Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối
Ặ
Chương 1. Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu và thực hành
nhận diện thảo dược……………………………………………………………..…..3
1.1. Sự cần thiết của việc nhận diện thảo dược………………………………...……3
1.2. Các phương pháp thường được sử dụng trong nhận diện thảo dược……...…….4
1.2.1. Phương pháp hình thái……………………………………………………...4
1.2.2. Phương pháp vi học…………………………………………………...……5
1.2.3. Phương pháp phân tích hóa học…………………………………………….6
Chương 2. Các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong
nhận diện thảo dược………………………………..………………………………..9
2.1. Các marker dựa trên phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR)……………….….……9
2.1.1. Kĩ thuật PCR sử dụng các mồi ngẫu nhiên (RP-PCR)………..………..….10
2.1.2. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN
có thể khuếch đại trực tiếp (DALP)…..…………………………………...13
2.1.3. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (AFLP)……...…14
2.1.4. Kĩ thuật sự đa hình các trình tự khuếch đại được phân cắt (CAPS)………18
2.1.5. Kĩ thuật phân tích các trình tự lặp đơn giản (SSR)……………………..…20
2.1.6. Kĩ thuật sự đa hình trình tự giữa các vùng lặp (ISSR)…………………….22
2.1.7. Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp vùng ADN tiểu vệ tinh (DAMD)…………..25
2.1.8. Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc trưng (SCAR)…………………………...…27
2.1.9. Kĩ thuật sự đa hình hình dạng sợi đơn (SSCP)…………………………....31
2.1.10.Kĩ thuật khuếch đại hệ thống đột biến bền vững (ARMS)
và multiplex-ARMS (MARMS)………………………………………………….33
2.2. Các marker thu được bằng phương pháp giải trình tự ADN…………………..38
2.2.1 Vùng phiên mã nội (ITS)………………………………………….………40
2.2.2. Vùng trnH – psbA…………………………………………………………42
2.2.3. Maturase K (matK)…………………………………...……………………43
2.2.4. Tiểu đơn vị lớn của ribulose-biphosphat carboxylase (vùng rbcL)……….44
2.2.5. Các trình tự ADN khác dùng trong nhận diện thảo dược…………………45
2.3. Phương pháp ADN microarray…………………………………..………...…..47
2.3.1. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là các oligonucleotid………….....…47
2.3.2. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là gen……………...……………..…49
Chương 3. Bàn luận…………………………………………………………..……51
3.1. Đánh giá về các phương pháp nhận diện thảo dược sử dụng
công cụ sinh học phân tử…………………………………………………...….51
3.2. Đánh giá thực tế việc nhận diện thảo dược ở Việt Nam……………………….56
KẾT LUẬN…………………………………………………………………...……59
ĐỀ XUẤT……………………………………………...…………………………..59
ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ thời cổ đại, con người đã biết sử dụng thảo dược để chữa bệnh. Trong vài
thập kỉ gần đây, mặc dù thuốc có nguồn gốc hóa dược được ưa chuộng do có nhiều
ưu điểm, thuốc có nguồn gốc từ thảo dược vẫn có những đóng góp quan trọng trong
lĩnh vực chăm sóc sức khỏe con người. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới
(WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng thảo dược để chăm sóc sức khỏe, đặc
biệt là ở các nước đang phát triển [44]. Xu hướng sử dụng các thuốc này hiện nay
ngày càng phát triển. Thị phần thảo dược của toàn thế giới đạt khoảng 60 tỉ đôla
mỗi năm và con số này không ngừng tăng lên với tỉ lệ tăng 6,4% / năm [53]. Tuy
nhiên, bên cạnh sự tăng lên về nhu cầu sử dụng thảo dược, một vấn đề nghiêm trọng
xuất hiện trên thị trường dược phẩm là sự nhầm lẫn, giả mạo các vị thuốc một cách
vô tình hay do cố ý. Việc sử dụng các thảo dược giả mạo có thể dẫn đến làm mất
tác dụng điều trị và gây những hậu quả không mong muốn nghiêm trọng, thậm chí
là tử vong. Do đó, việc nhận diện chính xác cây thuốc, vị thuốc là một bước quan
trọng để đảm bảo hiệu quả điều trị. Các thảo dược giả mạo có thể là các loài họ
hàng gần của cây thuốc hay các loài từ các họ khác. Do đó, việc nhận diện thảo
dược liên quan đến việc xác định chính xác loài dùng làm thuốc và phân biệt nó với
các loài có thể gây nhầm lẫn hay giả mạo đồng thời phát hiện nếu có sự có mặt của
loài giả mạo.
Hiện nay, có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để nhận diện thảo
dược. Phương pháp nhận diện dựa vào hình thái tuy đơn giản nhưng lại phụ thuộc
rất nhiều vào kinh nghiệm của người nhận diện và không thể nhận diện được thảo
dược ở dạng đã sơ chế. Phương pháp vi học có thể khắc phục được nhược điểm của
phương pháp hình thái nhưng việc nhận diện lại không thể thực hiện được khi thảo
dược ở dạng dịch chiết và khi phải tiến hành với số lượng lớn các mẫu. Các phương
pháp dựa vào thành phần hóa học là một công cụ mạnh trong nhận diện thảo dược
và hoàn toàn có thể thực hiện khi thảo dược ở dạng dịch chiết. Tuy nhiên, nhược
điểm chung của các phương pháp hóa học là phụ thuộc vào thành phần hóa học của
cây mà thành phần này lại thay đổi rất nhiều tùy theo môi trường, điều kiện thu hái
và bảo quản. Phương pháp nhận diện thảo dược nhờ sử dụng công cụ sinh học phân
tử ra đời đã khắc phục được nhược điểm của các phương pháp phân tích hóa học.
Phân tử ADN tương đối bền vững và ít bị ảnh hưởng bởi môi trường do đó phương
pháp này đem lại một công cụ tiên tiến, chính xác và hiệu quả trong nhận diện thảo
dược.
Tại Việt Nam, việc ứng dụng công cụ sinh học phân tử trong nhận diện thảo
dược vẫn còn mới mẻ và có rất ít nghiên cứu sử dụng công cụ sinh học phân tử
trong nhận diện các thảo dược lưu hành trong nước. Do đó, đề tài này được thực
hiện với mục đích:
- Tìm hiểu nguyên tắc của các kĩ thuật sinh học phân tử được sử dụng để nhận
diện thảo dược.
- Bước đầu đánh giá ưu nhược điểm và khả năng áp dụng của từng kĩ thuật
sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược.

Chương 1. Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu và thực hành nhận diện thảo
dược
1.1. Sự cần thiết của việc nhận diện thảo dược
Nhận diện thảo dược là khái niệm liên quan đến việc xác định chính xác loài
dùng làm thuốc và phân biệt nó với các loài có thể gây nhầm lẫn hay giả mạo đồng
thời phát hiện nếu có sự có mặt của loài giả mạo. Việc nhận diện thảo dược là một
yêu cầu cấp thiết khi mà tình trạng giả mạo vẫn đang là một vấn đề nghiêm trọng
tồn tại trên thị trường dược phẩm thế giới. Sự giả mạo có thể là do vô tình khi dùng
nhầm lẫn các các thảo dược có tên hay kiểu hình tương tự nhau hay do người kinh
doanh cố tình giả mạo nhằm thu được lợi nhuận cao hơn. Tuy nhiên, dù là nguyên
nhân nào thì đều có thể dẫn đến hậu quả làm mất tác dụng điều trị và gây những tác
dụng không mong muốn nghiêm trọng, thậm chí là dẫn đến tử vong. Tại Mỹ, Trung
tâm chăm sóc sức khỏe California đã báo cáo về một trường hợp bị nhiễm độc do
dùng Clematis chinensis bị lẫn với Podophyllum emodi. Trong Podiphyllum emodi
có chứa podophyllotoxin là một hoạt chất có độc tính. Hậu quả trên bệnh nhân này
là bệnh lý trên thần kinh ngoại biên theo bệnh nhân đến suốt đời [41]. Ở Bỉ, trong
suốt giai đoạn 1990 - 1992, sự nhầm lẫn giữa một thảo dược có độc tính là
Aristolochia fangchi dùng thay thế cho Stephania tetrandra đã làm cho hơn 100 phụ
nữ bị suy thận [13]. Năm 2004, ở Hồng Kông có một báo cáo về độc tính do dùng
thảo dược mà nguyên nhân là do sự nhầm lẫn một thảo dược được kê trong đơn.
Bệnh nhân đã được kê Aristolochia mollissima thay vì Solanum lytatum. Trên thực
tế, hai loại thuốc này có nguồn gốc và tác dụng dược lý khác nhau, điểm chung duy
nhất là cùng có tên thông dụng là “Baimaoteng”. Sự nhầm lẫn này đã dẫn đến hậu
quả làm suy giảm chức năng thận và ung thư đường tiết niệu trên bệnh nhân [81].
Bên cạnh đó, năm 2004, ở Mỹ và các nước châu Âu như Hà Lan, Pháp, Tây Ban
Nha, các báo cáo về tình trạng ngộ độc ở trẻ em sau khi dùng một loại trà có nguồn
gốc từ Illicium verum không ngừng được tăng lên. Những trẻ bị ngộ độc thấy xuất
hiện tình trạng co giật, buồn nôn, bồn chồn, nhãn cầu chuyển động nhanh. Nguyên

nhân được xác định là do Illicium anisatum đã được dùng thay thế cho Illicium
verum khi sản xuất loại trà này [63]. Do những tác dụng không mong muốn nêu trên
nên việc nhận diện chính xác thảo dược đã và đang là một yêu cầu cấp thiết. Có
nhiều phương pháp đã được sử dụng trong nhận diện thảo dược từ đơn giản đến
phức tạp, từ các phương pháp truyền thống đến các phương pháp hiện đại. Phương
pháp nhận diện dựa vào hình thái là phương pháp đầu tiên được sử dụng, tiếp đó là
phương pháp vi học, phương pháp phân tích hóa học và phương pháp dựa vào công
cụ sinh học phân tử.
1.2. Các phương pháp thường được sử dụng trong nhận diện thảo dược
1.2.1. Phương pháp hình thái
Phương pháp hình thái là phương pháp dựa vào các đặc điểm hình thái tổng
quát để nhận diện cây thuốc và các bộ phận của nó. Phương pháp truyền thống yêu
cầu sử dụng hầu hết các giác quan (quan sát, sờ nắn, nếm, ngửi) để nhận biết một
dược liệu [81]. Đây là phương pháp đầu tiên được áp dụng trong nhận diện thảo
dược và cho đến nay vẫn đang được áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới.
Đối với một cây thuốc, các đặc điểm dùng để định danh bao gồm các đặc
điểm như: cây gỗ hay cây thảo, kích thước, hình dạng lá (ví dụ như mép lá có răng
cưa hay gợn sóng, lá chia thùy hay không chia thùy), đặc điểm cụm hoa (như dạng
chùm, bông, tán), đặc điểm hình thái học thực vật (như dạng bầu trên, bầu dưới hay
bầu giữa, hình dạng và số lượng nhị, số lượng lá noãn trong mỗi bầu và số lượng
hạt trong mỗi lá noãn) và đặc điểm của rễ bao gồm cấu trúc rễ và dạng rễ (như rễ
chùm, thân rễ hay thân hành) [63].
Đối với một dược liệu từ thực vật, những căn cứ quan trọng để nhận diện là
dựa vào hình thái, kích thước, màu sắc và đặc điểm về mùi vị [81]. Ví dụ như để
nhận diện được rễ của loài Ligusticum chuanxiong, Dược điển Trung Quốc 10 đã sử
dụng các đặc điểm hình thái, màu sắc, mùi vị để mô tả như sau: rễ có các mấu
không đều, đường kính 2 – 7 cm, bên ngoài có màu vàng nâu, thô ráp và khô lại, với


9m4WxygevK629TM

---