Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối
Nghiên cứu xây dựng công thức viên nang chứa cao Diếp cá
.i Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt........................................................................v Danh mục các bảng..................................................................................................vi Danh mục các hình ảnh...........................................................................................vii Danh mục các sơ đồ...............................................................................................viii ĐẶT VẤN ĐỀ...........................................................................................................1 Chương 1 – TỔNG QUAN........................................................................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY DIẾP CÁ.................................................................3 1.1.1. Đặc điểm thực vật....................................................................................3 1.1.2. Phân bố sinh thái.....................................................................................3 1.1.3. Thành phần hóa học.................................................................................4 1.1.3.1. Flavonoid........................................................................................4 1.1.3.2. Tinh dầu..........................................................................................4 1.1.3.3. Alkaloid..........................................................................................5 1.1.3.4. Các thành phần khác.......................................................................5 1.1.4. Tác dụng dược lý.....................................................................................5 1.1.5. Công dụng...............................................................................................6 1.2. CÔNG NGHỆ BÀO CHẾ VIÊN NANG CỨNG...........................................7 1.2.1. Khái quát về thuốc viên nang..................................................................7 1.2.1.1. Định nghĩa.......................................................................................7 1.2.1.2. Ưu điểm của viên nang cứng...........................................................7 1.2.2. Thành phần viên nang..............................................................................7 1.2.2.1. Vỏ nang...........................................................................................7 1.2.2.2. Thành phần dược chất trong viên nang...........................................8 1.2.3. Quy trình bào chế thuốc viên nang cứng từ dược liệu.............................9 1.3. SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO......10 1.3.1. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký..........................................11 1.3.1.1. Hệ số dung lượng..........................................................................11 ii 1.3.1.2. Hệ số chọn lọc...............................................................................11 1.3.1.3. Hệ số bất đối xứng........................................................................11 1.3.1.4. Độ phân giải..................................................................................11 1.3.1.5. Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột.....................................................12 1.3.2. Một số ứng dụng của phương pháp HPLC............................................12 1.3.2.1. Phân tích định tính........................................................................12 1.3.2.2. Phân tích định lượng.....................................................................12 1.4. GIỚI THIỆU MỘT SỐ CHẾ PHẨM CHỨA CAO DIẾP CÁ......................13 1.4.1. An trĩ vương.........................................................................................13 1.4.2. Helaf......................................................................................................13 1.4.3. Cenditan...............................................................................................14 Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................15 2.1. NGUYÊN LIỆU, CHẤT CHUẨN, HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ. .15 2.1.1. Nguyên liệu và chất chuẩn.....................................................................15 2.1.2. Hóa chất.................................................................................................15 2.1.3. Trang thiết bị.........................................................................................16 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................16 2.2.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng quercetin bằng phương pháp HPLC......................................................................................................16 2.2.1.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký tối ưu.............................................16 2.2.1.2. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu cao Diếp cá và viên nang chứa cao Diếp cá................................................................................................17 2.1.1.3. Thẩm định quy trình định lượng....................................................20 2.2.2. Xây dựng công thức viên nang chứa cao Diếp cá..................................21 2.2.2.1. Thiết kế công thức viên nang chứa cao Diếp cá............................21 2.2.2.2. Phương pháp khảo sát đặc tính của khối bột thuốc và đo độ rã của viên nang...................................................................................................23 2.2.2.3. Quy trình điều chế viên nang chứa cao Diếp cá............................24 2.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho viên nang chứa cao Diếp cá.....24 iii 2.2.3.1. Hình thức cảm quan......................................................................24 2.2.3.2. Độ đồng đều khối lượng................................................................24 2.2.3.3. Độ tan rã........................................................................................24 2.2.3.4. Độ ẩm............................................................................................24 2.2.3.5. Định tính.......................................................................................24 2.2.3.6. Định lượng....................................................................................25 Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...................................................................27 3.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG QUERCETIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC..................................................27 3.1.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký tối ưu......................................................27 3.1.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu cao Diếp cá và viên nang chứa cao Diếp cá............................................................................................................28 3.1.3. Thẩm định quy trình định lượng quercetin............................................30 3.1.3.1. Xác định tính tương thích hệ thống...............................................30 3.1.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích................................................31 3.2. THIẾT KẾ CÔNG THỨC VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ...............35 3.2.1. Lựa chọn hàm lượng cao.......................................................................35 3.2.2. Lựa chọn hàm lượng tá dược hút...........................................................35 3.2.3. Lựa chọn công thức tối ưu cho viên nang chứa cao Diếp cá..................36 3.2.3.1. Độ ẩm............................................................................................37 3.2.3.2. Góc chảy.......................................................................................37 3.2.3.3. Tỷ trọng biểu kiến.........................................................................37 3.2.3.4. Phân bố cỡ hạt...............................................................................38 3.2.3.5. Độ tan rã........................................................................................39 3.3. KIỂM NGHIỆM VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ..............................40 3.3.1. Hình thức cảm quan...............................................................................40 3.3.2. Đồng đều khối lượng.............................................................................40 3.3.3. Độ tan rã................................................................................................41 3.3.4. Độ ẩm....................................................................................................41 iv 3.3.5. Định tính................................................................................................41 3.3.5.1. Bằng phản ứng hóa học.................................................................41 3.3.5.2. Bằng SKLM..................................................................................41 3.3.6. Định lượng.............................................................................................42 3.4. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN VIÊN NANG CHỨA CAO DIẾP CÁ...........42 3.4.1. Tiêu chuẩn kỹ thuật...............................................................................42 3.4.2. Kết quả kiểm nghiệm.............................................................................46 Chương 4 - BÀN LUẬN.........................................................................................47 4.1. Về xây dựng và thẩm định quy trình định lượng quercetin trong cao Diếp cá và viên nang chứa cao Diếp cá............................................................................47 4.2. Về nghiên cứu xây dựng công thức cho viên nang chứa cao Diếp cá...........47 4.3. Về xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho viên nang chứa cao Diếp cá.......48 Chươg 5 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................49 5.1. Kết luận........................................................................................................49 5.2. Kiến nghị......................................................................................................49 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................51 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AOAC CHCl3 CH3CN DĐVN dtvđ dsvđ HPLC Hiệp hội các nhà hoá học phân tích quốc tế (Association of Official Analytical Chemists) Chloroform Acetonitril Dược điển Việt Nam Tỷ trọng trước va đập Tỷ trọng sau va đập Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) MeOH RSD SD SKLM STT TB tR TT UV Vtvđ Vsvđ Methanol Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) Sắc ký lớp mỏng Số thứ tự Trung bình Thời gian lưu Thuốc thử Tử ngoại (Ultra Violet) Thể tích trước va đập Thể tích sau va đập DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Các hóa chất, tá dược sử dụng trong nghiên cứu.....................................15 Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu.........................................................16 Bảng 2.3. Phương pháp pha các dung dịch có nồng độ thấp hơn............................17 vi Bảng 2.4. Các công thức thiết kế tối ưu công thức viên nang.................................22 Bảng 2.5. Định tính viên nang chứa cao Diếp cá bằng phản ứng hóa học...............25 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên 6 lần tiêm mẫu chuẩn...30 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên 6 lần tiêm mẫu thử.......30 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tính tuyến tính phương pháp định lượng bằng HPLC. .33 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ chính xác phương pháp định lượng bằng HPLC.....34 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng bằng HPLC......34 Bảng 3.6. Các công thức thiết kế để xác định hàm lượng cao thích hợp.................35 Bảng 3.7. Độ ẩm các công thức C1, C2, C3, C4.....................................................35 Bảng 3.8. Các công thức thiết kế để xác định hàm lượng tá dược hút.....................35 Bảng 3.9. Độ ẩm các công thức H1, H2, H3, H4....................................................36 Bảng 3.10. Các công thức thiết kế tối ưu hóa công thức viên nang.........................36 Bảng 3.11. Độ ẩm các công thức khảo sát (T1 – T10)............................................37 Bảng 3.12. Góc chảy các công thức khảo sát (T1 – T10)........................................37 Bảng 3.13. Tỷ trọng biểu kiến của các công thức khảo sát (T1 – T10)...................37 Bảng 3.14. Phân bố cỡ hạt của các công thức khảo sát (T1 – T10).........................38 Bảng 3.15. Độ rã các công thức khảo sát (T1 – T10)..............................................39 Bảng 3.16. Kết quả kiểm nghiệm độ đồng đều về khối lượng.................................40 Bảng 3.17. Kết quả đo độ rã....................................................................................41 Bảng 3.18. Kết quả đo độ ẩm..................................................................................41 Bảng 3.19. Kết quả định tính viên nang chứa cao Diếp cá......................................41 Bảng 3.20. Kết quả kiểm nghiệm viên nang Diếp cá..............................................46 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1. Cây Diếp cá...............................................................................................3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của quercitrin và isoquercitrin.....................................4 vii Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo chung của một hệ thống HPLC.........................................10 Hình 1.4. Cách xác định thời gian chết (t0) và thời gian lưu (tR).............................11 Hình 1.5. Cách xác định số đĩa lý thuyết.................................................................12 Hình 1.6. Chế phẩm An Trĩ Vương.........................................................................13 Hình 1.7. Chế phẩm Helaf......................................................................................13 Hình 1.8. Chế phẩm Cenditan.................................................................................14 Hình 2.1. Phương pháp xác định góc nghỉ của bột, hạt thuốc.................................24 Hình 3.1. Sắc ký đồ 3D mẫu thử ở bước sóng từ 250nm – 450nm..........................27 Hình 3.2. Sắc ký đồ contour mẫu thử......................................................................27 Hình 3.3. Sắc ký đồ các dịch thủy phân quercetin sau 1h, 2h và 3h........................28 Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu thử trước và sau khi loại tạp bằng SPE tự chế.................29 Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu chuẩn...............................................................................31 Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu thử...................................................................................31 Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu trắng.................................................................................31 Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu dung môi.........................................................................32 Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu dung dịch nước acid phosphoric 0,2%............................32 Hình 3.10. Kết quả chồng phổ mẫu chuẩn, mẫu dung môi, mẫu tá dược và mẫu dung dịch nước acid phosphoric 0,2%.....................................................................32 Hình 3.11. Biểu đồ tính tuyến tính của phương pháp định lượng bằng HPLC........33 Hình 3.12. Biểu đồ phân bố cỡ hạt của các công thức từ T1 đến T5.......................38 Hình 3.13. Biểu đồ phân bố cỡ hạt của các công thức từ T6 đến T10.....................39 Hình 3.14. Kết quả định tính bằng SKLM viên nang chứa cao Diếp cá..................41 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1. Tóm tắt quy trình sản xuất viên nang cứng..............................................9 Sơ đồ 2.1. Tóm tắt quy trình xử lý mẫu thử.............................................................19 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Quay về với thiên nhiên là xu hướng của thế kỷ XXI. Trong lĩnh vực Dược, các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Trước đây, người ta thường hiểu chỉ có một số nước phương Đông như Trung Quốc, Việt Nam, …mới có nhiều sản phẩm từ thiên nhiên. Thực tế, theo Tổ Chức Y Tế Thế Giới (WHO) hiện có tới 60% dân số sử dụng các sản phẩm này từ các nước châu Á như Ấn Độ, Thái Lan đến các nước Châu Phi và Mỹ La Tinh. Trong đó có nhiều nhóm, loại thuốc chiếm tỷ trọng cao: chẳng hạn chiết xuất thực vật chữa phì đại tiền liệt tuyến lành tính có tới 100 biệt dược, chiếm tới 25 – 36% (Pháp, Đức) 3,5 – 10,5% (Italia, Tây Ban Nha) so với tổng số dược phẩm chữa bệnh này. [32] Việt Nam là nước nhiệt đới gió mùa, động thực vật phong phú là tiền đề tốt để phát triển các sản phẩm từ dược liệu. Nguồn dược liệu dồi dào là nền tảng cho việc hình thành các cơ sở sản xuất thuốc từ dược liệu. Theo thống kê của Bộ Y tế, cả nước hiện có hơn 300 cơ sở sản xuất thuốc từ dược liệu trong nước, trong đó có 10 cơ sở đông dược đạt chuẩn thực hành tốt sản xuất thuốc của WHO. Nhiều công ty dược cũng có thương hiệu riêng từ thế mạnh của cây dược liệu. [31] Trong các loại dược liệu phổ biến, Diếp cá là loại rau ăn quen thuộc hằng ngày được nhân dân ta sử dụng làm thuốc với nhiều tác dụng: trị táo bón, trĩ, mụn nhọt, lở ngứa,….Tuy nhiên có một số bất tiện trong việc sử dụng dược liệu này như khó ăn và không thể ăn với lượng lớn. Mặt khác, việc sử dụng dược liệu như thực phẩm hay các sản phẩm không được chuẩn hóa và kiểm soát chặt chẽ sẽ ảnh hưởng lớn đến tính an toàn và hiệu quả trị liệu. Vì vậy, đề tài nghiên cứu xây dựng công thức viên nang chứa cao Diếp cá được thực hiện với những mục tiêu cụ thể như sau: 1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng quercetin trong cao Diếp cá và viên nang chứa cao Diếp cá. 2. Xây dựng công thức viên nang chứa cao Diếp cá. 3. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho viên nang bào chế được. 2 Ý nghĩa của đề tài: 1. Góp phần nghiên cứu và cung cấp cơ sở lý luận bào chế các chế phẩm từ cao dược liệu. 2. Là cơ sở cho các nghiên cứu sau này trên quy mô pilot và công nghiệp. 3 Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY DIẾP CÁ: Tên khác: Lá giấp, rau giấp cá, tạp thái, ngư tinh thảo, rau vẹn. Tên khoa học: Houttuynia cordata Thunb. Họ lá giấp: Saururaceae. 1.1.1. Đặc điểm thực vật: [6], [13], [16] Cây thảo, sống lâu năm, cao 20 – 40cm, thân ngầm mọc bò ngang trong đất, màu trắng, hơi có lông, bén rễ ở các mấu. Thân đứng nhẵn, màu lục hay tím đỏ. Lá mọc so le, hình tim, đầu nhọn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới màu tím, hơi có lông mọc theo gân lá của cả hai mặt, gân chính 7; cuốn lá dài, có bẹ, lá kèm có lông ở mép. Cụm hoa mọc ở ngọn thân thành bông dài 2 – 2,5cm, mang nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt; tổng bao gồm 4 lá bắc màu trắng nom như một chiếc hoa riêng lẻ; hoa không có bao hoa; nhị 3. Quả nang mở ở đỉnh; hạt hình trái xoan nhẵn. Toàn thân vò ra có mùi tanh như mùi cá. Mùa hoa quả: tháng 5 – 7. 1.1.2. Phân bố sinh thái: [13], [16] Diếp cá phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, từ Nhật Bản, Trung Quốc đến Việt Nam, Lào, Ấn Độ và các nước Đông Nam Á khác. Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở các tỉnh miền núi, trung du và đồng bằng. Cây còn được trồng ở nhiều nơi để làm rau và làm thuốc. Diếp cá thuộc cây ưu ẩm và hơi chịu bóng, thường mọc ở đất ẩm, nhiều mùn dọc theo các bờ khe suối, mương nước trong thung lũng và ở vùng đồng bằng. Cây sinh trưởng gần như quang năm, phát triển nhất trong mùa xuân hè, có hoa quả hàng năm trên những cây không bị ngắt ngọn và hái lá thường xuyên, có khả năng tái sinh chồi mạnh từ thân rễ. Hình 1.1. Cây Diếp cá. 4 1.1.3. Thành phần hóa học: 1.1.3.1. Flavonoid: Các flavonoid đáng chú ý là: afzelin, phloretin, rutin, quercitrin (quercetin 3rhamnosid), isoquercitrin (quercetin 3-glucosid), dioxy – flavonon. [6] quercitrin isoquercitrin Hình 1.2. Công thức cấu tạo của quercitrin và isoquercitrin. Các flavonoid khác là dạng glycosid của quercetin như: [12], [18], [19], [27] - Quercetin-3-O-β-D-galactosid-7-O-beta-D-glucosid - Quercetin-3-O-β-D-galactopyranosid (hyperin) - Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosid - Quercetin-3-O-α-L-arabinofuranosid (avicularin) Trong đó quercitrin, isoquercitin và phloretin được coi là những hợp chất có tác dụng chống ung thư và tác dụng ngăn chặn gốc tự do. [18], [19] 1.1.3.2. Tinh dầu: Toàn thân Diếp cá chứa tinh dầu, đây là thành phần làm cho dược liệu có mùi đặc biệt. Thành phần chủ yếu là nhóm aldehyde và các dẫn chất ceton như methyln-nonylceton, 1-decanal, 1-dodecanal là những chất không có tác dụng kháng khuẩn, chất có tác dụng kháng khuẩn là 3-oxododecanal, đây là thành phần chính của tinh dầu nhưng không bền và dễ bị phân hủy khi chưng cất. Nhóm terpen bao gồm các chất: α-pinen, camphen, myrcen, limonen, linalol, bornyl acetat, geraniol và caryophylen. [6] Ngoài ra tinh dầu Diếp cá còn chứa acid hữu cơ: acid caprinic, laurinaldehyde, benzamid, acid hexadecanoic, acid decanoid, acid palmitic, acid linoleic, acid oleic, acid stearic,…lipid và vitamin K. [6], [30] 1.1.3.3 Alkaloid: 5 Từ Diếp cá đã phân lập được β-sitosterol [14], sáu alkaloid có hoạt tính sinh học là aristolactam B(1), piperolactam A(2), aristolactam A(3), norcepharadione B(4), cepharadione B(5) và splendidine(6) cũng được tìm thấy trong dịch chiết methanol phần trên mặt đất của cây Diếp cá. [23] 1.1.3.4.Các thành phần khác: Nước: 91,5%, protid: 2,9%, glucid: 2,7%, lipid: 0,5%, cellulose:1,8%, Calci: 0,3mg, Kali: 0,1mg, tiền vitamin A: 1,26mg, vitamin C: 68mg (trong 100g rau Diếp cá tươi). [13] Ngoài ra Diếp cá còn chứa Sắt (Fe), Magnesi (Mg), Mangan (Mn), không tìm thấy các kim loại nặng như Arsen (As), Cadimi (Cd), Chrom (Cr), hay Chì (Pb) trong mẫu phân tích. [20] 1.1.4. Tác dụng dược lý: Tác dụng kháng virus: [21] Theo Kyoko Hayashi và cộng sự Diếp cá ức chế trực tiếp virus herpes chủng 1 (HSV-1), virus cúm, virus gây suy giảm miễn dịch mắc phải ở người loại 1 (HIV-1) mà không biểu hiện độc tính, nhưng không chống lại poliovirus và coxsackie virus. Mức độ giảm virus liên quan đến thời gian xử lý bằng thuốc. Ba thành phần chính có tác dụng là: xeton methyl n-nonyl, aldehyde lauryl, và aldehyde capryl. Tác dụng chống ung thư máu: [17] Công trình nghiên cứu của Chang Jung-San và cộng sự, mục đích để đánh giá tác dụng chống ung thư máu của H.cordata và Bidens pilosa. Năm dòng tế bào ung thư máu, theo thứ tự là L1210, U937, K562, Raji và P3HR1 được nuôi cấy với chất chiết xuất của H. cordata và Bidens pilosa. Kết quả cho thấy chiết xuất từ các dược liệu trên có tác dụng ngăn chặn 5 dòng tế bào này. Tác dụng chống viêm tuyến vú: [29] Công trình nghiên cứu được thực hiện tại Trường đại học Thú y, thuộc Viện đại học Nông nghiệp Zbejiang, Hangzbou, Trung Quốc. Từ Houttuynia cordata, các nhà nghiên cứu đã chiết xuất được chất Houttuynia, sau đó cho Houttuynia phản 6 ứng với bisulphat natri để có được chất Houttuynin bisulphat natri. Từ chất này, họ đã chế biến được một dung dịch tiêm vào vú để điều trị bệnh viêm tuyến vú ở bò. Thử nghiệm trên 52 trường hợp viêm tuyến vú ở bò được chia làm 2 nhóm: nhóm 1 tiêm 80mg dung dịch H. bisulphat Na và nhóm 2 tiêm 800.000 đơn vị Penicillin kết hợp với 1g Streptomycin. Kết quả cho thấy 88,2% viêm tuyến vú đã điều trị khỏi với H.bisulphat Na, so với 90% được chữa lành với Penicillin + Streptomycin. Như vậy, không có sự khác biệt đáng kể trong điều trị viêm tuyến vú cấp tính giữa 2 nhóm trên. Các tác dụng khác: Diếp cá còn có tác dụng kháng khuẩn [26], kháng viêm [22], chống oxy hóa [28]. Dịch chiết nước Diếp cá dùng điều trị cho bệnh nhân viêm xoang mãn tính và polyp mũi [25]. 1.1.5. Công dụng: [6], [13], [16] Diếp cá được dùng trị táo bón, trĩ, mụn nhọt, lở ngứa, trẻ con lên sởi, viêm phổi hay phổi có mủ, đau mắt đỏ hay đau mắt do nhiễm trực khuẩn mủ xanh, viêm ruột, kiết lỵ, bí tiểu tiện, kinh nguyệt không đều. Ở Trung Quốc, một hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn đã được phân lập từ cây diếp cá và bào chế thành thuốc viên và thuốc tiêm để trị bệnh nhiễm khuẩn. Ở Nhật Bản, thân rễ Diếp cá có trong thành phần của một số chế phẩm thuốc dùng chữa một số bệnh của phụ nữ. 7 1.2. CÔNG NGHỆ BÀO CHẾ VIÊN NANG CỨNG: 1.2.1. Khái quát về thuốc viên nang:[2] 1.2.1.1. Định nghĩa: Thuốc nang là dạng thuốc uống chứa một hay nhiều hoạt chất trong vỏ nang cứng hay mềm với nhiều kiểu dáng và kích thước khác nhau. Vỏ nang được làm từ gelatin và có thể được thêm các chất phụ gia không gây độc hại cho cơ thể người. Thuốc nang cứng có vỏ nang gồm hai phần hình trụ lồng khích vào nhau, mỗi phần có một đầu kín, đầu kia hở. Thuốc đóng trong nang thường ở dạng rắn (bột hay cốm). 1.2.1.2. Ưu điểm của viên nang cứng: Viên nang là dạng viên dễ uống, dễ nuốt và có màu sắc phong phú hơn dạng viên nén. Dược chất đóng vào viên nang có thể ở nhiều dạng: bột, cốm, vi hạt, vi nang, viên nang nhỏ, viên nén hay phối hợp các dạng trên trong cùng một vỏ nang. Sự phối hợp này có thể giúp cách ly các thành phần tương kỵ hay điều chế viên nang phóng thích kéo dài bằng cách phối hợp các vi hạt hay vi nang phóng thích dược chất tại nhiều thời điểm và vị trí khác nhau trong đường tiêu hóa dễ dàng. So với viên nén, viên nang là dạng thuốc tương đối dễ nghiên cứu để xây dựng công thức. Dễ triển khai sản xuất ở các quy mô khác nhau, có thể sử dụng các máy đóng nang thủ công trong quy mô nhỏ hay các máy đóng nang bán tự động và tự động trong quy mô sản xuất lớn. Viên nang là dạng viên ít gặp phải các vấn đề về sinh khả dụng do khối thuốc trong nang không bị nén chặt nên viên dễ rã hơn viên nén. 1.2.2. Thành phần viên nang:[2] 1.2.2.1. Vỏ nang: Vỏ nang được chế tạo từ nguyên liệu chính là gelatin, các chất màu, chất tạo độ đục như titan dioxyd và các chất phụ gia khác. Vỏ nang cũng có thể chế tạo từ dẫn chất cellulose, loại vỏ nang này ít được sử dụng vì độ tan kém và giá thành cao. 8 1.2.2.2. Thành phần dược chất trong viên nang: Xây dựng công thức cho viên nang Khối thuốc (hạt, bột) để đóng vào nang phải có 2 tính chất cơ bản là độ trơn chảy, tính chịu nén. Các thuộc tính này có thể thay đổi nhất định tùy thuộc vào thiết bị đóng thuốc vào nang. Cần lưu ý là các dược chất có tính hút ẩm cao có khả năng làm mềm vỏ nang, các dược chất có tính kiềm cao hay acid cao cũng có thể làm hỏng vỏ nang. Để tăng lưu tính và khả năng chịu nén của khối thuốc, có thể áp dụng phương pháp xát hạt khô hay xát hạt ướt. Kích thước của hạt nên phù hợp để có thể đảm bảo hạt chảy đều vào nang đồng thời hạn chế được sai số khối lượng thuốc trong nang. Các tá dược thông thường dùng để điều chế khối bột gồm: Tá dược độn: Các loại tá dược độn dùng trong viên nén như tinh bột, lactose, dicalci phosphat đều có thể được dùng trong viên nang. Các loại tinh bột dập thẳng như tinh bột tiền gelatin hóa, tinh bột phun sấy có thể được dùng để gia tăng lưu tính và tính chịu nén của khối hạt. Tá dược trơn: tá dược trơn giúp cho hạt chảy đều. Sự trơn chảy của khối hạt hay bột cần thiết cho tất cả các máy đóng nang khác nhau.. Độ trơn chảy đặc biệt cần thiết trong trường hợp đóng thuốc theo nguyên tắc đĩa phân liều. Các tá dược trơn thường dùng là Mg stearate, talc, tinh bột bắp,… Tá dược chống dính: các tá dược chống dính vừa có tác dụng làm tăng lưu tính của khối bột (hay hạt) vừa tránh sự kết dính của bột thuốc lên các bề mặt kim loại. Tá dược rã: tá dược rã có thể không cần thiết trong trường hợp đóng bột không nén vào nang. Trong trường hợp có xát hạt hay trong trường hợp có nén ép (máy có đĩa phân liều hay vít phân liều) thì nên có tá dược rã để giúp thuốc phóng thích nhanh. Nên sử dụng các tá dược siêu rã để có thể chọn được kiểu nang nhỏ. 9 1.2.3. Quy trình bào chế thuốc viên nang cứng từ dược liệu: [1],[2] Điều chế khối thuốc Vỏ nang Đóng nang Lau nang – Đánh bóng Đóng gói Thành phẩm Sơ đồ 1.1. Tóm tắt quy trình sản xuất viên nang cứng. Điều chế khối thuốc: thông thường điều chế khối thuốc bằng phương pháp xát hạt khô hay xát hạt ướt. Đối với dược liệu thường tiến hành như sau: + + + Chiết kiệt hoạt chất từ dược liệu bằng phương pháp và dung môi thích hợp. Xử lý dịch chiết để thu được cao đặc hay cao khô. Do bột thuốc làm từ dược liệu hút ẩm rất mạnh nên phải khảo sát và phối hợp cao dược liệu với tá dược hút ẩm, tá dược độn theo tỷ lệ phù hợp nhằm giữ ổn định và bảo quản khối bột thuốc. + + Ép cốm, phối hợp tá dược trơn chảy thích hợp. Sửa hạt và kiểm tra chất lượng hạt. Đóng nang: Trong trường hợp điều chế một lượng nhỏ viên nang để dùng cho một số bệnh nhân hay thử nghiệm lâm sàng các thuốc mới, khối thuốc có thể được đóng vào nang bằng tay (không dùng thiết bị). Trong sản xuất có thể sử dụng các máy đóng nang thủ công, bán tự động và máy đóng nang tự động tùy theo quy mô sản xuất khác nhau. 10 Lau nang – đánh bóng: sau khi đóng thuốc vào nang, các viên nang cần được loại bụi và đánh bóng trước khi đóng gói. Tùy theo điều kiện trang thiết bị có sẵn, có thể áp dụng các phương pháp: loại bụi bằng phương pháp thủ công, loại bụi và đánh bóng trong nồi bao, loại bụi bằng hệ thống lau và đánh bóng viên. 1.3. SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO: [9] Sắc ký lỏng hiệu năng cao đôi khi còn được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao (High-Pressure) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh đã sử dụng. Ngày nay, HPLC đã và đang được sử dụng trong nhiều lĩnh vực phân tích hóa học nói chung cũng như trong kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích sinh dược học nói riêng. Trong phân tích thuốc bằng phương pháp sắc ký, phần lớn các dược điển đều sử dụng sắc ký phân bố. Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo chung của một hệ thống HPLC. 1.3.1. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc kí: 11 1.3.1.1. Hệ số dung lượng k’ (Capacity factor): k'= Trong đó: t 'R t R − t0 = t0 t0 k': hệ số dung lượng. tR: thời gian lưu. t’R: thời gian lưu hiệu chỉnh. t0: thời gian chết. Cần chọn cột, pha động,…sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu: 1 ≤ k’ ≤ 8. 1.3.1.2. Hệ số chọn lọc α: Hình 1.4. Xác định thời gian chết (t0) và thời gian lưu (tR). α= k ' B t RB = k ' A t RA Quy ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên α > 1. Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0. 1.3.1.3. Hệ số bất đối xứng: As = Trong đó: W1/ 20 2f W1/20: độ rộng đỉnh ở 1/20 chiều cao. f: khoảng cách từ đường cao của đỉnh đến chân trước của đỉnh ở 1/20 chiều cao. 1.3.1.4. Độ phân giải Rs: Rs = Trong đó: 2(t RB − t RA ) t −t = 1,18 RB RA WB + WA W1/ 2 B + W1/ 2 A TRB, tRA: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A). WB, WA: độ rộng pic đo ở đáy các pic. W1/2B, W1/2A: độ rộng pic đo ở nữa chiều cao pic. 1.3.1.5. Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột: 12 Hiệu lực cột được đo bằng thông số: số đĩa lý thuyết N của cột. 2 2 tR tR N = 16 2 = 5,54 2 W W1 / 2 Trong đó: W: chiều rộng đo ở đáy pic. W1/2: chiều rộng pic đo ở nữa chiều cao pic. Hình 1.5. Cách xác định số đĩa lý thuyết. 1.3.2. Một số ứng dụng của phương pháp HPLC: 1.3.2.1. Phân tích định tính: Định tính các hợp chất là một phần cốt lõi của bất cứ một phương pháp HPLC nào. Phân tích định tính bằng HPLC chủ yếu thục hiện bằng 3 cách sau đây: • • • Dựa vào các dữ liệu về sự lưu. Phân tích định tính các chất thu được từ HPLC quy mô phân tích. Phân tích phổ nghiệm online các đỉnh HPLC. Nguyên tắc: việc định lượng các chất bằng HPLC có thể dựa vào sự so sánh 1.3.2.2. Phân tích định lượng: chiều cao của đỉnh hay so sánh diện tích đỉnh của chất cần xác định với một hay nhiều mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ. Các phương pháp định lượng: • • • • Phương pháp quy về 100% diện tích. Phương pháp dùng chuẩn ngoại. Phương pháp dùng chuẩn nội. Phương pháp thêm chất chuẩn. 1.4. GIỚI THIỆU MỘT SỐ CHẾ PHẨM CHỨA CAO DIẾP CÁ: 13 1.4.1. An trĩ vương: Công ty Cổ phần sản xuất và Thương mại Hồng Bàng. CÔNG THỨC: Hàm lượng trong một viên: Cao Diếp cá Cao Đương quy Magie carbonat Rutin Curcumin 450 mg 150 mg 108 mg 25 mg 10 mg Hình 1.6. Chế phẩm An Trĩ Vương. CÔNG DỤNG: Hỗ trợ điều trị và giúp phòng ngừa bệnh trĩ, cải thiện các triệu chứng của bệnh trĩ (chảy máu, sa búi trĩ, đau rát, ngứa...) và các biến chứng xuất huyết của bệnh trĩ (sa trực tràng, viêm nứt hậu môn...). Hỗ trợ điều trị và phòng ngừa táo bón. Giúp bảo vệ và tăng sức bền của tĩnh mạch, tăng cường sức khỏe tĩnh mạch và đường tiêu hóa. 1.4.2. Helaf: Công ty cổ phần dược Hậu Giang. CÔNG THỨC: Hàm lượng trong một viên: Cao khô Diếp cá 210 mg Cao khô Rau má 45 mg Kollidon CL - M, sáp ong trắng, dầu nành, vỏ nang gelatin CÔNG DỤNG: Hình 1.7. Chế phẩm Helaf. Helaf có tác dụng hỗ trợ điều trị trĩ, táo bón và kiết lỵ. Helaf giúp giải nhiệt, thông tiểu, mát gan, giải độc, kháng viêm, giúp vết thương chóng lành và mau lên da non, tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể. 1.4.3. Cenditan: Công ty cổ phầm dược phẩm 3/2. 14 CÔNG THỨC: Hàm lượng trong một viên: Cao diếp cá Bột rau má 75mg 300mg CÔNG DỤNG: Trị táo bón, trĩ. Giải nhiệt, thông tiểu, mát gan, giải độc. Hình 1.8. Chế phẩm Cenditan. Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, CHẤT CHUẨN, HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ: 15 2.1.1. Nguyên liệu và chất chuẩn: Cao Diếp cá được cung cấp bởi công ty TNHH ADC tại Ô Môn, KV Thới Hưng, phường Long Hưng, quận Ô Môn, Thành phố Cần Thơ. Số lô: SE-HCO1-0210. Quercetin chuẩn do Bộ Y Tế – Viện kiểm nghiệm TP.HCM cung cấp, số lô 104050609, hàm lượng 91,34% C15H10O7, nước 8,51%. 2.1.2. Hóa chất: Bảng 2.1. Các hóa chất, tá dược sử dụng trong nghiên cứu. STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 12 Tên nguyên liệu, hóa chất Acetonitril Acid chlohyric Acid formic Acid phosphoric Chloroform Ethanol 96% Ethyl acetat Magnesi Magnesi carbonate Methanol Natri hydroxyd Natri sulfat Sắt (III) clorid Talc Nguồn gốc Merck Trung Quốc Trung Quốc Merck Trung Quốc Việt Nam Trung Quốc Trung Quốc Việt Nam Merck Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Mỹ Tiêu chuẩn Phân tích HPLC Tinh khiết PA Tinh khiết PA Phân tích HPLC Tinh khiết PA TCCS Tinh khiết PA Tinh khiết PA TCCS Phân tích HPLC Tinh khiết PA Tinh khiết PA Tinh khiết PA USP 30 2.1.3. Trang thiết bị: Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu. STT 1 2 3 4 5 6 7 8 Tên thiết bị Bếp điện Bể siêu âm Cân phân tích Máy đo độ rã Máy sát hạt và sửa hạt Máy trộn Tủ sấy Máy soi UV 2 bước sóng Số hiệu JK 071 Elma Ep 214C-Ohaus Pharma test FGS Misuko JBJ103 Memmerk ENF-2400C/EF Nguồn gốc Nhật Đức Mỹ Đức Đức Nhật Đức Mỹ 16 9 10 Máy HPLC Cân sấy ẩm hồng ngoại Hitachi L200 MX-50 Nhật Mỹ 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.2.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng quercetin bằng phương pháp HPLC: 2.2.1.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký tối ưu: Tiến hành chạy sắc ký trên quercetin chuẩn để tìm các điều kiện sắc ký tối ưu. Chạy sắc ký với mẫu thử ở điều kiện sắc ký thăm dò, tiến hành thay đổi các điều kiện sắc ký để đỉnh chính (tương ứng với quercetin) đạt các thông số sắc ký. Chuẩn bị mẫu chuẩn: cân chính xác 25mg chuẩn đối chiếu quercetin cho vào bình định mức 50ml, thêm 30ml methanol, siêu âm trong 10 phút và bổ sung methanol đến vạch, lắc đều để có dung dịch mẹ có nồng độ 500µg/ml. Từ dung dịch mẹ, tiến hành pha các dung dịch có nồng độ thấp hơn như sau: lấy chính xác một lượng thể tích dung dịch mẹ cho vào bình định mức, thêm methanol vừa đủ thu được dung dịch có nồng độ theo yêu cầu. Các số liệu pha mẫu được trình bày trong bảng 2.3. Bảng 2.3. Phương pháp pha các dung dịch có nồng độ thấp hơn. STT 1 2 3 4 5 6 Dung dịch mẹ Bình định mức Nồng độ dung dịch thu được (µg/ml) 50 100 150 200 250 300 (ml) (ml) 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 Chuẩn bị mẫu thử: tiến hành theo mục 2.2.1.2. 2.2.1.2. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu cao Diếp cá và viên nang chứa cao Diếp cá để định lượng quercetin: Tiến hành chiết và theo dõi: - Quá trình chiết quercetin từ dịch thủy phân cao Diếp cá. 17 - Thời gian để phản ứng thủy phân xảy ra hoàn toàn: dịch thủy phân sau mỗi 1 giờ được chiết kiệt Quercetin bằng CHCl3, theo dõi các dịch thủy phân sau 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ,... - Quá trình loại tạp. Theo dõi bằng thuốc thử FeCl3 trong cồn và sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Chloroform – Ethyl acetat – Acid formic (5:4:1). Phát hiện bằng đèn UV ở bước sóng 254 nm, nhúng thuốc thử FeCl3 trong cồn. Quy trình chuẩn bị mẫu thử cao Diếp cá: Cân chính xác khoảng 1 g cao Diếp cá, hòa tan với 10 ml ethanol 25%, lọc, chuyển vào bình lắng gạn, thêm vào 20 ml chloroform, lắc đều 5 phút, rút bỏ dịch chloroform. Dịch nước còn lại hòa tan với 10 ml dung dịch HCl 10%/cồn 25% đun hồi lưu. Dịch thủy phân thu được lắc với với 20 ml chloroform trong 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn để yên 60 phút, rút lấy dịch chloroform. Lặp lại 3 lần. Gộp dịch chloroform lắc với với 20 ml nước. Rút dịch chloroform lọc qua Na 2SO4 sau đó đem cô đến dịch CHCl3 đậm đặc (A1). Dịch A1 cho qua cột SPE tự chế để loại tạp. Cho 20 ml chloroform qua cột SPE để loại tạp phân cực, tiếp theo cho 40ml hỗn hợp CHCl3: EtOAc – 6:4 để lấy phân đoạn chứa quercetin. Cô phân đoạn chứa quercetin đến cắn (A2). Hòa tan cắn A2 trong methanol rồi cho vào bình định mức 10ml, bổ sung đủ thể tích, lọc sơ bộ. Sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm, bỏ vài ml dung dịch đầu trước khi bơm vào hệ thống. Quy trình chuẩn bị mẫu thử viên nang chứa Cao diếp cá: Cân 20 nang, tính khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang, nghiền thành bột mịn. Cân lượng bột thuốc tương ứng với 1g cao Diếp cá, hòa tan trong 10 ml cồn 25%, lọc thu lấy dịch lọc, rửa cắn với khoảng 2 ml cồn 25%, thêm vào 20 ml chloroform, lắc đều 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn, rút bỏ dịch chloroform. Dịch nước còn lại hòa tan với 10 ml dung dịch HCl 10%/cồn 25% đun hồi lưu. Dịch thủy phân thu được lắc với 20 ml chloroform trong 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn để yên 60 phút, rút lấy dịch chloroform. Lặp lại 3 lần. Gộp dịch chloroform lắc với 20 18 ml nước. Rút dịch chloroform lọc qua Na2SO4 sau đó đem cô đến dịch CHCl3 đậm đặc (A1). Các bước còn lại xử lý như đối với mẫu thử cao Diếp cá. Cao Diếp cá (Viên Diếp cá) Hòa tan vào cồn 25%, lọc Lắc với CHCl3, gạn bỏ lớp CHCl3 Dịch cồn 25% HCl 10% / cồn 25% Thủy phân 3h Dịch thủy phân Lắc với CHCl3 3 lần Dịch CHCl3 Lắc với H2O, gạn bỏ lớp nước. Lọc qua Na2SO4 Cô đến dịch CHCl3 đậm đặc Dịch CHCl3 đậm đặc Cột SPE tự chế Dịch SPE chứa Quercetin Cô đến cắn Cắn Sơ đồ 2.1. Tóm tắt quy trình xử lý mẫu thử. 19 2.1.1.3. Thẩm định quy trình định lượng: Tính tương thích hệ thống: Tính tương thích hệ thống của quy trình phân tích được xác định trên giá trị và độ lặp lại của các thông số kỹ thuật của hệ thống khi tiến hành thực hiện quy trình trên mẫu chuẩn và mẫu thử với 6 lần tiêm mẫu liên tiếp. - Tiến hành: Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn. Chạy sắc ký 6 lần với mẫu chuẩn và mẫu thử. Khảo sát các thông số: thời gian lưu, diện tích đỉnh. Xử lý thống kê các giá trị thu được. - Yêu cầu: RSD ≤ 2%. Thẩm định quy trình: Tính đặc hiệu - Tiến hành: Chuẩn bị mẫu thử và mẫu trắng (là mẫu chỉ gồm tá dược), mẫu dung môi pha mẫu, mẫu dung dịch nước acid phosphoric 0,2%. - Yêu cầu: Tiến hành chạy sắc ký. Mẫu trắng, mẫu dung môi, mẫu dung dịch nước acid phosphoric 0,2% không có các pic trùng với đỉnh chính (tương ứng với quercetin). Tính tuyến tính - Tiến hành: Chạy sắc ký và xác định hàm lượng 6 dung dịch chuẩn với nồng độ khác nhau. Xây dựng đường chuẩn và xác định R2. Thẩm định lại phương trình đường chuẩn bằng phương pháp - Yêu cầu: thống kê. R2 ≥ 0,99. 20 Độ chính xác - Tiến hành: Xử lý 6 mẫu thử nồng độ bằng nhau. Xác định hàm lượng quercetin trong mỗi mẫu thử. - Yêu cầu: Độ đúng - Tiến hành: Tính hàm lượng trung bình và RSD%. RSD nằm trong giới hạn cho phép của AOAC. Thêm lượng chất chuẩn quercetin tương ứng với khoảng 80%, 100%, 120% hàm lượng quercetin có trong mẫu thử. Định lượng tìm lại hàm lượng hàm lượng quercetin đã thêm - Yêu cầu: vào để xác định tỷ lệ phục hồi. Tỷ lệ phục hồi trong giới hạn cho phép của AOAC. 2.2.2. Xây dựng công thức viên nang chứa cao Diếp cá: Quá trình nghiên cứu như sau: thiết kế công thức → tạo hạt → khảo sát đặc tính của hạt → đóng nang → thử độ rã → lựa chọn công thức chế phẩm. Công thức được thiết kế dựa theo phương pháp cổ điển của Gauss – Geidell. [8] 2.2.2.1. Thiết kế công thức viên nang chứa cao Diếp cá: Lựa chọn hàm lượng cao thích hợp: Cao dược liệu có khả năng hút ẩm rất lớn, hàm lượng cao càng nhiều thì khả năng hút ẩm càng mạnh. Vì vậy, chọn hàm lượng cao thích hợp sao cho giảm bớt lượng tá dược sử dụng mà vẫn đảm bảo độ ẩm thích hợp cho việc đóng nang là điều cần thiết. Để thực hiện điều này chúng tui tiến hành như sau: - Thiết kế các công thức với hàm lượng cao khác nhau, giữ nguyên tỷ lệ tá dược hút tối đa có thể sử dụng trong công thức. - Tiến hành tạo hạt và khảo sát độ ẩm lúc cân bằng để tìm hàm lượng cao thích hợp. - Hàm lượng cao thích hợp là hàm lượng cao cao nhất và có độ ẩm bột thuốc lúc cân bằng ≤ 5%. 21 Lựa chọn hàm lượng tá dược dính: Cao dược liệu có độ dính khá lớn, vì vậy có thể làm ẩm bằng nước và tiến hành sát hạt, tuy nhiên tỷ lệ bột mịn thường cao. Do vậy chúng tui chọn PVP K30 làm tá dược dính với hàm lượng là 2%. Lựa chọn hàm lượng tá dược hút: Xây dựng công thức với hàm lượng tá dược hút lần lượt là 0%, 5%, 10%, 15%, xác định độ ẩm lúc cân bằng của khối bột thuốc
tV97j8fKN5fLNdK
