Download miễn phí Khóa luận Nghiên cứu xây dựng qui trình nhân gíông vô tính cây lựu (Punica granatum. L)
Toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro luôn luôn được tiến hành trong điều kiện vô trùng. Vì vậy, điều kiện vô trùng là một trong những yếu tố quan trọng nhất, quyết định sự thành bại của nuôi cấy in vitro. Nguyên liệu để nuôi cấy in vitro được lựa chọn từ những cá thể ưu tú của loài, khỏe mạnh và sạch bệnh, nhưng ít nhiều có nhiễm vi sinh vật và nấm tùy thuộc và sự tiếp xúc của chúng với môi trường xung quanh. Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là rất cần thiết và quyết định sự thành công của cả quá trình này. Phương pháp thông dụng nhất hiện nay để loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi vật liệu cấy là sử dụng các hóa chất có hoạt tính diệt nấm và khuẩn. Chất khử trùng cần đảm bảo diệt nấm, vi khuẩn., nhưng lại phải ít độc hay không gây hại đối với mãu cấy. Chất khử trùng hiệu quả thông dụng hiện nay là HgCl2. Khả năng tiêu diệt nấm phụ thuộc vào nồng độ và thời gian xử lý. Ở thí nghiệm này, chúng tui sử dụng HgCl2 để khử trùng mẫu với nồng độ 0,07 và 0,1% trong các khoảng thời gian 5; 8;10; 15 phút.
http://s1.liketly.com/flash/edoc/web-viewer.html?file=jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-demo-2016-02-05-khoa_luan_nghien_cuu_xay_dung_qui_trinh_nhan_giong_vo_tinh_c_pAxaVk1Xzg.png /tai-lieu/khoa-luan-nghien-cuu-xay-dung-qui-trinh-nhan-giong-vo-tinh-cay-luu-punica-granatum-l-87529/ Để tải tài liệu này, vui lòng Trả lời bài viết, Mods sẽ gửi Link download cho bạn ngay qua hòm tin nhắn. Ket-noi - Kho tài liệu miễn phí lớn nhất của bạn
Ai cần tài liệu gì mà không tìm thấy ở Ket-noi, đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
ô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn (Murashige, 1930)[30]. Morel (1966)[28] là người đầu tiên đã thành công trong việc tái sinh và nhân nhanh giống lan quí Cymbidium bằng phương pháp này. Trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được hàng triệu cá thể, nhờ vậy mà hoa Cymbidium vốn đắt tiền đã có giá thành hạ hơn và đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng của nhiều người. ở Thái Lan 90% lan thương mại được nhân bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Thành công đối với họ Orchidaceae không những chỉ là bằng chứng mà còn mở đường cho việc ứng dụng kỹ thuật này đối với các loài cây khác như cây ăn quả, cây lương thực, cây lâm nghiệp, cây thuốc, cây cảnh.... Cúc ở Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, đặc biệt ở Hà Lan sử dụng phương pháp này cho hệ số nhân giống cao từ 410-1010/năm (Nguyễn Xuân Linh, 1988). Các lĩnh vực ứng dụng khác của phương pháp này cũng mang lại nhiều kết quả trong việc cải tạo và phục tráng giống cây trồng.
Qúa trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là kết quả của các qúa trình phân hoá và phản phân hoá. Tất cả các tế bào trong các cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hoá để đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hoá tế bào . Còn quá trình phản phân hoá thì ngược lại với qúa trình phân hoá, có nghĩa là tế bào đã phân hoá thành mô chức năng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia.
Các qúa trình trên có thể tóm tắt như sau:
Phân hoá tế bào
Tế bào dãn
Tế bào phôi sinh
Tế bào chuyên hoá
Phản phân hoá
tế bào
Ví dụ : khi nuôi cấy mảnh lá hay đốt thân cây thuốc lá, ở điều kiện môi trường thích hợp các tế bào đã phân hoá của lá, đốt thân sẽ phản phân hoá, phân chia trở lại thành mô sẹo không còn là tế bào có chức năng như tế bào lá, đốt thân nữa. Nếu chuyển sang môi trường khác thì tuỳ theo thành phần môi trường mà các tế bào mô sẹo có thể phân hoá theo các hướng khác nhau (hình thành rễ, chồi hay tạo cây hoàn chỉnh...)
Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro
Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp. Cụ thể là:
Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc.
Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao. Điều này có ý nghĩa rất lớn với cây thuốc nói chung, đặc biệt đối với các cây trồng để chiết lấy hoạt chất.
Tạo được cây có genotip mới( đa bội, đơn bội).
Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen.
Phục tráng giống thông qua kỹ thuật cấy đỉnh sinh trưởng và cải tạo giống bằng kỹ thuật gen.
Có khả năng sản xuất quanh năm.
Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hay hạt nẩy mầm kém.
Hệ số nhân giống cực kỳ cao (thường đạt được ở các loài cây khác nhau trong phạm vi từ 36 – 1012/ năm), rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà.
Nếu xét về phương diện hệ số nhân thì nhân giống in vitro là phương pháp không gì có thể sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Chỉ tính riêng lĩnh vực true - to – type, nuôi cấy in vitro có thể coi là một cuộc đại cách mạng về hệ số nhân. Thí dụ: sử dụng chồi nách để nhân có thể tạo ra hàng chục vạn cây D.floribunda trong vòng một năm (Chaturvedi, Sinha, 1979; Phạm Văn Hiển và cs, 1988)[5] hay 26 vạn cây cam thảo trong 5 tháng (Shah, Dalal, 1980)[35] từ một lát cắt ban đầu mà thông thường 1 cây D.floribunda chỉ tạo ra 8 – 10 cây trong một năm, và cam thảo chỉ cho 5 – 7 cây nếu nhân giống bằng cành. Từ một củ giống khoai tây trong thời gian 8 tháng, người ta thu được 2000 củ đồng nhất di truyền, trồng được trên một vùng 40ha, có nghĩa là tốc độ nhân giống >100 000 so với sinh sản hữu tính (Senez, 1987). ở Việt nam, Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ só nhân 532 trong vòng 1 năm đối với khoai tây bằng phương pháp này[12]. Đặc biệt, cây cọ dầu thường phải mất 10 – 15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới rất khó khăn. Bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được 500 000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Starisky, 1970)[36]. Whitehead và Giles (1977) dự tính hàng năm có hể thu được 106 cây giống khi nuôi cấy chồi của Popolus nigra, P.yannanensis và con lai của Popolus.
Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hay khó nhân giồng bằng các phương pháp khác (Nickell, 1973)[33]. Ngoài ra, phương pháp này còn có những bất lợi sau:
Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao, nhưng cây con có kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm.
Cây có thể có những đặc tính không mong muốn.
Khả năng tạo đột biến có thể tăng.
Khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền callus hay huyền phù tế bào nhiều lần.
Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt.
Tuy vậy phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng rãi để phục vụ những mục đích sau:
Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quí hiếm làm vật liệu cho công tác chọn giống.
Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây cảnh và cây dược liệu thuộc nhóm cây thân thảo.
Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quí của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thẫn gỗ,
Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus.
Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài giao phấn trong ngân hàng gen.
Kỹ thuật nuôi cấy in vitro
Có thể chia thành các bước sau:
Lựa chọn đối tượng (cây trồng, giống, bộ phận cây) thích hợp.
Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy mô, tế bào thực vật có thể là bất cứ bộ phận nào của cây: các đoạn của rễ, thân, các phần của lá (cuống lá, phiến lá...), các cấu trúc của phôi như lá mầm, trụ trên, trụ dưới lá mầm, hạt phấn, noãn.. thậm chí cả mẩu thân ngầm hay cơ quan dự trữ dưới mặt đất (củ, căn hành..) cũng được dùng cho nuôi cấy.
Khử trùng mẫu và tiến hành nuôi cấy
Nguyên liệu để nuôi cấy in vitro được lựa chọn từ những cá thể ưu tú của loài, khoẻ và sạch bệnh virus, nhưng ít hay nhiều đều có nhiễm vi sinh vật và nấm tuỳ từng trường hợp vào sự tiếp xúc của chúng với môi trường xung quanh. Có một số bộ phận như phôi trong hạt, mô trong quả, đòng lúa non ... ít bị nhiễm vi sinh vật hơn các bộ phận khác của cây, ngược lại các bộ phận nằm dưới mặt đất như rễ, củ, thân ngầm, có lượng vi khuẩn và nấm rất cao. Phương pháp thông dụng nhất hiện nay để loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi vật liệu cấy là sử dụng các hoá chất có hoạt tính diệt khuẩn và nấm.
Tác nhân khử trùng, ngoài tác dụng diệt vi sinh vật còn ảnh hưởng đến mô cấy, vì vậy việc lựa chọn loại hoá chất phải căn cứ vào mức độ nhiễm khuẩn và độ mẫn cảm của từng mẫu. Trong số các hoá chất hay được sử dụng để khử trùng thì canxi hypoclorit và natri hypoclorit là hay được sử dụng hơn cả vì đặc tính của chúng: có độc tính thấp đối với mô được xử lý, không gây ức chế sinh trưởng và hiệu quả diệt khuẩn tốt. Nồng độ của canxi hypoclorit và natri hypoclorit hay được sử dụng là 5 – 15% và 0,5 – 2% trong thời gian từ 15 – 30 phút.
Xác định điều kiện nuôi cấy(môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng) để điều khiển quá trình phát triển mô nuôi cấy theo định hướng.
Thành công của phương pháp nuôi cấy in vitro phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy. Nhu cầu dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu của các loài là không giống nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một cơ thể cũng ít nhiều có sự khác nhau (Murashige và Skoog, 1962). Sự lựa chọn môi trường nuôi cấy, bao gồm cả chất lượng và số lượng hoá chất sử dụng đóng vai trò quyết định đối với bản thân sự phân hoá và chiều hướng phân hoá của tế bào.
Cho đến nay đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: Môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Linsmainer và Skoog (1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974)... Đây là những môi trường cơ bản và sẽ được cải tiến thành nhiều loại môi trường khác nhau cho phù hợp với mỗi đối tượng nghiên cứu và mục đích thí nghiệm. Trong số đó môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số các loài thực vật và chính Murashige (1974) đã dùng môi trường này để nuôi cấy nhiều loại cây trồng.
Thành phần chủ yếu của tất cả các loại môi trường gồm những nhóm chất sau: muối khoáng đa lượng và vi lượng (muối chloride, nitrat, sulphat, phosphat và iodid của Ca, Mg, K, Na, Fe, Mn, Zn và B), vitamin, nguồn cacbon, yếu tố sinh trưởng hữu cơ (axit amin, pepton), hormon sinh trưởng.
Đường là một thành phần không thể thiếu trong bất cứ môi trường nuôi cấy nào. Nó được sử dụng làm nguồn cacbon cung cấp năng lượng chủ yếu trong môi trường nuôi cấy nhiều loài thực vật (Hu et al., 1979)...
