ THỊ .v
LỜI MỞ ĐẦU. vi
Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .1
I.1. Sơ lược về chitin và chitinase . 1
I.1.1. Chitin . 1
I.1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14). 5
I.1.2.1. Phân loại chitinase. 6
I.1.2.2. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase. 9
I.1.2.3. Các đặc tính cơ bản của enzymechitinase . 12
I.1.2.4. Các loại cơ chất của enzyme chitinase . 15
I.1.2.5. Cơ chế tác động của các loại enzyme chitinase . 16
I.1.2.6. Ứng dụng của chitinase . 17
I.2. Cây cao su Hevea brasiliensisvà chitinase trong mủ cao su. 20
I.2.1. Câycao su . 20
I.2.2. Mủ cao su . 24
I.2.3. Hevamin . 32
Phần II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. 37
II.1. Vậtliệu. 37
II.2. Phương pháp . 37
II.2.1. Phương pháp ly tâm mủ thu nhận lutoid . 37
II.2.2. Kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ . 38
II.2.3. Kết tủa protein bằng muối trung tính .38
II.2.4. Thẩm tích . 39
II.2.5. Xác định hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry . 40
II.2.6. Xác định hoạt độ chitinase theo phương pháp định lượng đường khử với thuốc thử DNS.
. 42
II.2.7. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel Sephadex . 45
II.2.8. SDS-PAGE . 46
II.2.9. Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính chitinase . 50
II.2.10. Xác định pH tối ưucho hoạt tính chitinase . 50
II.2.11. Xác định nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt tính chitinase . 51
II.2.12. Ảnh hưởng của ion kim loại . 51
Phần III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. 52
III.1. Quy trình tách chiết, thu nhận chitinase thô từ mủ cao su. 52
III.1.1. Quy trình ly tâm tách mủ, thu hồi lutoid và phá vỡ lutoid để giải phóng chitinase. . 52
III.1.2. Quy trình tủa để thu nhận chitinase thô . 52
III.1.2.1. Tủa bằng cồn để thu nhận chitinase thô. 52
III.1.2.2. Tủa bằng acetone để thu nhận chitinase thô . 54
III.1.2.3.Tủa bằng muối ammonium sulfate để thu nhận chitinase thô. 55
III.2. Quy trình tinh sạch chitinase bằng phương pháp lọcgel Sephadex . 58
III.2.1. Hàm lượng protein và hoạt tính chitinase trước lọc gel . 58
III.2.2. Kết quả đo OD 280nmcác phân đoạn lọc gel ở 3 giống cao su. 59
III.2.3. Hàm lượng protein và hoạt tính chitinase sau lọc gel. 61
III.2.4. Hiệu suất hàmlượng protein và hoạt tính chitinase thu được qua lọc gel. 63
III.2.5. Hiệu suất thu hồichitinase từ mủ cao su.63
III.2.6. Kết quả điện di SDS-PAGE các giống cao suqua lọcgel. 64
III.3. Xác định các tính chất củachitinase . 67
III.3.1. Ảnh hưởng của nhiệtđộ . 67
III.3.2. Ảnh hưởng của pH . 69
III.3.3. ?nh hu?ng c?a nồng độ cơchất . 71
III.3.4. Anh hưởng của các ion kim loại. 73
III.3.5. Quy trình thu nhận enzyme chitinase từ mủ cao su . 76
Phần IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 78
IV.1. Kếtluận . 78
IV.2. Đề nghị . 78
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 80
PHỤ LỤC . 84
và tảo, 4,7-9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá, 3,5-8,8 ở vi sinh vật.
Hệ số hấp thu E280mg/ml=1,24; phổ hấp thu chỉ là bước sóng đơn 280μm.
Hằng số Michaelis: 0,010-0,011 (g/100ml).
• Aûnh hưởng của nhiệt độ
Nhìn chung, nhiệt độ tối ưu cho enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động
là 40oC, ngoại trừ Aspergillus niger tổng hợp enzyme chitinase hoạt động trên cơ
chất là glycol chitin có nhiệt độ tối thích là 50oC. Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc
thu nhận mà enzyme chitinase có thể có những nhiệt độ tối ưu khác nhau. Thí
dụ, nhiệt độ tối ưu của chitinase từ khoai tây ngọt là 25oC [12]. Ở các enzyme từ
củ từ Diosscorea opposita THUNB nhiệt độ tối ưu là 45-70oC [5].
Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III và các chitinase từ Bacillus
licheniformis phân lập trong suối nước nóng cho thấy có khả năng chịu đựng
nhiệt độ cao đến 80oC. Mặt khác, chitinase từ côn trùng (tằm…) không ổn định ở
Nguyễn Quang Nhân
- 13 - Phần I: Tổng quan tài liệu
nhiệt độ 40oC vì côn trùng phát triển ở nhiệt độ 25oC. Do đó, nhiệt độ tối ưu của
enzyme chitinase côn trùng không cao.
• Aûnh hưởng của pH
Giá trị tối ưu của enzyme chitinase từ 4-9 đối với các chitinase ở thực vật
bậc cao và tảo, enzyme chitinase ở động vật có vú là 4,8-7,5 và ở vi sinh vật là
3,5-8,0.
Theo các nhà khoa học, pH tối thích của enzyme chitinase có thể có sự
phụ thuộc vào cơ chất được sử dụng. Đa số các enzyme chitinase đã được nghiên
cứu có pH tối thích khoảng 5,0 khi cơ chất là chitin, enzyme chitinase của
Streptomyces grieus có pH tối thích khoảng 6,3, giá trị này ở khoai tây ngọt
Ipomoea batatas là 5,0 [12]. Ở các enzyme từ củ từ Diosscorea opposita THUNB
pH tối ưu là 3,5-4,0 [5]. Tùy mục đích phân tích, những cơ chất hòa tan như
glycol chitin và N-acetyl-chitooligosaccharide được sử dụng thay thế cho chitin.
pH tối ưu của enzyme chitinase khi cơ chất là glycol chitin thuộc khoảng pH
kiềm yếu. Hoạt tính enzyme chitinase sẽ nhanh chóng bị ức chế ở pH<4,5, ngoại
trừ chitinase trong dạ dày của động vật có xương sống vẫn hoạt động ở pH 3,0.
• Chất tăng hoạt – chất ức chế
- Allosamidin
Allosamidin là một pseudotrisaccharide gồm 2 đơn vị N-acetylallosamin
gắn với nhau nhờ liên kết β-1,4 và một nhóm allosamizoline. Nhóm
allosamizoline tương tự như chất trung gian phản ứng oxocarbonium, cấu tạo bao
gồm 1 cyclopentane và một vòng aminooxazoline. Về cấu tạo, allose chỉ khác
glucose ở C3 trong đó nhóm hydroxyl nằm thẳng trong allose và nằm ngang
trong glucose.
Allosamidin là chất ức chế chitinase đầu tiên được phân lập từ khuẩn ty
của Streptomyces sp. No.1713. Allosamidin và những dẫn xuất của nó ức chế
Nguyễn Quang Nhân
- 14 - Phần I: Tổng quan tài liệu
enzyme chitinase được tổng hợp từ tằm, tôm he và một số vi sinh vật (Piromyces
communis, Streptomyces sp và Streptomyces olivaceoviridis). Ngoài ra,
allosamidin cũng được phát hiện có khả năng gắn kết với các enzyme chitinase
thực vật như hevamine và ức chế các enzyme chitinase thực vật (đa số thuộc họ
Glycohydrolase 18). Điển hình nó ức chế chitinase H ở cây củ cải với ID 50 (liều
lượng 50% chất ức chế là 44,7μM). Nói chung, allosamidin ức chế mạnh
chitinase họ 18 và không ức chế protein lòng trắng trứng gà hay lysozyme người.
Về cơ chế ức chế, allosamidine ức chế chitinase theo cơ chế cạnh tranh
nhóm allosamizoline gắn vào tâm của trung tâm hoạt động chitinase, giả làm
chất trung gian phản ứng oxocarbonium nằm giữa C1 của N-acetyl-D-glucosamin
và oxy carbonyl của nhóm N-acetyl ở C2 trong quá trình thủy giải. Trong đó điện
tích dương ở C1 được ổn định bằng oxy carbonyl của nhóm N-acetyl ở C2.
Allosamidin khá đắt và khó tổng hợp. Mặc dù các oligomer carbohydrate
và những dẫn xuất của chúng có thể dùng để thiết kế chất ức chế glycoside
hydrolase, chúng thường khó tổng hợp và quá lớn để đi qua màng tế bào.
- Các ion kim loại
Các ion kim loại Hg2+, Ag+ là những chất ức chế. Đối với ion Cu+, có 2
dạng enzyme chitinase: một bị ức chế và một được tăng cường nhờ Cu2+ được
tìm thấy ở một số loài cá và vi sinh vật như Pseudomonas aeruginosa.
- Các chất khác
Dipeptide CI-4 [cyclo-(L-Arg-D-Pro)] là một sản phẩm tự nhiên được
tổng hợp từ vi khuẩn nước mặn Pseudomonas IZ208. CI-4 ức chế việc phân tách
tế bào Saccharomyce cerevisiae và ngăn cản sự tạo khuẩn ty của nấm bệnh
Candida albicans ở người. Về cơ chế, CI-4 ức chế chitinase họ 18 vì chúng có
cấu trúc giống chất trung gian phản ứng. Các chất ức chế chitinase họ 18 có ảnh
Nguyễn Quang Nhân
- 15 - Phần I: Tổng quan tài liệu
hưởng đến chu trình sống của nhiều loại nấm và ngăn cản sự truyền kí sinh trùng
sốt rét (Plasmodium falciparum) từ vật chủ đến côn trùng.
2 peptide ức chế glycoside hydrolase khác là argifin và argadin có thể ức
chế chitinase ở nồng độ nano hay micro mole. Các peptide này gắn trực tiếp lên
các gốc ở tâm hoạt động của enzyme và chiếm các vị trí -1, +1 và +2. mặc dù
những chất ức chế này là peptide nhưng chúng có nhiều nhánh bên bất thường
như acetyl hay vòng thơm.
Ngược lại, huyết thanh albumin có vai trò làm tăng hoạt động của enzyme
chitinase nhưng sự ảnh hưởng này chỉ rõ ràng sau 2-3 giờ đầu của phản ứng.
• Sự ổn định
Enzyme chitinase thô hay tinh sạch ổn định trong trạng thái đông lạnh
khoảng 2 năm. Sự ổn định của enzyme chitinase sẽ cao hơn khi có mặt của cơ
chất là chitin. Chúng bị khử hoạt tính nhanh chóng ở 37oC trong trường hợp
không có mặt chitin. Chu kỳ bán hủy ở 37oC là 40 ngày và ở 5oC là 230 ngày.
Enzyme chitinase bất hoạt bởi oxygen, hằng số bất hoạt ở 20oC là k=0,145/h.
I.1.2.4. Các loại cơ chất của enzyme chitinase
• Chitin
Cơ chất chủ yếu của enzyme chitinase là chitin. Ở lớp vỏ côn trùng và
giáp xác, chitin được gắn kết với protein. Trong một vài trường hợp, lớp biểu bì
này được làm cứng bởi các liên kết chéo với polysaccharide khác (cellulose,
mannan, glucan…). Ngoài ra, chitin cũng có cấu trúc liên hệ với murein, cấu trúc
polymer hiện diện ở vách tế bào vi khuẩn.
Nguyễn Quang Nhân
- 16 - Phần I: Tổng quan tài liệu
• Các dẫn xuất của chitin
Enzyme chitinase có thể tác động lên một số dẫn xuất của chitin như
glycol-chitin, carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfate, 4-methylumbellferyl-
tri N-acetylchitotrioside (MUC-phát huỳnh quang).
Enzyme chitinase không hoạt động trên các cơ chất: chitin nitrat,
cellulose, hyaluronic acid, alginic acid hay mucin.
I.1.2.5. Cơ chế tác động của các loại enzyme chitinase
Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và
chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng
phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do
hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa. Hầu hết chitinase
thuộc loại này.
/file/d/0B2jvQ3 ... N3M1k/view
