Download miễn phí Đề tài Kỹ thuật gen trong sản xuất vaccin DNA - Kỹ thuật gen trong sản xuất DNA Vaccin viêm gan B
PHẦN I: MỞ ĐẦU 1
III. ĐẶT VẤN ĐỀ. 1
IV. MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI 2
PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2
V.I. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2
1. Miễn dịch 3
2. Vaccin. 4
2.1 Khái niệm Vaccin. 4
2.2 Các vaccin được chế tạo từ vi khuẩn 4
2.3 Các vaccin được chế tạo từ virus 4
2.4 DNA vaccin 5
3. Công nghệ sản xuất DNA vaccin 5
3.1 DNA vaccin. 5
3.2 Công nghệ sản xuất. 6
3.2.1 Thiết kế DNA nguồn 6
3.2.2 Kiểm tra độ tinh sạch của các mẫu DNA, RNA thu được 8
3.2.3 Chọn vector tách dòng (cloning vector) 9
3.2.4 Tạo vector tái tổ hợp. 11
3.2.5 Biến nạp nhân tạo vector tái tổ hợp vào tế bào chủ 11
3.2.6 Sàng lọc và kiểm tra sự biểu hiện gen 12
4. Một số ứng dụng của công nghệ sản xuất vaccin DNA_DNA vaccin HBV. 13
4.1 Những hiểu biết về virus viêm gan B (HBV) 13
http://s1.liketly.com/flash/edoc/web-viewer.html?file=jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-demo-2017-08-02-de_tai_ky_thuat_gen_trong_san_xuat_vaccin_dna_ky_thuat_gen_t_V3lYKy7Kfv.png /tai-lieu/de-tai-ky-thuat-gen-trong-san-xuat-vaccin-dna-ky-thuat-gen-trong-san-xuat-dna-vaccin-viem-gan-b-93631/ Để tải tài liệu này, vui lòng Trả lời bài viết, Mods sẽ gửi Link download cho bạn ngay qua hòm tin nhắn. Ket-noi - Kho tài liệu miễn phí lớn nhất của bạn
Ai cần tài liệu gì mà không tìm thấy ở Ket-noi, đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
rở thành 1 ngành khoa học được phát triển cao và chiếm một vị trí đặc biệt quan trọng trong y học và sinh học. Kể từ khi có những phát kiến đầu tiên của Pasteur về vaccin, lịch sử miễn dịch học đã được dệt nên những phát minh to lớn mang dấu ấn thời đại, thúc đẩy sự phát triển nhanh chóng của nhiều lĩnh vực của sinh học và y học. Những phát minh về vaccin thế hệ mới là một điểm sáng, DNA vaccin là một ứng dụng của công nghệ DNA có nhiều ưu việt.
MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI
Xuất phát từ cách đặt vấn đề trên và kết hợp với yêu cầu của đề tài, em đã tiến hành tham khảo và tổng kết những vấn đề có liên quan đến việc nghiên cứu :
“Kỹ thuật gen trong sản xuất vaccin DNA- Kỹ thuật gen trong sản xuất DNA vaccin viêm gan B”.
PHẦN II
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
I. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Miễn dịch
Miễn dịch là trạng thái bảo vệ đặc biệt của cơ thể chống lại các yếu tố gây bệnh (VSV, độc tố VSV, các phân tử lạ,..) khi chúng xâm nhập vào cơ thể.
Tuỳ theo tính chất miễn dịch mà người ta chia ra miễn dịch bẩm sinh hay miễn dịch tiếp thu.
a) Miễn dịch bẩm sinh (tự nhiên):
Chủ yếu là miễn dịch không đặc hiệu có sẵn từ khi sinh ra mang tính di truyền trong các cá thể cùng loài. Nhiều loài động vật không mắc bệnh của người và ngược lại.
- Ví dụ: Gà không mắc bệnh than trâu, bò không mắc bệnh giang mai và thương hàn của người.
b) Miễn dịch tiếp thu:
Miễn dịch tiếp thu
Miễn dịch thụ động
Miễn dịch chủ động
Tự nhiên:
- Truyền kháng thể ghép hay qua sữa mẹ
Nhân tạo:
aTruyền kháng huyết thanh
Nhân tạo:
- Tiêm vaccin hay truyền lympho bào hay lympho miễm dịch
Tự nhiên:
- Tiếp xúc ngẫu nhiên với kháng nguyên hay dị kháng nguyên
2. Vaccin.
2.1 Khái niệm Vaccin.
Miễn dịch chủ động được tạo thành bởi kháng nguyên của các VSV hay độc tố của chúng khi được sử dụng-đó chính là vaccin.
Một số vaccin sau lần tiêm đầu tiên gây ra đáp ứng, tuỳ từng trường hợp vào khả năng đáp ứng miễn dịch nhanh hơn và ở mức độ cao hơn.
Một số vaccin gây đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, chẳng hạn như vaccin BBC, phòng bệnh lao. Sau khi tiêm đủ các mũi cơ bản, miến dịch sẽ duy trì ở mức cao trong nhiều tháng, nhiều năm và cho dù lượng kháng thể có thể giảm xuống nhưng cơ chế miễn dịch ở nhiều trường hợp vẫn rất nhạy cảm giúp cơ thể có thể đáp ứng rất nhanh khi tiếp xúc lại với mầm bệnh.
Vaccin có thể được tạo từ vi khuẩn, virus hay độc tố của chúng hay được tái tổ hợp từ các kháng nguyên đặc hiệu (Ricombinant Vax) hay từ các gen tổng hợp nên kháng nguyên đặc hiệu (DNA vaccin)
2.2 Các vaccin được chế tạo từ vi khuẩn
Các vaccin vi khuẩn bất hoạt là vaccin chứa toàn bộ vi sinh vật đã bị bất hoạt, như vaccin ho gà, vaccin thương hàn tiêm hay chỉ chứa các kháng nguyên đặc hiệu của vi khuẩn như vaccin chống phế cầu, não mô và Hemophilus influenza týp b. Một số vaccin bất hoạt có các tá chất làm tăng cường đáp ứng kháng thể. Đó là các tá chất như Phosphat hay hydroxyt nhóm trong của các vaccin hấp phụ chống bạch hầu-uốn ván.
Vaccin sống giảm độc lực như vaccin BCG, thương hàn uống.Vaccin được chế tạo từ độc tố của vi khuẩn đã được làm giảm độc lực như vaccin bạch hầu, uốn ván,
2.3 Các vaccin được chế tạo từ virus:
Các vaccin chứa toàn bộ virus: Vaccin bại liệt, vaccin chống viêm gan A, vaccin chứa các kháng nguyên đặc hiệu như vaccin cúm, vaccin viêm gan B,.
Vaccin virus sống giảm độc lực gồm các vaccin sởi, quai bị, thuỷ đậu, bại liệt (sabin), các vaccin này kích thích đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào tạo ra kháng thể lâu bền chỉ sau một liều dùng.
Vaccin tái tổ hợp: với sự tiến bộ không ngừng của sinh học phân tử và các cải tiến liên tục nhằm tạo ra các vaccin an toàn,có hiệu quả cao. Các công ty sản xuất vaccin đã đổi mới công nghệ và sản xuất các vaccin tái tổ hợp chỉ lựa chọn các doạn gen có tính quyết định kháng nguyên cao, sau đó cấy vào vi sinh vật có khả năng tăng sinh nhanh và nhiều để sản xuất, các gen này tạo ra một vaccin tái tổ hợp có độ tinh khiết và tính sinh miễn dịch cao. Các vaccin tái tổ hợp đang được sử dụng phổ biến trên thtị trường là vaccin viêm gan B tái tổ hợp,....
2.4 DNA vaccin
Là một plasmid đơn bao gồm một Promotor, một trình tự cloning site cho gen quan tâm một đuôi PolyA được dùng như một trình tự kết thúc, một điểm Ori khởi đầu cho tái bản, một gen chỉ thị như là gen kháng ampicilin.
DNA vaccin cũng có thể là một DNA trần hay là có vỏ nước hay là có vỏ là Lipid.
3. Công nghệ sản xuất DNA vaccin
3.1 DNA vaccin.
DNA vaccin xuất hiện vào khoảng năm 1990 là một ứng dụng mới của công nghệ DNA.
DNA vaccin là một plasmid kỹ thuật chứa những gen mã hoá protein cho những đáp ứng miễn dịch cần thiết. không giống như virus hay vi khuẩn sống DNA vaccin không lây nhiễm hay sao mã tạo virus mới không tổng hợp các protein khác ngoài những gen xác định trong plasmid. Vì vậy ưu điểm nổi bật của DNA vaccin là tính an toàn cao.
Như đã nêu trên, cấu tạo DNA vaccin không đơn giản, nó gồm có:
- 1 promotor.
- Một trình tự cloning site phù hợp với các gen quan tâm.
- Một đuôi Poly A làm trình tự kết thúc.
- Một điểm Ori khởi đầu cho quá trình sao chép.
- 1 gen chỉ thị như gen kháng ampicilin.
Một điều thú vị khác ở DNA vaccin là không cần một cách đặc biệt để đưa plasmid vaccin vào cơ thể động vật nói chung và con người nói riêng, có thể miễn dịch với bệnh mà chỉ đơn giản bằng cách tiêm dung dịch muối trong đó có các plasmid lơ lửng trong dung dịch, và sự sản sinh của plasmid trong tế bào đích một cách dễ dàng, như nghiên cứu đầu năm 1994 các nhà nghiên cứu đã xác định có 5 cách cho sự sinh sản plasmid influenza virus trong cơ thể động vật: bơm qua mũi họng, tiêm vào bắp, ven, dưới da, hay bằng bắn gen. Tất cả các kỹ thuật đó đều được đáp ứng miễn dịch.
Thêm vào đó sự triển khai có hiệu quả của plasmid làm cho DNA vaccin có lợi thế là kích thích cả miễn dịch của kháng thể trung gian (có liên quan đến B-lymphocytes) và tế bào miễn dịch trung gian (liên quan đến T-lymphocytes). Bởi vì DNA của vaccin mã hoá protein và giải phóng khỏi tế bào, thể thực bào tiếp nhận cho sự sản sinh kháng thể của tế bào B-lymphocytes. Cùng lúc, một số protein gắn vào bề mặt của tế bào đích và kích thích sự đáp ứng của tế bào T-lymphocytes. Và sau đó, khi mầm bệnh xuất hiện những kháng thể và T-lymphocytes đã sẵn sàng sử dụng để trung hoà protein của mầm bệnh và tiêu diệt mầm bệnh.
DNA đã được thử nghiệm bảo vệ chống lại chuỗi influenza Salmonella typhi, sự truyền nhiễm HIV,.
3.2 Công nghệ sản xuất.
3.2.1 Thiết kế DNA nguồn
a) Mục đích của thiết kế DNA nguồn là tạo được :
- DNA tạo kháng nguyên
- Promotor
- Trình tự kết thúc
- Gen chỉ thị (resistant-marker gen: ampicilin) bằng cách tách chiết và tổng hợp nhân tạo (nếu gen đã biết trình tự).
b) Cách tiến hành:
P Phân lập và tách chiết DNA tổng số từ Vi sinh vật
+ Nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện thích hợp để vi khuẩn phát triển ở pha lỏng (pha này phải đảm bảo 1ml có 106-108 tế bào).
+ Lấy 100ml: ly tâm với vận tốc 5000 vòng/phút, trong 10 phút, để lấy cặn tế bào.
+ Phá vỡ màng tế bào:
- Để cặn VSV ở nhiệt độ -850C trong 30 phút
-Nghiền tế bào trong N2 lỏng -860C (làm cứng tế bào dễ nghiền) + EDTA (Etylen Diamin Tetracaetic Acid) hấp thụ các iôn Mg2+ làm vỡ thành tế bào, đồng thời ức chế các enzym nucleaza.
hay
- Đun sôi 15 phút
- Ủ cặn tế bào với enzyl lysozyme để phân huỷ màng tế bào
+ Loại bỏ protein và RNA
-Ủ dung dịch đã phá màng tế bào với dung dịch RNase, protease ở nhiệt độ 370C khoảng 1-2 giờ.
- Để tách protein ta thêm vào hỗn hợp một dung dịch có tỷ lệ:
isoamyl:ancohol:clorophoc = 2:4:1.
-Kết tủa protein bằng cách ly tâm siêu tốc trong máy ly tâm lạnh
+Thu DNA
-Hoà trong cồn tuyệt đối ở nhiệt độ 0-40C.
-Ủ trong 30 phút ở 40C kết tủa DNA
-Ly tâm lạnh 12000-14000 vòng/phút trong 10 phút.
-Bỏ dịch trong lấy kết tủa.
-Rửa kết tủa DNA trong cồn 700.
-Ly tâm lại sẽ thu được DNA có thể sử dụng ngay hay cho thêm nước khử ion giữ ở -200C có thể sử dụng trong 1-2 tháng
P Phân lập và tách chiết mRNA từ VSV
Quy trình tương tự như DNA, nhưng khi sau khi loại protein khỏi dịch thì ủ với enzym DNase để loại DNA
Tách bằng sắc ký ái lực trên cột oligoT-cellulose. Do cấu trúc của phân tử mRNAcó đuôi Poly A:
- Sử dụng các viên bi từ có gắn oligoT trên bề mặt.
- Khi mRNA bám vào bề mặt các viên bi từ do liên kết bổ xung với oligoT
- Ly tâm thu được các viên bi và tách được riêng mRNA
3.2.2 Kiểm tra độ tinh sạch của các mẫu DNA, RNA thu được
a) Xác định độ tinh sạch và hàm lưọng bằng quang phổ từ ngoại
P Xác định hàm lượng
+ Do DNA hấp thụ tia tử ngoại ở bước sóng = 260nm đo được các chỉ số khúc xạ.
+ Dựa vào chỉ số khúc xạ để tính hàm lượng DNA và RNA trong 1ml mẫu. Ví dụ chỉ số OD260nm=1 ta có kết quả:
- DNA mạch kép có 50mg/ml.
- DNA mạch đơn có 33mg/ml.
- RNA có 40mg/ml
Nên một cách tổng quát ta có:
CDNA kép=50 Ađộ pha loãng
CRNA =50Ađộ pha loãng
P Xác định độ tinh sạch
+ Xác định DNA hấp thụ ánh sáng phát triển nhất ở = 260nm
+ Protein hấp thụ ở 260-280nm.
Do vậy ta có tỷ lệ
Trong đó: y là độ tinh sạch
-Nếu y có giá tr...
