Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ của bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn tại hưng yên, khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh - pdf 27

Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối


MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 4
1.1.1. Nước ngoài 4
1.1.2. Trong nước 6
1.2. Tình hình dịch bệnh PED trên thế giới và ở Việt Nam trong những năm
gần đây 6
1.2.1. Tình hình dịch bệnh PED trên thế giới 6
1.2.2. Tình hình dịch bệnh PED ở Việt Nam 7
1.2.3. Tình hình PED trên địa bàn tỉnh Hưng Yên 7
1.3. Bệnh dịch tiêu chảy cấp tính ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED) 8
1.3.1. Phân loại 8
1.3.2. Hình thái, cấu trúc của PEDV 8
1.3.3. Đặc tính nuôi cấy của virút 9
1.3.4. Dịch tễ học 10
1.3.5. Triệu chứng lâm sàng 12
1.3.6. Bệnh tích 13
1.3.7. Các phương pháp chẩn đoán PEDV 14
Chương 2. NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 17
2.1. Nội dung nghiên cứu. 17
2.2. Nguyên liệu. 17
2.3. Địa điểm nghiên cứu. 17
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học 18
2.3.2. Khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh 18
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21
3.1. Một số đặc điểm dịch tễ của bệnh 21
3.1.1. Kết quả điều tra bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn theo lứa tuổi 21
3.1.2. Tỷ lệ tử vong do bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn theo lứa tuổi 29
3.1.3. Triệu chứng lâm sàng của bệnh 32
3.1.4. Kết quả mổ khám bệnh tích đại thể 35
3.2. Khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh 36
3.2.1. Kết quả chẩn đoán bệnh PED bằng phương pháp PT-PCR 36
3.2.2. Kết quả chẩn đoán bệnh PED phân theo lứa tuổi 38
3.2.3. Kết quả RT-PCR để nhân đoạn gen S của virus PED 40
3.2.4. Kết quả phân tích trình tự gen S của các chủng virus PED 42
3.2.5. Phân tích trình tự protein S (spike) của virus PED 45
3.2.6. Kết quả xây dựng cây phả hệ (phylogenetic tree) 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngành chăn nuôi ở nước ta hiện nay đang phát triển mạnh mẽ đáp ứng
nhu cầu thực phẩm ngày càng lớn của xã hội và góp phần thúc đẩy kinh tế xã hội
phát triển. Đặc biệt, chăn nuôi lợn đã có nhiều thay đổi đáng kể, đáp ứng được
phần lớn nhu cầu về thực phẩm cho xã hội. Ở nhiều nước trên thế giới, mức tiêu
thụ thịt lợn tính trên đầu người chiếm tỷ lệ cao so với các loại thịt khác. Ở Việt
Nam, tỷ lệ thịt lợn hơi tính theo đầu người chiếm phần lớn (khoảng 73%) trên
tổng số các loại thịt được tiêu thụ hàng năm. Chăn nuôi lợn đã trở thành nguồn
thu nhập quan trọng đối với các hộ nông dân và là một trong những nghề góp
phần chuyển dịch cơ cấu kinh tế trong nông nghiệp.
Hưng Yên là tỉnh có ngành chăn nuôi tương đối phát triển, hiện nay tổng
đàn trâu, bò có khoảng 40.000 con, đàn lợn trên 500.000 con, đàn gia cầm gần 8
triệu con và chăn nuôi của tỉnh ngày càng phát triển theo hướng sản xuất hàng
hóa, đem lại thu nhập chính cho ngành nông nghiệp.
Song song với sự phát triển đó, vấn đề về dịch bệnh diễn biến ngày càng
phức tạp làm ảnh hưởng xấu tới sự phát triển của ngành chăn nuôi cũng như làm
thiệt hại về kinh tế.
Trong những năm gần đây “bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn” thường
xuyên xảy ra làm thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn do làm tăng chi
phí phòng, chống bệnh, thiệt hại về số lượng…
Bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED) là một
bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc họ Coronaviridae
gây ra. Bệnh PED xảy ra quanh năm nhưng thường phổ biến hơn vào mùa đông và
trên 90% ca bệnh xảy ra ở lợn con dưới 7 ngày tuổi. Ở Châu Âu Dịch PED xuất
hiện lần đầu tiên vào năm 1971 (Wood, 1977), sau đó bệnh lây lan ra nhiều Quốc
gia khác ở Châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật, Hàn Quốc và Thái Lan.
Ở Việt Nam, bệnh PED lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008 và từ
đó đến nay dịch bệnh thường xuyên xảy ra và gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng
cho ngành chăn nuôi lợn trong cả nước. Việc phòng chống bệnh tiêu chảy do
virus PED gây ra chủ yếu dựa vào sử dụng vắc xin. Trong khi các chủng virus
thực địa thường xuyên có những biến đổi phức tạp về mặt di truyền, do đó việc
nắm bắt và cập nhật được các đặc tính sinh học của các chủng virus PED đóng
vai trò quan trọng, giúp cho việc lựa chọn được vắc xin thích hợp và hiệu quả
phục vụ cho công tác tiêm phòng.
Để hạn chế dịch bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn do virus PED gây ra thì
việc nghiên cứu về dịch tễ học, và nghiên cứu được những đặc tính sinh học phân
tử của virus PED là vô cùng quan trọng và là công việc nghiên cứu hết sức cần
thiết mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn to lớn để từ đó góp phần quan trọng
trong công tác phòng, chống dịch bệnh xảy ra trên đàn lợn và định hướng chiến
lược cho việc sản xuất vắc xin phòng bệnh trong tương lai. Vì vậy, xuất phát từ
yêu cầu của thực tiễn chúng tui tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ của bệnh tiêu chảy thành dịch ở
lợn tại Hưng Yên, khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu tổng quát
Xác định một số đặc điểm dịch tễ, sự phân bố của các type virus PED
đang lưu hành trên địa bàn tỉnh Hưng Yên để làm cơ sở đề xuất các biện pháp
phòng chống bệnh PED nhằm tạo điều kiện cho chăn nuôi phát triển bền vững.
2.2. Mục tiêu cụ thể
- Xác định một số đặc điểm dịch tễ của bệnh PED ở lợn trên địa bàn tỉnh
Hưng Yên:
+ Tỷ lệ mắc bệnh PED ở lợn theo lứa tuổi.
+ Tỷ lệ tử vong do mắc bệnh PED ở lợn theo lứa tuổi.
+ Một số triệu chứng lâm sang của bệnh PED.
+ Một số đặc điểm về bệnh tích của bệnh PED ở lợn.
- Xác định một số đặc tính sinh học phân tử của PEDV được phân lập tại
các ổ dịch trên địa bản tỉnh Hưng Yên:
+ Ứng dụng kỹ thuật RT- PCR trong chẩn đoán nhanh virus gây bệnh tiêu
chảy cấp ở lợn (PED)
+ Giải mã, phân tích gen S (gen mã hóa cho protein Spike) của các chủng
PEDV thu thập được trong các mẫu bệnh phẩm.
+ Xây dựng cây phả hệ (phylogenetic tree) để đánh giá về nguồn gốc tiến
hóa, sự biến đổi di truyền của các chủng PEDV thu thập được.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Cung cấp, hoàn thiện thêm các thông tin dịch tễ học về bệnh tiêu chảy
thành dịch ở lợn và đặc tính sinh học phân tử của virus.
- Dựa trên những kết quả nghiên cứu khoa học của đề tài để đề xuất
các biện pháp phòng, chống phù hợp, từ đó khuyến cáo tới người chăn nuôi
cũng như chính quyền địa phương triển khai áp dụng các biện pháp đồng bộ
trong việc phòng, chống bệnh trên địa bàn tỉnh giúp cho ngành chăn nuôi phát
triển ổn định.
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.1.1. Nước ngoài
Bệnh PED ở lợn lần đầu tiên được phát hiện ở Anh vào năm 1971 do virus
PED gây ra. Ban đầu virus PED được gọi là EVD (Epidemic viral diarrhea) gây
bệnh trên lợn con, đặc biệt là lợn mới sinh, có tỉ lệ gây chết lên tới 100%. Đến
năm 1976, một phân type mới của virus EVD được phát hiện trên lợn ở mọi lứa
tuổi, được gọi là virus EVD type 2 để phân biệt với virus EVD type 1 ban đầu
(Wood, 1977). Năm 1978, Debouck và Pensaert đã phát hiện virus EVD type 2 là
một dạng giống với coronavirus (Debouck and Pensaert, 1980), cũng từ thời gian
này, dịch EVD được chuyển tên thành dịch PED.
Trong khoảng thời gian từ năm 1980 tới 1990, các ổ dịch liên tục được
phát hiện và xảy ra phổ biến ở các Quốc gia Châu Âu như Bỉ, Anh, Đức, Pháp,
Hà Lan, Thụy Sỹ. Hiện nay, PED ngày càng xuất hiện phổ biến ở các Quốc gia
Châu Á, đặc biệt PED ngày càng trở nên cấp tính và nghiêm trọng hơn (Song and
Park, 2012). Ở Trung Quốc, trường hợp nhiễm PEDV đầu tiên được phát hiện
năm 1973, sau hơn hai thập kỷ sử dụng vaccine vô hoạt nhũ dầu, sự xuất hiện trở
lại của PEDV tương đối ít. Tuy nhiên đến năm 2010, bệnh đã xuất hiện trở lại và
bùng phát ngày càng trầm trọng ở các Tỉnh có sự phát triển ngành chăn nuôi lợn.
Từ tháng 2 năm 2010 đến tháng 11 năm 2011, tỷ lệ lợn chết từ 90 tới 100%
(tương ứng 50.000 con), chủ yếu là lợn dưới 7 ngày tuổi (Chen et al., 2012). Ở
Nhật, dịch PED xuất hiện lần đầu tiên năm 1993, gây chết 14.000 con, tỉ lệ chết
từ 30 tới 100% lợn con, dịch PED năm 1996 gây chết 39.509 con. Ở Hàn Quốc,
dịch PED xuất hiện đầu tiên năm 1992, sau đó đến năm 2007-2008, dịch liên tiếp
xuất hiện ở các Quốc gia Ðông Nam Á như Thái Lan, Philippines và Việt Nam.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, PEDV là một virus có vỏ ngoài, vật chất di
truyền là RNA dạng sợi dương có kích thước khoảng 28kb. Hệ gen bao gồm ít
nhất bảy khung đọc mở mã hoá cho 4 loại protein cấu trúc (gai(S), vỏ (E), màng
(M) và nucleocapsid (N)) và 3 loại protein không cấu trúc (replicase 1a, 1b và
ORF3), với thứ tự trên hệ gen 5’-replicase (1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3’(Bridgen et
al., 1993; Bridgen et al., 1998; Duarte and Laude, 1994. Để xác định mối quan hệ
giữa các chủng PEDV, các phân tích về cây phả hệ (phylogenetic tree) và đặc
điểm di truyền được tiến hành dựa trên các trình tự gen S, M, và ORF3 (Song
and Park, 2012). Nghiên cứu trên một phần của gen S và toàn bộ gen M đã gợi ý
chia PEDV thành 3 nhóm (G1, G2, và G3), mỗi nhóm cũng được chia thành các
nhóm nhỏ hơn (G1-1, G1-2, và G1-3) (Park et al., 2007). Phân tích cây phả hệ
dựa trên trình tự gen S và M đều chỉ ra rằng các chủng PEDV phân lập được ở
Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam có độ tương đồng cao và khác
biệt với các chủng PEDV phân lập được từ các Quốc gia Châu Âu (Do Tien Duy
et al., 2011; Puranaveja et al., 2009). ORF3 là gen mã hoá cho protein không cấu
trúc và là protein phụ trợ, không cần thiết cho quá trình nhân lên của PEDV. Tuy
nhiên các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra chức năng quan trọng của protein này
trong việc quyết định độc tính của PEDV. Sự biến đổi của gen ORF3 trong quá
trình cấy chuyển nhiều lần trên tế bào có thể làm giảm độc tính của chủng thực
địa. Sự khác biệt của gen ORF3 cũng được thể hiện rõ rệt giữa các chủng thực
địa và các chủng nuôi cấy trong phòng thí nghiệm.
Do các virus gây ra tiêu chảy có các đặc điểm lâm sàng tương đối giống
nhau nên không thể dựa vào các đặc điểm này để chẩn đoán PEDV, do đó việc
chỉ ra sự có mặt của PEDV được thực hiện trong các phòng thí nghiệm
(Kusanagi et al., 1992). Nhiều kỹ thuật được sử dụng trong việc phát hiện PEDV
như miễn dịch huỳnh quang, sử dụng kính hiển vi điện tử hay phản ứng ELISA
(Enzyme-linked immunosorbent assay), tuy nhiên các kỹ thuật này tiêu tốn nhiều
thời gian và độ nhạy cũng như tính đặc hiệu thấp. Kỹ thuật chẩn đoán dựa trên
phương pháp RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) được
phát triển để phát hiện virus cả trong phòng thí nghiệm và từ thực địa (Tobler and
Ackermann, 1995; Tobler and Ackermann, 1996). Để khẳng định sự có mặt của
PEDV trong mẫu bệnh phẩm, mồi đặc hiệu được thiết kết dựa trên trình tự gen
M. Trong những năm gần đây, dựa trên kỹ thuật RT-PCR cơ bản, đã có rất nhiều
những cải tiến để cho những ứng dụng hiệu quả hơn, như việc sử dụng multiplex
RT-PCR để phát hiện PEDV trong sự có mặt của nhiều virus khác nhau, là một kỹ
thuật thường được sử dụng cho chẩn đoán nhanh, độ nhạy và hiệu quả kinh tế cao trên
các đối tượng với các virus gây ra viêm ruột-dạ dày cấp tính ở lợn (Song et al., 2006).
RT loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) cũng là một kỹ thuật hữu
dụng được phát triển dựa trên kỹ thuật RT-PCR cơ bản. Trong kỹ thuật này, 4-6 mồi
được sử dụng để nhận biết 6-8 vùng DNA đích, điều này tạo ra tính đặc hiệu cao hơn
so với kỹ thuật gel-based RT-PCR hay ELISA bởi vì nó tạo ra số lượng lớn hơn các
đoạn DNA (Ren and Li, 2011). Các kit phân tích Immunochromatography cũng được
sử dụng phổ biến ở các trại chăn nuôi để phát hiện PEDV trên cơ sở protein S với độ
nhạy 92% và độ đặc hiệu 98%. Kỹ thuật này có độ chính xác kém hơn RT-PCR tuy
nhiên cho phép chẩn đoán nhanh trong vòng 10 phút (Song and Park, 2012).
1.1.2. Trong nước
Hiện nay ở Việt Nam, Nguyễn Đình Quát và cộng sự đã sử dụng phương
pháp nested-RT-PCR để phát hiện PEDV (Nguyen Dinh Quat et al., 2011) và
Nguyễn Tất Toàn và cộng sự đã nghiên cứu đặc tính di truyền của PEDV phân
lập được từ các Tỉnh Miền Nam Việt Nam (Nguyễn Tất Toàn et al., 2012). Ngoài ra
chưa có nghiên cứu nào về mức độ quy mô và chuyên sâu để đánh giá một cách có
hệ thống về đăc điểm dịch tễ và sự phân bố của các chủng PEDV đang lưu hành ở
Việt Nam hiện nay. Các kết quả nghiên của đề tài này sẽ là cơ sở khoa học quan
trọng trong việc khoanh vùng dịch, định hướng chọn chủng sản xuất vaccine, cũng
như góp phần đánh giá chất lượng vaccine nhập khẩu và sản xuất trong nước để từ
đó có chiến lược phòng chống dịch PED lâu dài ở Việt Nam.
1.2. Tình hình dịch bệnh PED trên thế giới và ở Việt Nam trong những năm
gần đây
1.2.1. Tình hình dịch bệnh PED trên thế giới
Từ đầu những năm 2000 trở lại đây, những trận dịch bùng phát cấp tính đã
trở nên hiếm có ở những vùng mà virus trước kia đã từng lan rộng. Hiện nay, các ổ
dịch PED ít được ghi nhận ở châu Âu và ngày càng có ít nghiên cứu về bệnh. Hơn nữa, bệnh thường được thấy nhất ở lợn choai, lợn trưởng thành và lợn mới sinh sản,
trong khi lợn con bú mẹ lại ít khi nhiễm bệnh. Tuy nhiên ở châu Á, dịch bệnh dữ dội
với tỷ lệ tử vong cao vẫn xảy ra ở lợn mọi lứa tuổi và không có sự khác biệt về mặt
lâm sàng với dịch TGE cấp tính, gây tổn thất nặng nề về kinh tế.
Trong thời gian cuối năm 2007 – 2008, tại Thái Lan, dịch phát hiện đầu
tiên ở tỉnh Nakornpathom trước khi nó lan rộng trong cả nước. Dịch lan rộng đã
gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn của Thái Lan. Phân tích phát sinh loài,
thấy tất cả các PEDV phân lập được trong thời gian bùng phát dịch đều giống
chủng ở Trung Quốc JS – 2004 – 2 (S.Puranaveja và cs, 2009).
1.2.2. Tình hình dịch bệnh PED ở Việt Nam
Năm 2008, virus PED đã được phát hiện trong một số đàn lợn bị tiêu chảy
ở Việt Nam (Nguồn: Báo Nông Nghiệp VN số 178 ra ngày 7/9/2011). Trong năm
2008 – 2009, bệnh lan rộng nhanh chóng ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ gây ảnh
hưởng lớn đến ngành chăn nuôi lợn nước ta. Bệnh xảy ra rất nhanh, trên toàn đàn
lợn và gây chết gần như 100% lợn con theo mẹ. Tỷ lệ tử vong giữa các tỉnh dao
động từ 65 – 91%. Theo nhận định của các chuyên gia thì nguyên nhân của tiêu
chảy cấp có thể là do bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) hay do viêm dạ dày
ruột truyền nhiễm (TGE) gây ra. Năm 2010, dịch vẫn tiếp tục xảy ra ở một số
trại, thậm chí tái phát ở những trại đã từng xảy ra dịch trong năm 2009. Theo
thống kê của phòng xét nghiệm nhanh công ty C.P Việt Nam trong 5 tháng đầu
năm 2010 cả nước có 31 trại bị nhiễm PED và tỉnh có nhiều ca bệnh nhất là
Đồng Nai với 15 ca bệnh. Các trại bị nhiễm bệnh này chủ yếu tập trung ở miền
Nam (Đồng Nai, Lâm Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Phước, Củ Chi), ở các
tỉnh ở miền Bắc thì phòng xét nghiệm nhanh chỉ mới ghi nhận có một trại bị
nhiễm bệnh này thuộc tỉnh Thái Nguyên.
Nhìn chung, bệnh chủ yếu xảy ra ở khu vực Nam Bộ với những trận dịch
lớn, tuy nhiên ở khu vực phía Bắc cũng đã xuất hiện rải rác ở 1 số trại tại các tỉnh
Thái Nguyên, Bắc Ninh, Bắc Giang…
1.2.3. Tình hình PED trên địa bàn tỉnh Hưng Yên
Trên địa bàn tỉnh Hưng Yên trong những năm gần đây bệnh vẫn xảy ra rải
rác, tập trung chủ yếu tại những địa phương có mật độ chăn nuôi lợn cao. Bệnh

nKN0UcfZ2GYG48V
Music ♫

Copyright: Tài liệu đại học © DMCA.com Protection Status