Download miễn phí So sánh hoạt độ của một số enzym bảo vệ tổn thương oxy hoá và phổ băng ADN của ốc bradybaena similaris thu thập ở Mã Đà và Cát Tiên tỉnh Đồng Nai
Để tìm hiểu sự khác biệt về phổ băng ADN của mẫu ốc
BSMĐ và BSCT chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật RAPD-PCR với hệ thống mồi ngẫu nhiên. Kếtquả phân tích phổ
băng RAPD với 3 mồi đơn là OPA4, OPA 10 và OPA 12
cho thấy có sự đồng hình rất cao giữa hai mẫu BSMĐ và
BSCT, cụ thể chúng tôi không phát hiện ra sự sai khác nào
về các băng được nhân bản. Để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn
chúng tôi đã tiếnhành thực hiện phản ứng RAPD cải tiến
bằng cách phối hợp từng cặp mồi với nhau. Kết quả ở hình
10 cũng cho thấy sự đồng hình di truyền cao giữa mẫu
BSMĐ và BSCT. Tuy nhiên trong trường hợp này chúng
tôi đã phát hiện thấy trong số 36 băng nhân bản thì một
băng với kích thước khoảng 500bp chỉ thấy ở mẫu ốc
BSCT (hình 10, cột 4) và băng có kích thước khoảng 750bp
chỉ thấy ở mẫu ốc BSMĐ (hình 10, cột 5). Cả hai băng đều
do kết hợp mồi OPA4 với OPA12.
http://s1.liketly.com/flash/edoc/jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-swf-2013-12-27-so_sanh_hoat_do_cua_mot_so_enzym_bao_ve_ton_thuong.QkukdbVd6W.swf /tai-lieu/de-tai-ung-dung-tren-liketly-52425/Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
SO SÁNH HOẠT ĐỘ CỦA MỘT SỐ ENZYM BẢO VỆ
TỔN THƯƠNG OXY HOÁ VÀ PHỔ BĂNG ADN
CỦA ỐC BRADYBAENA SIMILARIS THU THẬP Ở
MÃ ĐÀ VÀ CÁT TIÊN TỈNH ĐỒNG NAI
Đặng Quang Hưng, Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn
Nghĩa
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
1. MỞ ĐẦU
Các tác nhân oxy hoá như peroxit hydro, các gốc tự do
superoxit (O2.-), gốc hydroxyl (OH.) luôn được hình thành
trong các hoạt động sống của các cơ thể sinh cũng như
trong quá trình tương tác của sinh vật với môi trường.
Chính những tác nhân này là nguyên nhân gây ra các tổn
thương oxy hoá [5]. Để chống lại tác dụng tổn thương của
các tác nhân này, sinh vật đã hình thành các cơ chế bảo vệ
khác nhau, trong đó chủ yếu dựa vào các enzym có hoạt
tính phân huỷ các hợp chất oxy hoá như là superoxit
dismutase (SOD) triệt tiêu gốc superoxit hay NADH
oxidase (NOX), catalase (CAT), alkyl hydroperoxide,
glutathion reductase có tác dụng phân huỷ peroxit
hydro...Chính vì vậy, nghiên cứu các enzym này sẽ là cơ sở
để tìm hiểu sự đáp ứng của cơ thể với các tác nhân oxy hoá
khác nhau bao gồm các tác nhân nội sinh cũng như ngoại
sinh.
Bài báo này trình bày các kết quả nghiên cứu bước đầu về
việc so sánh hoạt độ của enzym SOD, CAT, NOX, phổ
băng protein và ADN của loài ốc Bradybaeana similaris
thu thập từ hai vùng Mã Đà và Cát Tiên (tỉnh Đồng Nai),
đặt cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về sự tác động của
môi trường lên cơ thể.
2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
Nguyên liệu.
Loài ốc Bradybaena similaris (Ferussae) được thu thập ở
Mã Đà và Cát Tiên thuộc tỉnh Đồng Nai, được PGS. TS.
Nguyễn Xuân Quýnh định tên khoa học. Mẫu vật được giữ
sống hay giữ ở –80oC cho đến khi phân tích.
Mồi dùng cho phân tích phổ băng RAPD bao gồm: OPA4
(5'-AATCGGGCTG), OPA10 (5'-CAGGCCCTTC),
OPA12 (5'-GGGCGGTACT) và thang chuẩn ADN được
đặt từ hãng Invitrogen (Mỹ). Xanthine, xanthine oxidase,
nitro tetrazolium blue (NTB) và riboflavin được mua từ
hãng Sigma (Mỹ), các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh sạch
dùng cho phân tích.
Phương pháp nghiên cứu:
Dịch chiết mẫu ốc được chuẩn bị bằng cách loại bỏ vỏ,
cắt lấy phần cơ và nghiền trong cối sứ ở 4oC với tỷ lệ 1g
nguyên liệu: 10 ml đệm chiết (Tris-HCl 100mM, pH 7 chứa
KCl 50mM). Mẫu sau khi nghiền được ly tâm ở tốc độ
10.000 vòng/phút ở 4oC trong10 phút để thu dịch trong
dùng cho phân tích protein và hoạt độ enzym.
ADN của ốc được tách chiết theo phương pháp được
mô tả trong [14] sau đó được hoà tan trở lại trong đệm TE
(Tris-HCl, 10 mM, pH 8 có chứa 2 mM EDTA)
Protein được xác định theo phương pháp của Lowry [8],
dùng albumin huyết thanh bò làm chất chuẩn.
Hoạt độ SOD được xác định theo phương pháp Mc Cord
và Fredovich [11].
Điện di trên gel polyacrylamit được tiến hành theo
phương pháp của Laemmli [7].
Phổ băng SOD được xác định theo phương pháp của
Beauchamp và Fredovich [4].
Hoạt độ NOX được xác định theo phương pháp Poole
& Clairborne [15].
Hoạt độ catalase được xác định theo phương pháp của
Thibodeau và cộng sự [17] và Mottola và cộng sự [12].
Phản ứng RAPD-PCR
Hỗn hợp phản ứng RAPD (25l ) có chứa 0,2mM mỗi loại
dNTPs, 1l mồi (20 pmol) và 2,5 l10X đệm phản ứng (có
25mM MgCl2) và 2,5 đơn vị Taq ADN polymerase. Giai
đoạn biến tính được thực hiện ở 95oC trong 3 phút; tiếp
theo 45 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm các bước thay đổi nhiệt độ
và thời gian: 94oC-30 giây; 36oC- 45 giây;72oC-1 phút tiếp
theo là ử ở 72oC trong 7 phút. Sản phẩm RAPD được điện
di trên gel agarose 1%, nhuộm với ethidium bromide, soi
dưới đèn UV và chụp ảnh.
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. So sánh hoạt độ SOD, NOX, CAT của ốc Bradybaena
similaris thu thập từ Mã Đà (BSMĐ) và Cát Tiên (BSCT).
1.1 Hoạt độ SOD của ốc BSMĐ và BSCT
Hình 1: Hoạt độ SOD tổng số của ốc BSMĐ và BSCT.
A: Hoạt độ tính theo mg chất khô, B: Hoạt độ tính theo mg
protein.
Kết quả phân tích hoạt độ SOD của mẫu ốc ở hình 1 cho
thấy hoạt độ SOD của ốc B. similaris ở Mã Đà (BSMĐ) là
khoảng 22 đv/mg chất khô còn ở Cát Tiên (BSCT) là
khoảng 40 đv/mg chất khô và hoạt độ riêng (HĐR) tương
ứng là 1100 đv/mg protein và 2600 đv/mg protein. Như vậy
hoạt độ SOD của BSMĐ là cao hơn so với của BSCT là 1,8
lần.
Kết quả nghiên cứu phổ băng SOD (hình 2) cho thấy hai
mẫu ốc BSMĐ và BSCT đều có phổ băng như nhau với 1
băng rõ nét có Rf 0,13 và một vùng sáng có thể chứa vài
băng SOD với Rf nằm trong khoảng 0,23 - 0,25. Như vậy,
sự khác biệt về hoạt độ SOD của ốc BSMĐ và BSCT ở trên
không liên quan đến số lượng SOD của chúng có mặt trong
mẫu phân tích.
Hình 2: Phổ băng SOD của ốc BSMĐ và BSCT (A:
BSMĐ, B: BSCT)
SOD là nhóm enzym có cofactơ là ion kim loại [5,11]. Để
sơ bộ tìm hiểu ion kim loại có mặt trong SOD của ốc
Bradybaena similaris, chúng tui đã tiến hành thẩm tích dịch
chiết mẫu trong đệm có chứa EDTA nhằm loại bỏ các ion
kim loại ra khỏi enzym của mẫu nghiên cứu, sau đó tiến
hành xác định hoạt độ SOD với sự bổ sung các ion kim loại
khác nhau. Kết quả thu được ở hình 3 cho thấy quá trình
thẩm tích đã không làm mất hoàn toàn hoạt độ SOD của
mẫu ốc BSMĐ cũng như BSCT. Tuy vậy, trong số 4 loại
ion kim loại hoá trị 2 (Ni2+, Mn2+, Fe2+, Zn2+) được bổ sung
vào hỗn hợp phản ứng thì chỉ Fe2+ có khả năng làm tăng
một phần hoạt độ SOD (khoảng 5%) của BSMĐ cũng như
của BSCT. Việc bổ sung các ion kim loại khác có tác dụng
kìm hãm một phần hoạt độ SOD của BSMĐ và BSCT. Có
thể SOD của BSMĐ và BSCT đều cần Fe2+ cho hoạt động
xúc tác của SOD và SOD của chúng có thể thuộc nhóm
FeSOD.
Hình 3: Ảnh hưởng của ion kim loại lên SOD của ốc
BSMĐ và BSCT
Kết quả phân tích độ bền của SOD trong mẫu ốc BSMĐ và
BSCT với nhiệt (hình 4) cho thấy SOD của cả hai mẫu
nghiên cứu đều không bền với nhiệt. Sau khi xử lý nhiệt ở
80oC trong 15 phút, hoạt độ SOD của cả hai mẫu ốc BSMĐ
và BSCT đều bị mất hoàn toàn và không có sự sai khác
đáng kể về mức độ bền với nhiệt giữa hai mẫu nghiên cứu.
Hình 4: Độ bền với nhiệt của SOD của ốc BSMĐ và BSCT
Hình 5: Hoạt độ NOX của ốc BSMĐ và BSCT
A: Hoạt độ tính mg chất khô, B: Hoạt độ tính theo mg
protein.
Kết quả xác định hoạt độNOX (hình 5) cho thấy hoạt độ
NOX của mẫu ốc BSMĐ là 0,0022 đv/mg chất khô và của
ốc BSCT là 0,0027 đv/mg chất khô. HĐR NOX tương ứng
của BSMĐ và BSCT là 0,12 đv/mg protein và 0,175 đv/mg
protein. Như vậy là hoạt độ NOX của mẫu ốc BSCT cao
hơn BSMĐ khoảng 1,2 lần.
Nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ NOX
(hình 6) cho thấy NOX của dịch chiết BSMĐ tỏ ra kém bền
nhiệt hơn so với BSCT, cụ thể khi xử lý ở nhiệt độ 60oC và
80oC dịch chiết của ốc BSMĐ mất tương ứng 25% và 98%
hoạt độ, trong khi đó dịch chiết của BSCT chỉ mất tương
ứng 30% và 60% hoạt độ.
Hình 6: Độ bền với nhiệt của NOX của ốc BSMĐ và BSCT
1.3. CAT của ốc BSMĐ và BSCT
Catalase (CAT) là enzym chủ yếu giữa vai trò phân huỷ các
H2O2 trong hầu hết các cơ thể sinh vật. Kết quả xác định
hoạt độ CAT của mẫu ốc ở hai vùng Mã Đà và Cát Tiên
(hình 7) cho thấy hoạt độ CAT của mẫu ốc BSMĐ là
khoảng 16 đv/mg...
