Download miễn phí Khóa luận Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính hoắc hương (Pogostemon cablin) bằng phương pháp in vitro



MỞ ĐẦU 1
Mục đích - yêu cầu của đề tài 1
PHẦN I 3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu khái quát về cây hoắc hương 3
1.1.1. Đặc điểm thực vật học 3
1.1.2. Phân bố, thu hái và chế biến 3
1.1.3. Thành phần hoá học 4
1.1.4. Công dụng và liều dùng 4
1.2. cách nhân giống cây trồng 5
1.2.1. Nhân giống hữu tính (bằng hạt) 5
1.2.2. Nhân giống vô tính 6
1.2.3. Nhân nhanh vô tính in vitro 6
1.2.3.1. Cơ sở lý luận của nuôi cấy in vitro 7
1.2.3.2. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro 7
1.2.3.3. Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy 9
1.2.3. 4. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 9
1.2.3.5. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 11
1.2.3.6. Quy trình nhân giống in vitro 11
1.2.3.7. Nghiên cứu nhân giống hoắc hương 14
PHẦN II 15
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. Đối tượng nghiên cứu 15
2.2. Nội dung nghiên cứu 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu 18
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu 18
2.3.2. Bố trí thí nghiệm 19
2.3.2.1. Các chỉ tiêu theo dõi. 19
2.4. Phương pháp sử lý số liệu 20
PHẦN III 21
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21
3.1. Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu 21
3.2. Giai đoạn tạo cụm chồi 23
3.2.1. Ảnh hưởng của BAP tới sự tạo chồi cây hoắc hương 23
3.2.2. Ảnh hưởng của kinetin tới sự tạo chồi của cây hoắc hương 25
3.3. Giai đoạn nhân nhanh 27
3.3.1. Ảnh hưởng của BAP và - NAA tới sự tạo chồi cây hoắc hương 28
3.3.5. Ảnh hưởng của nồng độ đường 30
3.4. Giai đoạn ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh 32
3.4.1. Ảnh hưởng của - NAA đối với qúa trình tạo rễ cây hoắc hương. 32
3.4.2. Ảnh hưởng của IBA đối với qúa trình tạo rễ cây hoắc hương 35
3.5. Chuyển cây ra bầu 36
PHẦN IV 40
KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ ĐỀ NGHỊ 40
4.2. Tồn tại: 40
4.3. Đề nghị: 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO 41
 


http://s1.liketly.com/flash/edoc/web-viewer.html?file=jh2i1fkjb33wa7b577g9lou48iyvfkz6-demo-2016-02-05-khoa_luan_nghien_cuu_xay_dung_quy_trinh_nhan_giong_vo_tinh_h_IqntcH0Gyt.png /tai-lieu/khoa-luan-nghien-cuu-xay-dung-quy-trinh-nhan-giong-vo-tinh-hoac-huong-pogostemon-cablin-bang-phuong-phap-in-vitro-87657/


Để tải tài liệu này, vui lòng Trả lời bài viết, Mods sẽ gửi Link download cho bạn ngay qua hòm tin nhắn.

Ket-noi - Kho tài liệu miễn phí lớn nhất của bạn


Ai cần tài liệu gì mà không tìm thấy ở Ket-noi, đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí

Tóm tắt nội dung tài liệu:

phát triển thành 1 cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Thực tế đã chứng minh khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn (Murashige, 1980) [16].
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là kết quả của các quá trình phân hoá và phản phân hoá. Tất cả các tế bào trong các cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Sự chuyển hoá tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hoá đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hoá tế bào. Còn quá trình phản phân hoá thì ngược lại, có nghĩa là tế bào đã phân hoá thành mô chức năng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia.
1.2.3.2. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro
Ngày nay, người ta sử dụng 2 cách nhân giống chủ yếu là nuôi cấy mô phân sinh và nuôi cấy mô sẹo.
* Nuôi cấy mô phân sinh
Mô phân sinh bao gồm đỉnh chồi, đỉnh cành, đỉnh rễ
Đặc điểm của mô phân sinh là chứa các tế bào trẻ, phân chia mạnh, lại không bị virút xâm nhập. Vì vậy, mô phân sinh là mô duy nhất của cây sạch virut [11].
Để nuôi cấy mô phân sinh, có thể dùng môi trường White, Murashige và Skoog (1962), Gamborg có bổ sung thêm vitamin, đường, các phytohoocmon.
Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng trong các trường hợp:
- Tạo ra những giống cây sạch virút từ những giống bị bệnh (phục tráng giống)
- Nhân giống in vitro.
- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan.
* Nuôi cấy mô sẹo
Mô sẹo là khối tế bào phát sinh vô tổ chức và có hình dạng không nhất định với màu vàng, trắng hay hơi xanh.
Mô sẹo được hình thành từ các mô đỉnh sinh trưởng hay nhu mô và nuôi cấy trên môi trường giàu Auxin.
Nguyên liệu để tạo mô sẹo là các phần non của cây, được đưa vào nuôi cấy trên các môi trường MS, Gamborg và cần thiết thêm các chất thuộc nhóm Auxin [3].
Nuôi cấy mô sẹo được ứng dụng trong nhiều trường hợp:
- Nhân giống in vitro ở những loài thực vật mà phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ít có hiệu quả hay không thực hiện được.
- Làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhận các chất có hoạt tính sinh học
- Làm nguyên liệu cho chọn dòng tế bào : đột biến, chọn dòng chịu mặn
- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan.
1.2.3.3. ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy
Mẫu dùng trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật có thể là bất cứ mô, cơ quan nào của cây như: Chồi bên, phiến lá, cuống lá Các cấu trúc phôi như lá mầm, các cơ quan tương tự như củ, căn hành.
Kiểu gen là yếu tố quyết định tất cả các giai đoạn sinh trưởng trong quá trình nuôi cấy in vitro. Bên cạnh đó, kích thước, nguồn gốc và tuổi sinh lý của mẫu nuôi cấy cũng có ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của mô. Chồi đỉnh có khả năng sinh trưởng tốt hơn các mô có nguồn gốc từ chồi nách [8]. Mô lấy từ cây non có khả năng tái sinh cao hơn các mô lấy từ cây trưởng thành [7,11].
1.2.3. 4. ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
Thành công của nuôi cấy mô - tế bào phụ thuộc rất nhiều vào sự lựa chọn môi trường dinh dưỡng, bao gồm cả số lượng và chất lượng hoá chất sử dụng. Nhu cầu dinh dưỡng cho sinh trưởng tối ưu của các loài thường rất khác nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một cơ thể cũng có ít nhiều sai khác (Murashige and Skoog, 1962)[15].
Cho đến nay hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng nhân tạo đã được xây dựng và thử nghiệm có kết quả như môi trường MS (Murashige and Skook, 1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Vacxin and Went trong đó môi trường MS được đánh giá phù hợp nhất với nhiều loại thực vật.
* Các chất vô cơ chứa nitơ: Được bổ sung vào môi trường dưới dạng 2 dạng: nitrat (NO3-) và amon (NH4+) làm nguồn nitơ. Hầu hết các môi trường đều có lượng nitrat nhiều hơn amon và thường dùng ở nồng độ 25mM nitrat với 2 – 20mM amon [11].
* Carbon và nguồn năng lượng: Vì các mô nuôi cấy không hoàn toàn tự dưỡng nên việc bổ sung đường là cần thiết [8].
Nguồn cacbon được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô tế bào là saccharose. Glucose và các loại đường khác thường cùng kiệt hiđratcarbon đối với cây [8].
* Vitamin: Hầu hết các tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cần thiết nhưng không đầy đủ về số lượng. Để mô có sức sinh trưởng tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin. Trong đó, thiamin (Vitamin B1) được sử dụng rộng rãi nhất. Các vitamin khác, đặc biệt là nicotinic acid (Vitamin B3), Pyridoxine (Vitamin B6) và canxipantothenate (Vitamin B5), biotin cũng được dùng để nâng cao sức sinh trưởng [7].
* Chất điều hoà sinh trưởng: Hiệu quả tác động của các chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ sử dụng và hoạt tính vốn có của nó, đồng thời phụ thuộc vào bản chất của mẫu nuôi cấy.
Chất điều hoà sinh trưởng là thành phần quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy, từ những chất này người ta có thể chủ động điều khiển quá trình phát sinh hình thái của thực vật in vitro.
Các chất điều hòa sinh trưởng gồm 2 nhóm chính là Auxin và Cytokinin:
- Auxin kích thích hình thành mô sẹo, rễ bất định và sự giãn tế bào; chúng được sử dụng với nồng độ 10-1 – 10-6M tùy theo từng chất (2.4 – D, IAA, NAA, IBA) [7].
- Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, 2iP) những hoocmon này liên quan đến sự phân chia tế bào, phân hoá chồi từ mô sẹo hay từ cơ quan [18]. Cytokinin sử dụng với nồng độ 10-7 – 10-4M. Tỷ lệ Auxin/Cytokinin quyết định sự phân hoá mô theo hướng tạo rễ, chồi hay mô sẹo.
* Chất dinh dưỡng hữu cơ: Một số hỗn hợp dinh dưỡng phức tạp gồm những chất không xác định như nước dừa, cốt dừa cà chua, chuối, khoai tây cũng được sử dụng để làm tăng sự phát triển của callus hay cơ quan của cây.
* Agar: Đối với nuôi cây tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có thể bị chìm và sẽ chết vì thiếu oxy. Để khắc phục hiện tượng này, môi trường nuôi cấy được làm đặc bằng agar, một loại tinh bột được chế từ rong biển và mô được cấy trên bề mặt của môi trường, agar được sử dụng với nồng độ từ 0,6 đến 1%.
* Độ pH: Độ pH của môi trường được điều chỉnh từ 5,5 đến 6,5 trước khi khử trùng. Nhìn chung, nếu pH cao sẽ làm môi trường bị cứng và nếu <5 thì agar khó đông.
1.2.3.5. ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
* Nhiệt độ: Nhiệt độ trong các phòng nuôi cấy in vitro thường được duy trì ở 25 ± 20C. ở nhiệt độ này, đa số thực vật nuôi cấy đều sinh trưởng, phát triển tốt.
* ánh sáng: ánh sáng có ảnh hưởng mạnh đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy. Sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy phụ thuộc nhiều vào chu kỳ, cường độ, thành phần quang phổ ánh sáng (Read, 1990, Dooley, 1991).
Cường độ ánh sáng từ 2000 đến 2500 lux được sử dụng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại mô [11].
1.2.3.6. Quy trình nhân giống in vitro
Hiện nay nhân giống in vitro đã được áp dụng cho rất nhiều loại thực vật. Murashige (1974) đã chia quy trình nhân giống in vitro thành 4 giai đoạn [1].
* Giai đoạn 1: Nuôi cấy khởi đầu (tái sinh chồi, cụm chồi)
Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy phải đảm bảo yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh. Kết quả này phụ thuộc nhiều vào cách lấy mẫu và phương pháp khử trùng mẫu cấy.
* Giai đoạn 2: Nhân nhanh chồi, cụm chồi trong điều kiện in vitro
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ Auxin/Cytokinin ngoại sinh được đưa vào môi trường nuôi cấy.
Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định cách nhân nhanh bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích.
* Giai đoạn 3: Tạo cây con hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn quan trọng, mục tiêu chính của giai đoạn này là tạo rễ. Tuy nhiên, có những loài không trải qua giai đoạn này vì rễ được hình thành đồng thời với quá trình nhân chồi.
* Giai đoạn 4: Huấn luyện cây con, chuyển cây ra vườn ươm
Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang trạng thái sống hoàn toàn tự dưỡng. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 – 3 tuần. Trong thời gian này phải đảm bảo điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, giá thể) phù hợp để cây con đạt tỉ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất.
Hoa
Rễ
Phôi
Thân
Đỉnh sinh trưởng
Lá
Bao phấn
Vật liệu vô trùng
Mô
Mầm
Tế bào
Chồi
Cụm chồi
Cây hoàn chỉnh
Vườn ươm
Đưa cây ra bầu đất
Tạo rễ
Nhân nhanh
Tái sinh chồi
Tạo mô sẹo
Khử trùng
Hình 1: Sơ đồ quy trình nhân giống thực vật in vitro
1.2.3.7. Nghiên cứu nhân giống hoắc hương
Những năm gần đây, hoắc hương được khai thác liên tục và thường xuyên, nhu cầu đối với dược liệu hoắc hương ngày càng tăng do nhiều tác dụng chữa bệnh của nó. Do đó, trữ lượng của cây giảm sút nghiêm trọng, việc cung cấp nguyên liệu với số lượng lớn có chất lượng ổn định để sản xuất thuốc đang trở thành nhu cầu bức thiết. Trước đây, hoắc hương chủ yếu được trồng bằng phương pháp giâm cành truyền thống. Tuy nhiên,...

---