Chia sẻ cho các bạn luận văn thạc sĩ sinh học
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. LÊ THỊ THÚY ÁI



THÀNH PHỐ HỐ CHÍ MINH – 2012

Luận văn Thạc sĩ Sinh học



MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT i
DANH MỤC CÁC BẢNG iii
DANH MỤC CÁC HÌNH iv
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. BỆNH NGHẼN MẠCH DO HUYẾT KHỐI 3
1.1.1. Khái niệm về huyết khối 3
1.1.2. Tình hình nghẽn mạch do huyết khối 3
1.1.3. Cơ chế hình thành huyết khối 4
1.1.4. Sự phân hủy huyết khối bởi enzym nội sinh plasmin 8
1.1.5. Các nhân tố trong điều trị bệnh nghẽn mạch do huyết khối 9
1.2. NATTOKINASE 12
1.2.1. Nguồn gốc, đặc tính của Nattokinase 12
1.2.2. Cơ chế phân hủy fibrin của Nattokinase 14
1.2.3. Sinh tổng hợp và sản xuất Nattokinase 15
1.2.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất Nattokinase tái tổ hợp trong và ngoài nước 17
1.3. CÁC HỆ THỐNG VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG
TẾ BÀO VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 19
1.3.1. Biểu hiện gen trong tế bào vật chủ E. coli và Bacillus subtilis 19
1.3.2. Hệ thống biểu hiện dựa trên vector sát nhập 20
1.3.3. Hệ thống biểu hiện dựa trên vector plasmid có khả năng tự sao chép 25
1.4. HỆ THỐNG TIẾT CỦA BACILLUS SUBTILIS 27
Luận văn Thạc sĩ Sinh học



CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU 29
2.1.1. công cụ 29
2.1.2. Thiết bị 29
2.1.3. Hóa chất 30
2.1.4. Môi trường 33
2.1.5. Vật liệu sinh học 34
2.2. PHƯƠNG PHÁP 37
2.2.1. Phân lập Bacillus subtilis từ mẫu sản phẩm Natto 37
2.2.2. Phương pháp thử nghiệm khả năng phân hủy fibrin người 38
2.2.3. Tách chiết genom của vi khuẩn Bacillus subtilis 38
2.2.4. Thu nhận gen aprE bằng phản ứng PCR 39
2.2.5. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại gen aprE 40
2.2.6. Thu nhận plasmid bằng phương pháp SDS kiềm 40
tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein2.2.7. Tạo dòng tế bào E. coli DH5
Nattokinase trong vector pBluescript II KS (+) 41
tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein2.2.8. Tạo dòng tế bào E. coli DH5
Nattokinase trong hệ thống vector pAX01 43
tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein2.2.9. Tạo dòng tế bào E. coli DH5
Nattokinase trong hệ thống vector pBG01 46
và hóa biến nạp sản phẩm nối vào tế2.2.10. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5
48bào khả nạp E. coli DH5
2.2.11. Tinh chế sản phẩm cắt qua cột 49
2.2.12. Chuẩn bị tế bào khả nạp Bacillus subtilis và biến nạp vector tái tổ hợp vào
tế bào khả nạp B. subtilis 49

Luận văn Thạc sĩ Sinh học



2.2.13. Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pAX01 chứa
gen aprE 50
2.2.14. Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pBG01 chứa
gen aprE 52
2.2.15. Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pAX01 trong Bacillus subtilis 53
2.2.16. Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pBG01 trong Bacillus subtilis DB104 54
2.2.17. Phân tích protein biểu hiện bằng SDS-PAGE 54
2.2.18. Phương pháp xác định hoạt tính Nattokinase 55
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS NATTO TỪ SẢN
PHẨM NATTO 56
3.2. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG GEN MÃ HÓA SUBTILISIN VÀ CHỌN TRÌNH TỰ
GEN MÃ HÓA ĐẠI DIỆN 59
3.2.1. Tách chiết DNA bộ gen Bacillus sp. phân lập từ Natto 59
3.2.2. Thu nhận gen mã hóa Nattokinase 60
3.2.3. Tạo dòng tế bào E. coli mang gen aprE 61
có mang plasmid chứa gen aprE 613.2.3.1. Sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5
có mang plasmid chứa gen aprE3.2.3.2. Sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5
bằng phương pháp PCR 61
có mang plasmid chứa gen aprE3.2.3.3. Kiểm tra dòng tế bào E. coli DH5
bằng phương pháp cắt bằng enzym cắt hạn chế 63
3.2.3.4. Giải trình tự gen aprE, nhận định và tuyển chọn gen mã hóa thích hợp
cho Nattokinase 64

Luận văn Thạc sĩ Sinh học



3.3. DÒNG HÓA GEN aprE VÀO CÁC VECTOR ĐƯỢC CẤU TRÚC CHO BIỂU
HIỆN Ở BACILLUS 68
3.3.1. Hệ thống biểu hiện pAX01 68
3.3.2. Hệ thống biểu hiện pBG01 72

XW20mnRD7Q1Pm1r

---