Chia sẻ miễn phí cho anh em Ket-noi
a- và fi-thalassemia là bệnh thiếu máu di truyền phổ biến tại Việt Nam. Chẩn đoán trước sinh nhằm phát hiện sớm và can thiệp các trường hợp thai mang gen bệnh đồng hợp tử là biện pháp phòng ngừa tích cực và hiệu quả. Mục tiêu: Phân tích đặc điểm phân bố đột biến gen thalassemia trên các trường hợp chẩn đoán trước sinh tại Bệnh viện Từ Dũ từ 1/12/2007 đến 31/3/2010. Đối tượng và phương pháp: Tất cả các trường hợp thai của các cặp vợ chồng mang đột biến gen a- hay p-thalassemia được chọc ối và chẩn đoán tìm alen đột biến bằng kỹ thuật ARMS, gap-PCR, enzyme hạn chế và MLPA. Két quà: 290 thai được chẩn đoán trước sinh, phát hiện 207 thai có đột biến (207/290; 71,4%). Trong số đó, 128 thai bị đột biến a-thalassemia (128/290; 44%) cao hơn 2 lần so với số thai bị đột biến p-thalassemia (59/290; 20,3%), 20 thai (20/290; 6,9%) mang đồng thời đột biến a- và p-thalassemia. Có 62 thai (62/290; 21,4%) mang kiểu gen nặng gồm: Hb Bart’s (38/290; 13,1%), Hb H (9/290; 3,1%), p-thalassemia nặng (15/290; 5,2%). Tỉ lệ alen đột biến a-thalassemia (67,2%) hơn gấp đôi p-thalassemia (32,8%) trong tổng số 287 alen được phát hiện. Đột biến --SEA và Hb E chiếm đa số, tiếp theo là -a3'7, codon 41/42 -TCTT và codon 17 +A. Có 59 trường hợp đã đồng ý chấm dứt thai kỳ (59/290; 20,3%). 100% kết quả kiểm định sau sinh đều phù hợp với chẩn đoán trước sinh. Két luận: Tỉ lệ a-thalassemia cao hơn 2 lần so với p- thalassemia. Đột biến --SEA, - a3'7, Hb E, codon 41/42 -TCTT và codon 17 +A là các đột biến phổ biến nhất. Chọc ối và chẩn đoán trước sinh bằng kỹ thuật multiplex ARMS, multiplex gap-PCR chính xác và an toàn.
Thalassemia là nhóm bệnh thiếu máu di truyền lặn theo quy luật Mendel do đột biến gen globin làm giảm hay không sản xuất globin để tạo thành hemoglobin (Hb). Bệnh có 2 nhóm phổ biến là a- và p-thalassemia tùy theo nguyên nhân đột biến ở gen a- hay p-globin. Các gen a-globin nằm trên nhiễm sắc thể 16 (16pter-p13.3; MIM ID +141880 và + 141850) gồm 2 gen a1 và a2 rất đồng dạng. Người bình thường có 4 gen a-globin, ký hiệu aa/aa. Mức độ thiếu máu tùy thuộc số gen a-globin bị đột biến. Bệnh Hb Bart's là thể nặng nhất, phù thai, phù nhau và chết lưu trong tử cung do đột biến 4 gen a-globin. Thể bệnh HbH do đột biến 3 gen a-globin gây thiếu máu từ nhẹ đến nặng. Thể a-thalassemia 1 và a-thalassemia 2 xảy ra ở người có 2 hay 1 gen a-globin đột biến, có thiếu máu nhược sắc nhẹ nhưng thường không có biểu hiện lâm sàng. Gen p-globin nằm trên nhiễm sắc thể 11 (11 p15.5; MIM ID +141990). Người bình thường có 2 gen p-globin, ký hiệu p/p. Người mang gen dị hợp tử có 1 gen p-globin bị đột biến p-thalassemia, thiếu máu nhược sắc nhẹ nhưng không biểu hiện lâm sàng. Thể bệnh p-thalassemia nặng do kiểu gen đồng hợp tử, 2 đột biến p-thalassemia. Trẻ thường bị thiếu máu nhược sắc nặng, khởi phát sớm từ 6 tháng tuổi. Đột biến Hb E là thể đặc biệt vì vừa gây ra vị trí ghép nối giả khi hình thành RNA thông tin tạo kiểu hình p-thalassemia, vừa sản xuất ra loại variant p-globin Hb E có axít amin tại vị trí 26 là glutamin bị thay bằng lysin. Người mang 1 đột biến Hb E kết hợp với 1 đột biến p-thalassemia sẽ có kiểu hình p-thalassemia nặng [3]. Thalassemia rất phổ biến tại Việt Nam. Tỉ lệ người mang gen đột biến khá cao, thay đổi theo địa dư và nhóm dân tộc. Một số nơi tỉ lệ mang gen Hb E hơn 70%, các p-thalassemia khác gần 25%, a-thalassemia gần 9% [9]. Ở vùng Đông Nam Á, a-thalassemia chủ yếu do các đột biến mất đoạn - SEA, -a3'7, -a4'2 và đột biến điểm aCSa tạo Hb Constant Spring tại codon 142 TAA- >CAA của gen a2 [6] có thể phát hiện hiệu quả bằng kỹ thuật multiplex gap-PCR và enzyme hạn chế [2;5]. Tám đột biến điểm -28 A>G, codon 17 AAG>TAG, IVS 1-1 G>T, codon 41/42 -TTCT, codon 71/72 +A, codon 95 +A, IVS 2-654 C>T và codon 26 GAG>AAG (tạo Hb E) chiếm 98,7% các trường hợp p- thalassemia tại Việt Nam có thể phát hiện hiệu quả bằng kỹ thuật ARMS và multiplex ARMS [1 ;8]. Tuy nhiên đặc điểm phân bố các đột biến gen này còn chưa thống nhất trong các nghiên cứu trước. Mục tiêu: phân tích đặc điểm phân bố đột biến gen thalassemia trên các trường hợp chẩn đoán trước sinh tại bệnh viện Từ Dũ từ 1/12/2007 đến 31/3/2010.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu cắt ngang mô tả.
Đối tượng: Tất cả các trường hợp thai của các cặp vợ chồng mang đột biến gen a- hay p-thalassemia đã được chẩn đoán phát hiện trong quá trình khám thai tại bệnh viện Từ Dũ (BVTD) bằng xét nghiệm huyết đồ, ferritin, điện di Hb và kỹ thuật PCR, không có chống chỉ định chọc ối, tự nguyện và đồng ý bằng giấy tham gia chẩn đoán trước sinh từ ngày 1/12/2007 - 31/3/2010. Bệnh phẩm là 10ml dịch ối được chọc hút dưới hướng dẫn của siêu âm khi thai 16 - 22 tuần đạt chất lượng, không lẫn máu khi quan sát bằng mắt thường. Bệnh phẩm được chia làm 2 phần để ly trích DNA ngay và cấy tế bào ối để loại trừ ngoại nhiễm DNA mẹ và kiểm tra kết quả chẩn đoán. Sau khi sinh, kết quả CĐTS của thai sẽ được kiểm định lại với mẫu khảo sát là 5cm dây rốn phần gắn với nhau hay mời quay lại để lấy 1ml máu. Các trường hợp không kiểm định được sẽ được gọi điện thoại để nhắc nhở và thăm hỏi về sức khỏe của trẻ.
Ly trích ADN và nuôi cấy tế bào dịch ối: ADN được ly trích từ tế dịch ối bằng phương pháp cột lọc với Mini Blood Kit (Qiagen). ADN sau cô lập được đánh giá nồng độ và độ tinh sạch bằng máy Biophotometer Plus (Eppendorf) ở bước sóng 260/280nm và lưu trữ ở 40C trước khi chẩn đoán và -300C sau khi phân tích. Tế bào dịch ối được nuôi cấy trong môi trường Amniomax và FCS (Gibco) ở điều kiện 370C, 5% CO2 trong 7 - 10 ngày, thu hoạch bằng trypsine EDTA 1/125 và NaCl 0,9%. Cặn lắng tế bào được ly trích ADN ngay hay lưu giữ ở -200C.
Phát hiện đột biến thalassemia: Các alen đột biến mất đoạn a-thalassemia -- SEA, -a3'7, -a4'2 và alen bình thường tương ứng được tầm soát phát hiện cùng lúc bằng multiplex gap- PCR đã được mô tả trước đây [2;4;5] (hình 1). Gap-PCR sử dụng 2 đoạn mồi bổ sung cho cả chuỗi bình thường và chuỗi đột biến mất đoạn ở vùng DNA gần vị trí đứt gẫy. Mỗi alen đột biến phát hiện đều được khẳng định lại bằng một gap-PCR với mồi và điều kiện phản ứng khác. Đột biến điểm aCSa được phát hiện bằng kỹ thuật enzyme hạn chế. Đoạn DNA của alen bình thường bị enzyme Mse I cắt đôi do có vị trí nhận diện cắt TTAA tại codon khảo sát trong khi DNA của alen đột biến còn nguyên vì vị trí nhận diện bị thay đổi thành TCAA [7]. Tám đột biến p-thalassemia đã nêu được phát hiện bằng kỹ thuật ARMS và multiplex ARMS được mô tả trước đây [1]. Multiplex ARMS được dùng để tầm soát alen đột biến, phản ứng gồm các mồi đặc hiệu có trình tự đầu 3' bổ sung với alen đột biến và 1 mồi chung ngược chiều với mồi đặc hiệu alen. Sự hiện diện của các alen đột biến được biểu hiện bằng sản phẩm DNA khuếch đại với các kích thước khác nhau đã biết trước (hình 2A). Alen đột biến tầm soát được và alen bình thường tương ứng được chẩn đoán khẳng định bằng phản ứng ARMS đơn thuần sử dụng 1 mồi đặc hiệu alen và 1 mồi chung ngược chiều.
Sản phẩm DNA với độ dài đã biết trước khẳng định sự tồn tại của alen tương ứng (hình 2B, C).
V3Ik9773jI6j6Yb
Xem thêm:
Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm của bệnh nhân thalassemia gặp tại Viện HHTMTW năm 2012
Nghiên cứu đặc điểm một số xét nghiệm đông cầm máu ở bệnh nhân thalassemia tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương.
