Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 15
1.1. Các phương pháp nhận dạng cá thể người 15
1.1.1. Phương pháp hình thái học 16
1.1.2. Nhận dạng cá thể bằng các yếu tố có bản chất
protein
17
1.1.3. Nhận dạng cá thể người qua phân tích ADN nhân 19
1.1.4. Phương pháp phân tích ADN ty thể 20
1.2. ADN và các phương pháp phân tích đa hình ADN ứng
dụng trong nhận dạng cá thể người
22
1.2.1. Cấu trúc đa dạng trong trình tự ADN có ý nghĩa
trong nhận dạng cá thể
22
1.2.2. Kü thuËt phân tích ®a h×nh chiÒu dµi đoạn ADN
bằng enzym giíi h¹n
24
1.2.3. Phương pháp nhân bội ADN (PCR) 24
1.2.4. Kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR) 25
1.2.5. Kỹ thuật điện di 26
1.2.6. Kỹ thuật giải trình tự 28
1.3. Các locut STR trong hệ gen người và ứng dụng của
chúng trong nhận dạng cá thể
29
1.3.1. Khái niệm các đoạn lặp và STR 29
1.3.2. Cơ sở khoa học của phân tích STR trong nhận
dạng cá thể và xác định huyết thống
30
1.3.3. Cấu trúc của STR và danh pháp quốc tế 31
1.3.4. Vai trò của các STR trong phân tích hình sự 32
1.3.5. Vai trò của việc lựa chọn, phối hợp các locut
STR khác nhau trong xác định huyết thống
34
1.4. Tình hình nghiên cứu nhận dạng cá thể người bằng
phương pháp phân tích ADN trên thế giới và tại Việt Nam
35
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 35
1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 41
1.5. Các locut sử dụng trong nghiên cứu luận án 43
1.5.1. Các locut STR 43
1.5.2. Locut Amelogenin 45
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46
2.1. Đối tượng nghiên cứu 46
2.1.1. Mẫu sinh phẩm 46
2.1.2. Các locut đa hình STR và locut giới tính
Amelogenin
46
2.2. Thiết bị và hóa chất 46
2.2.1. Thiết bị 46
2.2.2. Hóa chất 47
2.3. Các phương pháp nghiên cứu 49
2.3.1. Thiết kế mồi 49
2.3.2. Tách chiết ADN 51
2.3.3. Phương pháp PCR đa mồi (multiplex PCR) 51
2.3.4. Phương pháp điện di và phân tích sản phẩm PCR 53
2.3.5. Phương pháp chế tạo thang alen 55
2.3.6. Phương pháp xác định trình tự các nucletotide 57
2.3.7. Khảo sát tần suất alen và xử lý số liệu bằng các
chỉ số thống kê
57
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 60
3.1. Thiết kế mồi và lựa chọn điều kiện PCR thích hợp cho
phức 4 locut F13A01, D8S1179, Amelogenin, HPRTB
60
3.1.1. Thiết kế mồi cho locut F13A01 60
3.1.2. Thiết kế mồi cho locut D8S1179 61
3.1.3. Thiết kế mồi cho locut HPRTB 61
3.1.4. Thiết kế mồi cho locut Amelogenin 62
3.1.5. Sàng lọc multiplex 63
3.1.6. Lựa chọn điều kiện PCR thích hợp cho phức 4
locut F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin
64
3.2. Khảo sát tần suất alen và đánh giá mức độ đa hình
của 15 locut STR ở quần thể người Việt (Kinh) bằng các
chỉ số thống kê.
74
3.2.1. Kết quả khảo sát tần suất alen 15 locut STR 74
3.2.2. Đánh giá tính đặc trưng quần thể và mức độ đa
hình của 15 locut STR
77
3.3. Chế tạo thang alen 4 locut F13A01, D8S1179,
Amelogenin, HPRTB
99
3.3.1. Kết quả chế tạo thang alen locut F13A01 99
3.3.2. Kết quả chế tạo thang alen locut D8S1179 102
3.3.3. Kết quả chế tạo thang alen locut Amelogenin 105
3.3.4. Kết quả chế tạo thang alen locut HPRTB 106
3.4. Đề xuất hướng ứng dụng các locut STR trong nhận
dạng cá thể và xác định huyết thống ở Việt Nam
109
3.5. Chế tạo bộ KIT và thử nghiệm phân tích 110
3.5.1. Chế tạo bộ kit nhân bội ADN phức 4 locut
F13A01, D8S1179, HPRTB, Amelogenin.
110
3.5.2. Phân tích xác định kiểu gen cá thể 111
3.5.3. Phân tích xác định huyết thống 115
KẾT LUẬN 118
KIẾN NGHỊ 120
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ
LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
121
TÀI LIỆU THAM KHẢO 122
PHỤ LỤC
MỞ ĐẦU
Lịch sử phát triển của khoa học hình sự chuyển biến sang một bước
ngoặt mới kể từ sau phát hiện của Jeffreys – năm 1985 về khả năng ứng dụng
của các đoạn ADN đa hình trong nhận dạng cá thể người và đặc biệt là sau
phát minh của Kary Mullis - nhà Hóa học người Mỹ về phản ứng PCR vào
năm 1985. Đến nay, sau gần 30 năm phát triển, giám định ADN hay giám
định gen đã thực sự trở thành công cụ đắc lực trong điều tra hình sự với sự
phát hiện và ứng dụng rộng rãi của hàng loạt các locut đa hình có số lượng
các đoạn lặp khác nhau trên thế giới.
Các locut được sử dụng chủ yếu hiện nay là các đoạn ADN có trình tự
lặp lại từ 4 đến 5 nucleotit được gọi là các trình tự lặp lại ngắn liên tiếp (Short
Tandem Repeat - STR) [23, 25]. Các STR có thể dễ dàng được nhân bội bằng
phương pháp PCR, đồng thời số lượng đoạn lặp trong STR rất đa dạng ở các
cá thể nên tạo ra nhiều tổ hợp khác nhau. Hiện nay, nhiều phòng thí nghiệm
khác nhau trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu khảo sát hàng loạt các locut
STR nhằm lựa chọn những locut thích hợp đặc trưng cho mỗi quần thể đồng
thời cũng lựa chọn công nghệ phân tích phù hợp đối với điều kiện cụ thể của
nước mình. Năm 1994, Sở KHHS Anh đã nghiên cứu phát triển bộ phức thế
hệ thứ nhất (bao gồm 4 locut) và bộ phức thế hệ thứ hai (bao gồm 6 locut đa
hình và 01 locut giới tính) với khả năng trùng lặp khoảng 1/50 triệu [23, 26].
Năm 1996, Cục điều tra liên bang Mỹ (FBI) đã tài trợ cho việc lựa chọn thành
lập các locut “chủ đạo” STR (gọi tắt là CODIS) nhằm sử dụng cho CSDL
nhận dạng ADN quốc gia. Bộ này bao gồm 13 locut STR với khả năng trùng
lặp khoảng 1/1012 [23, 24]. Nhiều quốc gia khác trên thế giới cũng đã nghiên
cứu, phát triển ứng dụng các locut dựa trên công nghệ phân tích phù hợp với
điều kiện của nước mình [36, 41, 44, 49, 57, 59, 60, 66, 77, 87].
Tại Việt Nam từ năm 1998 đã có sự phát triển mạnh mẽ và nhanh
chóng về trình độ cũng như khả năng ứng dụng kỹ thuật phân tích ADN trong
nhận dạng cá thể, giám định huyết thống nói chung và trong giám định hình
sự nói riêng. Từ những nghiên cứu về các locut đơn lẻ ban đầu mang tính chất
thăm dò như nghiên cứu của Nguyễn Văn Lợi [9], Lê Đình Lương [11], Phạm
Hải Sáng [13], Trần Thị Quỳnh Trang [15] … đến nay đã có một số phòng thí
nghiệm đã ứng dụng thành công công nghệ phân tích ADN trong hình sự và
nhận dạng cá thể người, giám định huyết thống sử dụng các hệ thống thiết bị
phân tích hiện đại với các bộ kit của nước ngoài [6, 8, 14, 92]. Việc sử dụng
các bộ kit cho kết quả phân tích chính xác. Tuy nhiên không phải cơ sở nào
cũng có thể thực hiện được vì đòi hỏi trang bị máy móc công nghệ hiện đại
với chi phí cao đồng thời phụ thuộc nhiều vào các bộ kit sẵn có.
Trước thực tế đó, từ năm 2001 đến nay, Viện Kỹ thuật Hoá học, Sinh
học và Tài liệu nghiệp vụ, Tổng cục Hậu Cần - Kỹ thuật - Bộ Công an đã
nghiên cứu chế tạo thành công một số bộ thang alen chỉ thị và các bộ kit phân
tích đơn gen, 3 gen ứng dụng trong phân tích 12 locut đa hình STR sử dụng
công nghệ điện di nhuộm bạc [2-5, 9]. Việc xây dựng các bộ thang alen chỉ
thị có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong xác định một cách chính xác tần suất
alen quần thể người Việt đối với mỗi locut STR. Tần suất alen các locut khảo
sát đặc trưng cho quần thể người Việt là công cụ hỗ trợ đắc lực trong tính toán
độ tin cậy của mỗi ca giám định. Các kết quả nghiên cứu đã giúp chủ động về
công nghệ và hiện nay đã và đang được ứng dụng tốt trong trong phân tích
gen hình sự tại một số cơ sở giám định các đơn vị công an địa phương như Hà
Nội, Hải Phòng, Thanh Hóa, Cần Thơ, Khánh Hòa...
Tuy nhiên, nếu chỉ dừng ở phân tích 12 locut thì thực tế cho thấy trong
nhiều trường hợp cụ thể, đặc biệt là với những ca giám định phức tạp (như
giám định xác định tội phạm có nhiều nghi can mà những người này lại có
quan hệ huyết thống, họ hàng...) khó cho kết quả tin cậy. Trong những trường
hợp này, số locut được sử dụng để giám định thường từ 16 đến 24 locut [30,
35, 79].
Từ thực tế nêu trên, chúng tui nhận thấy việc mở rộng nghiên cứu để
tăng số lượng locut đang sử dụng là yêu cầu cần thiết. Hơn nữa cần có sự
đánh giá tổng thể về tính đa hình và khả năng ứng dụng của các locut STR đối
với quần thể người Việt (Kinh). Mỗi quần thể có đặc trưng phân bố tần suất
alen riêng đối với mỗi locut, có những locut thể hiện tính đa hình rất cao ở
quần thể này nhưng lại thấp đối với quần thể khác. Từ việc đánh giá đó, có
thể đưa ra được hướng ứng dụng của các locut này trong nhận dạng cá thể
phù hợp với quần thể người Việt. Do vậy, chúng tui tiến hành nghiên cứu đề
tài luận án “Nghiên cứu một số locut đa hình STR ở người Việt Nam nhằm sử
dụng trong khoa học hình sự, nhận dạng cá thể và xác định huyết thống” với
các mục tiêu sau :
1. Thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu để nhân bội và phân tích được tính đa
hình 03 locut STR (F13A01, D8S1179 và HPRTB) nhằm bổ sung vào bộ
các locut sử dụng trong nhận dạng cá thể ở người Việt (Kinh).
2. Khảo sát, xác định được tần suất phân bố các alen thuộc 15 locut STR ở
người Việt (Kinh), gồm D5S818, D7S820, D13S317, CSF1PO, TH01,
TPOX, D16S539, D3S1358, vWA, F13B, FES/FPS, LPL, F13A01,
D8S1179 và HPRTB.
3. Xây dựng được thang alen chuẩn cho 03 locut F13A01, D8S1179, HPRTB
và locut giới tính Amelogenin.
4. Đánh giá được mức độ đa hình và đề xuất được hướng ứng dụng của 15
locut STR trong truy nguyên cá thể và xác định huyết thống tại Việt Nam.
* NỘI DUNG CHÍNH CỦA LUẬN ÁN
Các nội dung nghiên cứu chính của luận án gồm có:
1. Thiết kế và thử nghiệm các cặp mồi PCR đặc hiệu cho từng locut STR
chọn lọc (F13A01, D8S1179, HPRTB) để phối hợp được với locut xác
định giới tính Amelogenin trong cùng phản ứng.
2. Nghiên cứu lựa chọn thành phần và điều kiện phản ứng PCR thích hợp áp
dụng cho phức 4 cặp mồi F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin và
điện di phân tích phức 4 locut trên gel polyacrylamide biến tính.
3. Khảo sát tần suất phân bố alen và đánh giá tính đa hình thuộc 15 locut
STR ở người Việt (Kinh), gồm D5S818, D7S820, D13S317, CSF1PO,
TH01, TPOX, D16S539, D3S1358, vWA, F13B, FES/FPS, LPL, F13A01,
D8S1179 và HPRTB.
5. Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị cho 4 locut F13A01, D8S1179,
HPRTB và Amelogenin.
6. Đề xuất hướng ứng dụng 15 locut STR trong nhận dạng cá thể và xác định
huyết thống tại Việt Nam.
* Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIẾN
1. Nghiên cứu bổ sung bốn locut F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin
kết hợp với các locut đã được nghiên cứu có ý nghĩa vô cùng quan trọng
trong việc:
- Tăng độ chính xác trong phân tích nhận dạng cá thể và xác định huyết
thống.
- Chủ động về công nghệ phân tích ADN phù hợp với điều kiện Việt
Nam, đáp ứng kịp thời nhu cầu giám định của các địa phương trong cả
nước.
2. Số liệu khảo sát tần suất alen của các 15 locut đa hình STR cho quần thể
người Việt (Kinh) có ý nghĩa quan trọng, được sử dụng để tính toán độ tin
cậy của các ca giám định nhận dạng cá thể và huyết thống ở Việt Nam.
3. Nghiên cứu chế tạo thành công thang alen chỉ thị cho 3 locut F13A01,
D8S1179 và HPRTB đảm bảo độ chính xác cao trong giám định cá thể và
xác định huyết thống.
* ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1. Nghiên cứu xây dựng được điều kiện thích hợp để phân tích tổ hợp 4
locut đa hình mới F13A01, D8S1179, HPRTB và Amelogenin có thể
nhân bội đồng thời trong cùng một phản ứng. Bổ sung cho các tổ hợp
locut đã nghiên cứu, góp phần làm tăng độ chính xác trong phân tích
nhận dạng cá thể người và giám định huyết thống phù hợp với điều
kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam.
2. Bổ sung số liệu khảo sát tần suất alen 15 locut đa hình người Việt
(Kinh), trong đó đã khảo sát mới 07 alen của locut F13A01, 06 alen của
locut HPRTB, 06 alen cuả locut F13B, 08 alen của locut FES/FPS và
05 alen của locut LPL; phát hiện thêm được 02 alen mới ở quần thể
người Việt (Kinh) là alen số 8 của locut CSF1PO, alen số 13 của locut
vWA.
3. Xây dựng được 04 bộ thang alen chỉ thị cho các locut F13A01,
D8S1179, HPRTB và Amelogenin sử dụng trong phân tích kiểu gen cá
thể đảm bảo độ chính xác cao.
4. Đánh giá được khả năng ứng dụng của 15 locut STR đối với quần thể
người Việt (Kinh) trong nhận dạng cá thể và xác định huyết thống tại
Việt Nam.
* BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN
Luận án gồm 134 trang (chưa gồm 41 trang phụ lục), được bố cục gồm
5 phần: mở đầu 5 trang; tổng quan 31 trang; vật liệu và phương pháp nghiên
cứu 14 trang; kết quả và thảo luận 58 trang; kết luận, kiến nghị 03 trang.
Ngoài ra có 01 trang liệt kê danh mục các công trình khoa học đã công bố.
* NƠI THỰC HIỆN LUẬN ÁN
Luận án được thực hiện tại Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học và Tài
liệu nghiệp vụ - Tổng cục Hậu cần Kỹ thuật - Bộ Công an.


/file/d/0B7oUCI ... sp=sharing

---