Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................................2
1.1. Đại cương về kháng sinh ........................................................................................2
1.1.1.Lịch sử nghiên cứu kháng sinh .......................................................................2
1.1.2. Định nghĩa kháng sinh ...................................................................................2
1.1.3. Phân loại kháng sinh .......................................................................................2
1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh ......................................................................3
1.1.5. Ứng dụng của kháng sinh ................................................................................4
1.1.6. Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh ..................................................4
1.1.7. Kháng sinh chống ung thư .............................................................................4
1.1.8. Khái niệm về tính kháng kháng sinh ...............................................................5
1.2.Đại cương về xạ khuẩn .............................................................................................5
1.2.1. Xạ khuẩnvà sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn ................................6
1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces ........................................................6
1.2.3.Phương pháp phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces...............................7
1.3.Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn ....................................................8
1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên ............................8
1.3.2. Đột biến cải tạo giống ......................................................................................8
1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn .................................................................................8
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ..........................................................................9
1.4.1.Các phương pháp lên men .............................................................................10
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ...........................................10
1.5.Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ................................................10
1.5.1.Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh ................................................11
1.5.2. Các phương pháp chiết tách ..........................................................................11
1.6.Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh .............................................................11
1.6.1.Phổ tử ngoại - khả kiến .................................................................................11
1.6.2.Phổ hồng ngoại .............................................................................................11
1.6.3. Phân tích khối phổ........................................................................................12
1.6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ........................................................................12
1.7. Sàng lọc gen hoạt hóa Streptomycesnâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh
........................................................................................................................................12
1.8. Quá trình tiến hoá của một Dps cảm ứng có tính thấm trong chi Streptomyces....13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................14
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị .....................................................................................14
2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................................14
2.1.2. Máy móc thiết bị ..........................................................................................16
2.2. Nội dung nghiên cứu..............................................................................................17
2.2.1.Chọn lọc, cải tạo giống .................................................................................17
2.2.2.Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu...........................................................17
2.2.3.Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được ...........................17
2.3. Phương pháp thực nghiệm .....................................................................................17
2.3.1.Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn....................................................................17
2.3.2.Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán.....................18
2.3.3.Chọn lọc ngẫu nhiên.....................................................................................18
2.3.4. Đột biến bằng UV ........................................................................................19
2.3.5.Phương pháp đột biến hóa học .....................................................................20
2.3.6. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh .............................................................21
2.3.7. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ...........................22
2.3.8. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng ....................22
2.3.9.Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay .........................................23
2.3.10.Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột ....................................................23
2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được..........................................24
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT .................................25
3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ..................................................................................25
3.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 .......................................................................25
3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 .......................................................................26
3.4. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3 .......................................................................27
3.5. Kết quả chọn môi trường lên men chìm .................................................................28
3.6. Kết quả chọn chủng lên men..................................................................................29
3.7. Kết quả chọn pH chiết.............................................................................................30
3.8. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi...........................................................31
3.9. Kết quả tách và tinh chế kháng sinh .......................................................................32
3.9.1. Kết quả sắc ký cột lần 1................................................................................32
3.9.2. Kết quả sắc ký cột lần 2 ................................................................................35
3.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết......................39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................40
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là một nước nhiệt đới nóng ẩm với nền kinh tế đang phát triển, nằm trong
khu vực có tỷ lệ bệnh nhiễm trùng cao nên nước ta có nhu cầu sử dụng kháng sinh rất lớn.
Do nhiều nguyên nhân, tình trạng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh ngày càng diễn
biến phức tạp và đang là mối lo ngại của cả xã hội, chúng ta đã và đang phải đối mặt với
“kỉ nguyên hậu kháng sinh”. Tuy nhiên, hầu hết các kháng sinh trên thị trường dược phẩm
trong nước vẫn còn được nhập ngoại dưới dạng nguyên liệu, bán thành phẩm hay thành
phẩm. Chính vì vậy, nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh nước ta
là: một mặt cải tiến các chất kháng sinh cũ và phát triển công nghệ sản xuất kháng sinh,
mặt khác phải thúc đẩy việc tìm ra kháng sinh mới. Đây là yêu cầu tất yếu và cấp thiết
trong công cuộc bảo vệ và chăm sóc sức khỏe nhân dân.
Trong các phương pháp sản xuất kháng sinh, bên cạnh tổng hợp và bán tổng
hợp, phương pháp phân lập kháng sinh từ xạ khuẩn vẫn là con đường quan trọng để tìm
được các chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh và từ đó phát hiện hoạt chất mới.
Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là từ
Streptomyces. Bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu và
bước đầu có kết quả với chi xạ khuẩn Streptomyces. Chính vì vậy, chúng tui lựa chọn đề
tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờStreptomyces156.11” làm
luận văn tốt nghiệp với các mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu cải tạo giống nâng cao năng suất sinh tổng hợp kháng sinh.
2. Lựa chọn môi trường và biến chủng thích hợp cho quá trình lên men.
3. Tách chiết và tinh chế để thu được kháng sinh tinh khiết.
4. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh.
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh
Chất kháng sinh (antibiotic) trước đây gọi là chất kháng khuẩn (antimicrobic) - là
thuốc được con người dùng chủ yếu để chữa các bệnh nhiễm khuẩn [21]. Cho đến nửa
sau thế kỷ XIX người ta đã xác định được vi sinh vật là nguyên nhân gây ra hàng loạt
các bệnh này. Do đó liệu pháp hoá học nhằm vào vi sinh vật gây bệnh trở thành liệu
pháp điều trị chính.
Năm 1928, nhà vi khuẩn học người Anh Alexander Flemming đã tình cờ phát hiện
hiện tượng nấm mọc trên đĩa và quanh tảng nấm đó là những vòng diệt khuẩn. Năm
1929, ông công bố penicillin trước công chúng.Năm 1938, Howara Walter Florey và
Ernst Boris Chaen đã chiết xuất được penicillin.Năm 1942, penicillin được áp dụng
vào điều trị.Ngay sau đó, penicillin đã trở thành một kháng sinh nổi tiếng vì đã cứu
sống hàng triệu chiến binh trong chiến tranh thế giới II.Từ những năm 1940 đến cuối
những năm 1960, nhiều kháng sinh mới được tìm ra và thời kỳ này được coi là một giai
đoạn vàng son của việc nghiên cứu kháng sinh. Năm 1944, streptomycin được phát
hiện từ vi khuẩn đất Streptomyces griseus[21].Sau đó đến chloramphenicol,
tetracycline, các kháng sinh nhóm macrolid và glycopeptides ... được tìm ra (tham
khảo phụ lục – hình 1.1). Việc cải tiến trong từng lớp kháng sinh tiếp tục thu được
nhiều kháng sinh phổ rộng hơn, hoạt tính kháng vi sinh vật cao hơn, như các kháng
sinh họ β – lactam... Cùng với việc tìm ra những kháng sinh mới, công nghệ lên men
sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện. Con đường tổng hợp và bán tổng
hợp cũng dần phát triển.
Việc phát hiện và phát triển kháng sinh của thế kỷ XX đã làm giảm đáng kể tỷ lệ tử
vong do nhiễm khuẩn. Song từ những năm 1980, những kháng sinh mới được phát hiện
và đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí quá lớn. Đồng thời, vi sinh vật nhanh kháng
thuốc và tốc độ đó lại nhanh hơn tốc độ tìm ra thuốc mới của con người. Vì vậy, việc
áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, kỹ thuật dung hợp tế bào, tái tạo gen... là rất
quan trọng để giúp con người tìm ra các chủng có HTKS cao và phát hiện các loại
kháng sinh mới [10].
1.1.2. Định nghĩa kháng sinh
Theo quan niệm truyền thống, kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được
từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm
hãm hay tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn,
nấm, nguyên sinh động vật, …) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp [3, 5].
Hiện nay, kháng sinh được định nghĩa là những chất có nguồn gốc vi sinh vật,
được bán tổng hợp hay tổng hợp hóa học. Với liều thấp có tác dụng kìm hãm hoặc
tiêu diệt VSV gây bệnh [1]
1.1.3. Phân loại kháng sinh
Kháng sinh có thể phân loại theo nhiều cách, theo nguồn gốc, theo cấu trúc hoá học,
theo cơ chế tác dụng, theo đích tác dụng...
Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học thường chia ra làm các nhóm chính sau đây
[1]:
1. Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin)
2. Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol)
3. Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin)
4. Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin)
5. Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin)
6. Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin)
7. Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)
8. Các kháng sinh nhóm antracyclin chống ung thư (daunorubicin)
9. Các kháng sinh nhóm actinomycin chống ung thư (actinomycin D).
1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Kháng sinh có một hay nhiều đích tác dụng trong tế bào vi sinh vật mẫn cảm, tuy
nhiên có thể khái quát thành 5 nhóm kháng sinh theo đích tác dụng chính (tham khảo
phụ lục – hình 1.2) [1].
1. Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn:β -lactam, vancomycin, bacitracin...
2. Thay đổi tính thấm màng tế bào chất: amphotericin, polymicin...
3. Ức chế tổng hợp acid nucleic: quinolon, rifampicin...
4. Ức chế hay thay đổi tổng hợp protein của vi khuẩn: chloramphenicol,
tetracyclin, macrolid...
5. Ức chế chuyển hóa: co-trimoxazol.
1.1.5. Ứng dụng của kháng sinh
Trong lĩnh vực y học:
- Kháng sinh được sử dụng rộng rãi, phổ biến để điều trị và phòng các bệnh
nhiễm khuẩn, ngoài ra còn điều trị ung thư, chống nấm.
Lĩnh vực khác:
- Trong chăn nuôi: Kháng sinh cũng được dùng để điều trị bệnh do vi sinh vật gây
ra trên động vật. Ví dụ: Griseoviridin dung điều trị bệnh viêm phổi cấp, viêm vú
của trâu bò...
- Trong trồng trọt: Kháng sinh có thể diệt nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh cho cây
trồng; ví dụ: Blastincidin, Validamycin...[3], [12]
1.1.6. Sơ đồ tổng quát quy trình lên men sản xuất kháng sinh
Các bước cơ bản trong quá trình lên men từ xạ khuẩn được thể hiện ở hình 1.3 phần
phụ lục. [3], [4], [8].
1.1.7. Kháng sinh chống ung thư
Ở sinh vật bậc cao, mỗi tế bào có chức năng nhất định được thực hiện trong mối tương
tác/liên hệ với các tế bào khác. Khi gặp điều kiện bất thường, tế bào mất liên hệ với các
tế bào xung quanh và phân chia không ngừng tạo thành cấu trúc khối u hay ung thư.
Ung thư được điều trị bằng một trong ba liệu pháp hay kết hợp các liệu pháp cùng
phẫu thuật để loại bỏ khối u, chiếu xạ để phá huỷ chọn lọc các tế bào ung thư hay hoá
trị. Nhiều chất hoá học dùng trong hoá trị liệu ung thư là sản phẩm bậc hai mà vi sinh
vật sinh ra do đó được gọi là kháng sinh chống/ kháng ung thư. Một số nhóm kháng
sinh đã được dùng trong điều trị ung thư là anthracycline, actinomycin, bleomycin... và
đạt được những kết quả khả quan.[16], [23]
1.1.8. Khái niệm về tính kháng kháng sinh
Kháng thuốc là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong một
thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu [22].
Hình 1.4: Vi khuẩn kháng kháng sinh
Có 2 kiểu kháng thuốc: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc mới nhận. Kháng thuốc
tự nhiên là đặc trưng của từng nòi sinh vật nhất định đối với một số kháng sinh nhất
định nào đó. Kháng thuốc mới nhận có thể do thay đổi tính thấm thành tế bào, do các
enzyme vô hiệu hóa kháng sinh, thay đổi phân tử đích hay do hoạt hóa các con đường
trao đổi chất thay thế khác mà hoạt chất không tác dụng. [5]
1.2. Đại cương về xạ khuẩn
1.2.1. Xạ khuẩn và sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria)có cấu tạo dạng sợi
phân nhánh. Chúng phân bố rộng rãi và đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí và
tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm. Tên xạ khuẩn bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp
KRfmzzHPhReLc5G
