Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định tạp pha trong Artesunat nguyên liệ bằng phương pháp HPLC

Download miễn phí Đồ án Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định tạp pha trong Artesunat nguyên liệ bằng phương pháp HPLC





Cách 3 [26]: phương pháp phương trình hồi quy ở nồng độ gần nồng độ giới hạn theo dự tính. Pha 5 mức dung dịch ở 5 nồng độ liền kề với nồng độ giới hạn định lương ước tính, tiến hành sắc ký ghi kết quả, thành lập phương trình tuyến tính từ các kết quả trên dạng y = ax + b (y là đáp ứng pic, x là nồng độ dung dịch).

 Ở mức nồng độ thấp nhất làm 5 lần và tính độ lệch chuẩn của các kết quả(s), giới hạn tín hiệu phát hiện sẽ là:y = 3s + b. Từ phương trình hồi quy và phương trinh tính giới hạn tín hiệu phát hiện tính ra nồng độ giới hạn phát hiện: xlod = 3s/a và nồng độ giới hạn định lượng: xloq = 10xloq/3

Cách 4 [24]: Tiến hành sắc ký, ghi sắc ký đồ. Xác định độ nhiễu đường nền ở vùng thời gian lưu của chất nghiên cứu từ sắc ký đồ của mẫu trắng. Giới hạn tín hiệu định lượng bằng 10 lần độ nhiễu đường nền. Từ đó suy ra giới hạn định lượng bằng cách so sánh giới hạn đinh lượng với đáp ứng của dung dịch có nồng độ rất thấp.

 





Để tải tài liệu này, vui lòng Trả lời bài viết, Mods sẽ gửi Link download cho bạn ngay qua hòm tin nhắn.

Ket-noi - Kho tài liệu miễn phí lớn nhất của bạn


Ai cần tài liệu gì mà không tìm thấy ở Ket-noi, đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí

Tóm tắt nội dung tài liệu:


chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu 2 (Ê 0,5%).
Nhận xét: Phương pháp tiến hành khá phức tạp, kết quả còn phụ thuộc chủ quan và chưa cho kết quả xác định chính xác hàm lượng tạp.
b. Phương pháp của Dược Điển Quốc Tế (volume 5) [19]: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Cột: (12,5´3mm; 5mm).
Pha động: Acetonitril R: Đệm pH3 (50:50)
Tốc độ dòng: 0,6ml/phút.
Nhiệt độ: 30oC
Thể tích tiêm: 20ml.
Dung dịch A: 4mg/ml Artesunat nguyên liệu.
Dung dịch C: 0,04mg/ml Artesunat nguyên liệu.
Tiêm 20 ml dung dịch A ghi kết quả.
Tiêm 20 ml dung dịch C ghi kết quả.
Diện tích của bất kỳ pic nào trên sắc ký đồ của dung dịch A trừ pic chính không được lớn hơn diện tích pic chính trên sắc ký đồ của C (Ê 1%).
Không được có hơn một pic có diện tích lớn hơn 1/2 diện tích pic chính của C (> 0,5%).
Tổng diện tích các pic tạp (bỏ qua pic có diện tích nhỏ hơn hoăc bằng 0,1% diện tích pic chính của C) không lớn hơn 2 lần diện tích của pic chính của C (< 2 %).
Nhận xét: Phương pháp đã thừa nhận đáp ứng pic của DHA và Artesunat là như nhau khi hàm lượng bằng nhau.
3. Tổng quan về phương pháp HPLC.
3.1. Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao [6].
a. Khái niệm về sắc ký: Sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp. Sự tách các thành phần trong mẫu dựa vào sự phân bố khác nhau vào hai pha, là pha động và pha tĩnh. Pha tĩnh có thể là chất rắn hay chất lỏng phủ trên nền chất rắn. Pha rắn được nhồi trong cột hay tráng trên bản mỏng hay dàn thành film. Pha động là khí hay chất lỏng. Sự tách là do hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ.
b. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao: HPLC là một phương pháp phân tách sắc ký dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha không trộn lẫn với nhau. Trong đó, pha động là chất lỏng được đẩy qua pha tĩnh trong cột dưới áp lực cao của một bơm cao áp. Sắc ký lỏng dựa trên cơ sở là cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hoá học ở bề mặt.
3.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký [11].
Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kỹ thuật nhất định. Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất lỏng có tính chất phân bố thì ta có sắc ký phân bố. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion.
Để kéo chất phân tích ra khỏi cột tách chúng ta sử dụng một pha động.
Ví dụ: Nếu ta nạp một mẫu gồm 3 chất là A, B, C vào cột tách thì khi bơm pha động qua cột tách các quá trình sắc ký xẩy ra, khi đó A, B, C tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột tách. Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là tổng của các tương tác:
Tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh (F1).
Tương tác giữa chất phân tích và pha động (F2).
Tương tác giữa pha tĩnh và pha động (F3).
Theo sơ đồ sau:
Chất phân tích
A, B, C
F2
F1
Pha động
Pha tĩnh
F3
Trong đó tương tác F1 và F2 đóng vai trò quyết định.
3.3. Cơ sở lý thuyết sắc ký.
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố chất tan giữa hai pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột. Tuỳ theo bản chất pha động, pha tĩnh, chất tan mà quá trình rửa giải tách được các chất ra khỏi cột. Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ được phát hiện và ghi dưới dạng pic. Tín hiệu của cả quá trình sắc ký cho ta sắc ký đồ. Một sắc ký đồ sẽ có một hay nhiều pic phụ thuộc vào thành phần mẫu.
3.4. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống săc ký.
a. Hệ thống bơm:
Bơm được xem là một trong những thành phần quan trọng nhất của hệ thống sắc ký. Bơm đẩy dung môi qua hệ thống với một tốc độ hằng định.
* Có hai loại bơm: + Một là bơm áp suất hằng định, ít được áp dụng.
+ Hai là bơm tốc độ dòng hằng định, loại bơm này được áp dụng cho phân tích HPLC thông thường.
b. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi.
Bình chứa dung môi thường bằng thuỷ tinh đôi khi bằng thép không gỉ. Cần lọc loại các hạt trong dung môi (0,45mm) và đuổi khí hoà tan trong dung môi. Trong phương pháp thông thường chỉ cần một bình dung môi. Trong phương pháp gradien cần tới 2, 3, 4 bình chứa các dung môi.
c.Hệ tiêm mẫu:
Để đưa mẫu vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay) hay microsyringe tiêm trong hệ tiêm mẫu tự động.
d. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký. Vì ở cột sẩy ra quá trình tách các chất. Cột đóng vai trò rất quan trọng tới khả năng tách các chất. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hoá chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Trong cột nhồi pha tĩnh của hệ sắc ký. Cột tách có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ theo mức độ và mục đích của quá trình sắc ký. Một cách đại cương có thể chia ra 3 loại cột:
- Cột tách phân tích: dài 10-25 cm, đường kính 2-5mm.
- Cột bán điều chế: dài 50 – 100 cm, đường kính 5 – 10cm
- Cột tách điều chế: dài 100 – 150 cm, đường kính 10 - 50cm
e. Detector trong HPLC.
Là bộ phận phát hiện các chất trong pha động từ cột sắc ký đi ra liên tục. Đó là bộ phận thu nhận, phát hiện các chất hay hợp chất của chúng dựa theo một tính chất hoá lý nào đó của chất phân tích. Thường có các loại Detector sau:
- Detector UV- VIS.
- Detector huỳnh quang.
- Detector phổ phát xạ nguyên tử.
- Detector điện hoá, cực phổ.
- Detector đo thế.
- Detector đo độ dẫn điện
- Detector khúc xạ kế.
f. Bộ phận ghi tín hiệu: gồm có Recorder, Computer.
3.5. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng [1], [18], [21].
a. Thời gian lưu và thể tích lưu (Retention time).
- tR và VR = tR´Fc (Fc là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian).
tR là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ.
vR là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ.
tR và VR là các đại lượng phản ánh sự phân bố của chât tan vì vậy hai đại lượng này phụ thuộc vào: Tính chất pha tĩnh, bản chất pha động, tốc độ dòng, tính chất chất tan, nhiệt độ,..
b. Hệ số phân bố K.
K = k.Cs/Cm
Cs và Cm là nồng độ chất tan ở pha tĩnh và pha động tương ứng, k là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột. K chỉ phụ thuộc vào: Bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ.
K lớn thì tRlớn (ra muộn).
K nhỏ thì tR nhỏ (ra sớm).
c. Thừa số dung lượng K’.
K’ =
+ tR là thời gian lưu.
+ td là thời gian chết.
K’phụ thuộc: Bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm cột: Vs / Vm.
K’ càng lớn tốc độ di chuyển càng thấp.
Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tich sao cho: 1Ê K’ Ê 8.
Nếu K’ < 1 thì pic ra sớm dễ lẫn với pic tạp.
Nếu K’ > 8 thì thời gian phân tích sẽ quá dài.
d. Tốc độ di chuyển tỉ đối của hai chất.
Được đánh giá qua thừa số chọn lọc (selectivity-factor).
a =
Để tách riêng hai chất thường chọn a = 1,05 - 2,0. Nếu a càng lớn 2 chất tách nhau càng tốt, a nhỏ 2 chất khó tách nhau, nhưng a quá lớn thì thời gian phân tích sẽ quá dài. Giá trị a phụ thuộc yếu tố quyết định t’RA và t’RB.
e. Độ phân giải (Resolution).
Là đại lượng đo mức độ tách 2 chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B).
RS =
Như vậy Rs phụ thuộc vào:
+ Hiệu lực cột.
+ Thừa số chon lọc a.
+ Thừa số dung lượng K’B.
Rs tối ưu ³ 1,5.
Có thể làm tăng Rs bằng cách:
Tăng N: Tăng chiều dài cột, giảm tốc độ dòng, cách này ít hiệu quả.
Tăng K’B: Thay đổi pha động làm Rs thay đổi lớn.
Tăng a: Thay đổi pha động hay pha tĩnh sẽ làm Rs thay đổi lớn.
f. Hệ số bất đối AF.
AF =
b= một nửa w ở phía sau pic.
a= một nửa w ở phía trước pic.
W là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
Yêu cầu AF = 0,9 - 2.
Vai trò: AF càng gần 1 thì pic càng có dạng phân phối chuẩn Gauss nên kết quả tính diện tích pic càng chính xác.
- Yếu tố ảnh hưởng:
Cột: Cột tốt AF sẽ tốt.
pH: quyết định dạng tồn tại của chất tan từ đó có ảnh hưởng nên AF.
Thể tích tiêm
- Cách cải thiện AF:
Chọn cột thích hợp.
Điều chỉnh pH để chất tan tồn tại ở một dạng thích hợp.
Thể tích tiêm thích hợp.
g. Số đĩa lý thuyết N.
N=
Số đĩa lý thuyết cho biết hiệu lực cột. Khi phân tích yêu cầu N ³ 3000. Từ công thức ta thấy N phụ thuộc vào tR và W (độ rộng đáy pic).
tR càng lớn thì N có thể sẽ tăng, tuy nhiên thời gian phân tích kéo dài.
W hay W1/2 (độ rộng pic đo ở 1/2 chiều cao) càng bé thì N càng lớn nhưng WB và W1/2 sẽ bé hơn nếu tR bé.
Khi tR cố định thì bản chất cột, pha động, tốc độ, pH là yếu tố quyết định trong đó cột đóng một vai trò rất quan trọng.
Để đánh giá hiệu lực cột thường tính số đĩa lý thuyết trên một đơn vị chiều dài cột.
N=
Khi các điều kiện khác là cố định thì cột nào có N lớn hơn cột đó có hiệu lực cao hơn.
3.6. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký.
a. Lựa chọn ...

Music ♫

Copyright: Tài liệu đại học ©