Nghiên cứu chiết tác enzym protease bằng amoni sulfat từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto - pdf 27

Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, các chế phẩm enzym được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người. Trong số đó, protease – enzym phá vỡ
liên kết peptid giữa các acid amin của protein – là enzym có nhiều ứng dụng trong
một số ngành như chế biến thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da… Đặc biệt
trong lĩnh vực y tế, các protease đã được sử dụng làm thuốc điều trị và cho hiệu quả
tốt.
Bên cạnh các protease thu nhận được từ các tổ chức của động vật (renin,
tripsin), thực vật (bromelanin, papain), protease có nguồn gốc từ vi sinh vật cũng
đang được nghiên cứu để tìm ra các phương pháp tách chiết tối ưu. Một trong số các
loài vi sinh vật có khả năng sinh ra protease và được ứng dụng nhiều là vi khuẩn
thuộc chi Bacillus. [55]
Vi khuẩn Bacillus subtilis natto thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis
được biết đến là “nguyên liệu” ủ cùng với đậu tương nấu chín, lên men tạo nên món
ăn truyền thống Natto của Nhật Bản. Năm 1980, giáo sư Sumi người Nhật đã phát
hiện ra trong Natto có chứa nattokinase – một enzym thuộc nhóm các enzym
protease có khả năng phân giải fibrin [53]. Từ đó đến nay, nhiều nghiên cứu về
Bacillus subtilis natto đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có
khả năng sinh ra nhiều enzym nhóm protease như nattokinase [31], elastase [62],
bacillopeptidase F [64]…
Bacillus subtilis natto có khả năng sinh tổng hợp protease nhưng vấn đề đặt
ra là làm cách nào để có thể thu được protease từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
Vì vậy, khóa luận “Nghiên cứu tách chiết enzym protease bằng amoni sulfat từ môi
trường nuôi cấy B. subtilis natto” được thực hiện với hai mục tiêu:
1. Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết
protease từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto.
2. Sơ bộ tinh chế và xác định một số đặc tính của protease thu được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.3. Enzym vi sinh vật và phương pháp tách chiết enzym từ vi sinh vật
1.3.1. Enzym vi sinh vật
Enzym là các chất xúc tác sinh học có tính đặc hiệu cao, phần lớn có bản
chất là protein; có ở trong tất cả các tế bào sống và có thể duy trì được hoạt tính xúc
tác sau khi tách ra khỏi cơ thể sống (ở những điều kiện nhất định). [2],[8],[14]
Ngày nay, người ta có thể tổng hợp enzym bằng phương pháp hóa học (các
synzym), tìm ra các kháng thể có hoạt tính xúc tác (abzym), acid ribonucleic có hoạt
tính xúc tác (ribozym)… Tuy nhiên, đa số các enzym hiện nay vẫn được chiết tách
từ các tổ chức của động vật; thực vật; và chủ yếu là từ vi sinh vật. [3],[8]
Vi sinh vật là nguồn thu enzym rất phong phú trong đó có những enzym mà
cơ thể động vật và thực vật không thể tổng hợp được. Vi sinh vật có khả năng sinh
tổng hợp enzym với một lượng lớn, trong thời gian ngắn. Con người có thể tác động
vào vi sinh vật để thu được enzym theo ý muốn. Mặt khác enzym vi sinh vật thường
có hoạt tính mạnh. [14],[17],[36]
Quy trình thu nhận chế phẩm enzym từ vi sinh vật gồm bốn giai đoạn chủ
yếu:
 Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật
 Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym
 Chiết tách và thu nhận enzym
 Kiểm tra độ sạch của chế phẩm enzym
Quá trình phân lập, tuyển chọn, cải tạo giống vi sinh vật nhằm tạo ra giống vi
sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nghiên cứu với hiệu quả cao; sử dụng các
biện pháp như: gây đột biến bằng tác nhân vật lý, hóa học, sinh học phân tử (biến
nạp, tải nạp, tiếp hợp gen). [14],[17],[36]
Quá trình nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym được thực hiện bằng
phương pháp nuôi cấy bề mặt hay phương pháp nuôi cấy chìm. Cần lựa chọn thành
phần môi trường dinh dưỡng (đặc biệt là các chất cảm ứng); kiểm soát các thông số
của quá trình nuôi cấy như: nhiệt độ, pH, chế độ cấp khí… để quá trình sinh tổng
hợp enzym của vi sinh vật được diễn ra trong điều kiện tối ưu. [14],[17],[36]
1.3.2. Chiết tách và thu nhận enzym từ vi sinh vật
Các bước của quá trình chiết tách và tinh sạch enzym từ vi sinh vật được tiến
hành như sau:
a) Phá vỡ tế bào
Thực hiện với các enzym tập trung chủ yếu ở trong tế bào vi sinh vật (enzym
nội bào). Đối với các enzym được xuất tiết ra khỏi tế bào vào môi trường nuôi cấy
(enzym ngoại bào) có thể bỏ qua bước này. Các phương pháp hay được sử dụng để
phá vỡ tế bào: phương pháp cơ học (sử dụng sóng siêu âm, máy đồng hóa cao
áp…); các phương pháp khác (sốc thẩm thấu, xử lý kiềm, sử dụng các chất tẩy rửa,
dung giải bằng enzym, phương pháp “tự phân”…). Đối với những enzym tồn tại ở
dạng gắn chặt vào màng tế bào thì phải sử dụng các chất tẩy không phân cực để tách
enzym ra khỏi màng. [6],[14],[26],[36]
b) Chiết tách enzym
Sử dụng dung môi để chiết tách enzym như: nước, acid, kiềm loãng, dung
dịch đệm, dung môi hữu cơ. Nếu dịch chiết enzym có nồng độ thấp có thể cô đặc để
tăng nồng độ enzym. Thông thường, người ta hay dùng các dung dịch đệm có lực
ion và pH thích hợp để chiết tách enzym [3],[14]. Sau khi chiết tách tiến hành các
bước sau:
Tách các phần tử không hòa tan: Dùng kỹ thuật li tâm, lọc. [6],[14],[36]
Loại các thành phần không phải protein: Chất phân tử lượng thấp (thẩm
tích, lọc gel, siêu lọc); acid nucleic (thủy phân bằng nuclease, protease); lipid (sử
dụng dung môi hữu cơ). [6]
Tách phân đoạn protein và enzym: Tùy theo đặc tính của enzym như trọng
lượng phân tử, điện tích hay tính ổn định mà có các kỹ thuật tách chiết và tinh chế
khác nhau [3],[14]. Các nhóm phương pháp cụ thể thường được sử dụng bao gồm:
 Kết tủa enzym: Do đa số các enzym có bản chất là protein nên có thể sử
dụng các yếu tố như pI, lực ion, trọng lượng phân tử… để kết tủa enzym từ dịch
chiết. Phương pháp thường được sử dụng để kết tủa enzym là phương pháp diêm
tích và phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ. [5],[6],[36]
Phương pháp diêm tích: Enzym có thể được kết tủa bằng muối do hiện tượng
“salting out” (tính tan của protein enzym giảm mạnh ở nồng độ muối cao). Mỗi
enzym có một khoảng nồng độ muối mà enzym đó bị kết tủa hoàn toàn gọi là
khoảng nồng độ muối tách; do đó nên tiến hành kết tủa phân đoạn nhằm thu được
enzym mong muốn [6],[14],[26]. Các loại muối được dùng để kết tủa enzym theo
phương pháp này bao gồm: amoni sulfat, magnesi sulfat, natri sulfat… trong đó
amoni sulfat hay được sử dụng nhất do có một số ưu điểm sau:
+ Amoni sulfat có mức độ hòa tan rất cao trong nước (720g/l ở 250C).
+ Ít làm mất hoạt tính enzym, có thể có tác dụng làm bền enzym.
+ Có khả năng kết tủa chọn lọc protein enzym khi bổ sung từ từ muối vào
dịch chiết enzym thô [3]. Một ưu điểm khác của amoni sulfat là giá thành thấp [5].
Tuy nhiên, kết tủa protein enzym bằng amoni sulfat còn có một số nhược
điểm như: mất nhiều thời gian; nồng độ muối sử dụng thường cao nên tỷ trọng của
dung môi lớn, để thu được protein enzym cần ly tâm ở tốc độ cao và nhiệt độ
thấp. Mặt khác, cần tiến hành tinh chế loại muối ra khỏi tủa enzym bằng phương
pháp thẩm tích hay sắc kí lọc gel. [3],[26]
Phương pháp kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp: Dung
môi hữu cơ (có khả năng trộn lẫn với nước) được thêm vào dịch chiết enzym sẽ làm
giảm hằng số điện môi của dung dịch, làm giảm độ tan của protein enzym và tạo kết
tủa. Các dung môi dùng phổ biến: aceton, ethanol, isopropanol. Để hạn chế ảnh
hưởng của dung môi đến hoạt tính của enzym cần tiến hành ở nhiệt độ thấp (dưới
00C). [5],[6],[14]
Ngoài ra khi kết tủa enzym còn sử dụng các phương pháp khác như: kết tủa
enzym tại điểm đẳng điện, sử dụng các chất trợ (tinh bột, lactose) để cho tủa enzym
tạo thành ở dạng hạt hay sử dụng dung dịch polymer để kết tủa enzym. [14]
 Phương pháp sắc kí: Nguyên tắc của sắc kí trong chiết tách và tinh sạch
enzym là tách các enzym khác nhau từ dịch chiết dựa vào bản chất các liên kết của

/file/d/0B7oUCI ... sp=sharing
Music ♫

Copyright: Tài liệu đại học © DMCA.com Protection Status