Nghiên cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường phục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược

Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết Nối

MỤC LỤC
Phần A. TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
1 KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
2 ÁP DỤNG VÀO THỰC TIỄN SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG XÃ HỘI
3 ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI SO VỚI ĐỀ CƯƠNG ĐÃ ĐƯỢC PHÊ DUYỆT
4 CÁC Ý KIẾN ĐỀ XUẤT
Phần B NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
2 TỔNG QUAN
2.1 Tổng quan về tình hình nghiên cứu xây dựng dữ liệu chuẩn của các dược liệu
2.2 Tổng quan về một số phương pháp liên quan
2.2.1 Phương pháp cảm quan
2.2.2 Phương pháp sử dụng kính hiển vi
2.2.2.1. Phương pháp cắt, nhuộm và soi vi phẫu
2.2.2.2. Phương pháp soi bột dược liệu
2.2.3. Một số phương pháp sắc ký
2.2.3.1. Phương pháp TLC và phương pháp HPTLC
2.2.3.2 Phương pháp HPLC
2.2.3.3. Phương pháp GC
2.3. Tổng quan về một số nhóm hợp chất chính thường gặp trong dược liệu
2.3.1 Terpenoid
2.3.1.1 Monoterpen và sesquiterpen
2.3.1.2 Mono và diterpenoid glycosid
2.3.1.3 Triterpenoid và steroid
2.3.1.4. Saponin
2.3.2. Alcaloid
2.3.3. Hợp chất phenol
2.3.3.1. Flavonoid
2.3.3.2. Coumarin
2.3.3.3. Lignan
2.3.3.4. Các acid phenolic
2.3.3.5. Anthranoid
2.4. Tổng quan về thành phần hóa học và một số phương pháp kiểm tra chất lượng của 30 dược liệu nghiên cứu
2.5. Tổng quan về hesperidin, emodin và geniposid
2.5.1. Hesperidin
2.5.2 Geniposid
2.5.3 Emodin
2.6. Tổng quan về phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế một số hợp chất liên quan
2.6.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế flavonoid và hesperidin
2.6.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế anthranoid và emodin
2.6.3 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế iridoid glycosid và geniposid
3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thiết kế nghiên cứu
3.2 Chọn mẫu, cỡ mẫu và đối tượng nghiên cứu
3.2.1. Chọn mẫu
3.2.2. Cỡ mẫu
3.2.3. Đối tượng nghiên cứu
3.2.4. Các chất chuẩn đối chiếu hay chất đánh dấu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Chỉ tiêu nghiên cứu
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.4. Trang thiết bị, dung môi hóa chất
4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
4.1 Thu thập, xác định tên khoa học mẫu dược liệu chuẩn
4.2. Theo dõi,bảo quản và lưu giữ các mẫu dược liệu nghiên cứu
4.3 Phân tích các đặc điểm vi học và thành phần hóa học của các dược liệu
4.3.1. Bạch thược
4.3.2 Bạch truật
4.3.3. Bán hạ bắc
4.3.4. Cát sâm
4.3.5. Chỉ thực
4.3.6. Chi tử (Dành dành)
4.3.7. Diệp hạ châu
4.3.8. Cúc gai
4.3.9. Cây Hoa ngũ sắc (Cây Cứt lợn)
4.3.10. Đại hoàng
4.3.11 Đại hồi
4.3.12 Đan sâm
4.3.13. Địa cốt bì
4.3.14. Diệp hạ châu đắng
4.3.15 Đương quy
4.3.16 Hạ khô thảo
4.3.17. Hoàng đằng
4.3.18. Hương phụ
4.3.19. Kê huyết đằng
4.3.20. Kim ngân hoa
4.3.21. Mã tiền
4.3.22. Mẫu đơn bì
4.3.23. Mộc thông
4.3.24 Nghệ
4.3.25. Ngưu tất
4.3.26. Quế
4.3.27. Riềng
4.3.28. Sa nhân
4.3.29. Thăng ma
4.3.30. Trần bì
4.4 Phương pháp chiết tách, tinh chế emodin, hesperidin và geniposid từ các dược liệu nghiên cứu để làm chuẩn
4.4.1 Chiết tách, tinh chế emodin từ thân rễ đại hoàng
4.4.2 Chiết tách và tinh chế hesperidin từ trần bì
4.4.3. Chiết tách và tinh chế geniposid từ quả dành dành
5 KẾT LUẬN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
PHẦN A - TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI

1. KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
a. Đóng góp mới của đề tài
− Đã thu thập và xác định đúng tên khoa học, đúng bộ phận dùng của 30 dược
liệu nghiên cứu và một số loài khác để so sánh.
− Xây dựng được bộ dữ liệu chuẩn của 30 dược liệu đã thu thập được khác v
ới
các dược liệu đã được nghiên cứu trước đây về cùng khía cạnh nghiên cứu,
qua đó đưa ra quy trình thiết lập bộ dữ liệu chuẩn từ dược liệu nói chung.
− Bộ dữ liệu bao gồm 30 mẫu dược liệu được định danh đúng và các đặc điểm
về hình thái bên ngoài, bột, vi phẫu và các đặc điểm hóa học đặc trưng thông
qua các sắc ký đồ dấu vân tay. D
ữ liệu được lưu dưới dạng atlas nên có tính
khách quan và khoa học.
− Lần đầu tiên đề tài đã kết hợp nhiều phương pháp và kỹ thuật phân tích khác
nhau từ các kỹ thuật thường quy như TLC đến các kỹ thuật hiện đại như
HPTLC, HPLC với detector UV-VIS và detector DAD, ELSD, GC và GC-
MS, có so sánh với các chất đối chiếu tinh khiết.
− Chiết xuất, phân lập được 3 chất đối chiếu: Hesperidin, geniposid và emodin
từ các dược liệu trầ
n bì, dành dành và đại hoàng đạt yêu cầu về độ tinh khiết
làm chuẩn.
− Dùng các chất đối chiếu đã phân lập được để làm chuẩn so sánh trong phân
tích định tính trần bì, dành dành và đại hoàng bằng phương pháp TLC,
HPLC.

b. Kết quả cụ thể
− Đưa ra mẫu dược liệu đúng của 30 dược liệu và các dữ liệu (hình ảnh về hình
thái, vi phẫu, bột, sắc ký đồ TLC, HPLC, GC)
− Xây dựng được phương pháp chi
ết và phân tích TLC, HPLC và GC để xác
định đặc điểm “dấu vân tay” đặc trưng của từng dược liệu.
− Xây dựng được quy trình chiết xuất, phân lập 3 chất đối chiếu từ các dược
liệu nghiên cứu.
− Sản phẩm của 3 chất đối chiếu đã chiết xuất và phân lập đạt yêu cầu tinh
khiết để làm chuẩn: Hesperidin, geniposid và emodin cùng các hồ sơ liên
quan (các phổ xác định cấu trúc )

Quy trình thiết lập dữ liệu chuẩn đối với dược liệu.
Các sản phẩm hiện đang được lưu giữ tại Khoa Kiểm nghiệm Đông dược -
Dược liệu, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
Danh mục các sản phẩm của đề tài ghi ở phụ lục 8.
c. Hiệu quả về đào tạo:
− Góp phần đào tạo 2 thạc sỹ
dược học:
BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
2
c Đỗ Thị Thanh Thủy Năm tốt nghiệp: 2008
+Tên đề tài: “Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn emodin từ đại hoàng
phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc”
d Nguyễn Việt Hà Năm tốt nghiệp: 2009
Tên đề tài: “Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn geniposid từ quả dành
dành phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc”
− Góp phần đào tạo 1 dượ
c sỹ đại học:
+ Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Hương Thơm Năm tốt nghiệp: 2007
Tên đề tài: “Nghiên cứu xây dựng chất chuẩn Hesperidin và ứng dụng
trong kiểm nghiệm thuốc”
− Đào tạo một số cán bộ mới của Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Dược liệu
thông qua các nội dung nghiên cứu của đề tài
− Tham gia đào tạo nhiều lượt cán bộ làm công tác kiểm nghiệm d
ược liệu và
thuốc đông dược của các Trung tâm Kiểm nghiệm dược phẩm - mỹ phẩm và
các công ty Dược.
− Đã công bố được 2 bài báo trên tạp chí Kiểm nghiệm thuốc.

d. Hiệu quả về kinh tế
Kết quả nghiên cứu của đề tài được lưu lại dưới dạng hình ảnh có thể là tư
liệu tham khảo thay thế trong trường hợp thiếu dược liệu chuẩn khi kiể
m tra chất
lượng dược liệu. Các sản phẩm phân lập được từ dược liệu có thể dùng làm
chuẩn phòng thí nghiệm, tiết kiệm hơn khi mua chuẩn.

e. Hiệu quả về mặt xã hội
Kết quả của đề tài có thể được ứng dụng vào công tác kiểm tra, giám sát
chất lượng dược liệu, qua đó, góp phần quản lý tốt chất lượng dược liệu và chế
phẩm
đông dược, hạn chế tình trạng dược liệu giả mạo hiện nay
f. Hiệu quả khác
Đề tài góp phần bổ sung nguồn dữ liệu vào kho dữ liệu chuẩn của dược
liệu lưu hành tại Việt Nam, làm cơ sở cho việc xây dựng, soát xét các chuyên
luận của Dược điển Việt Nam.


2. ÁP DỤNG VÀO THỰC TIỄN SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG XÃ HỘI
Kết qu
ả nghiên cứu của đề tài đã và đang được áp dụng trong phân tích,
kiểm tra chất lượng dược liệu và các thành phẩm đông dược tại Viện Kiểm
nghiệm thuốc Trung ương và hệ thống kiểm tra giám sát chất lượng thuốc trong
cả nước góp phần nâng cao chất lượng đông dược và thuốc đông dược.


BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
3
3. ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI SO VỚI ĐỀ CƯƠNG
ĐÃ ĐƯỢC PHÊ DUYỆT

a. Tiến độ
+ Đúng tiến độ +
Đề tài đã được thực hiện đúng tiến độ: Từ 8/2006 đến tháng 01 / 2009

b. Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu đề ra
+ Thực hiện đầy đủ các mục tiêu đề ra: +
− Xây dựng được bộ dữ liệu chuẩn của 30 dược liệu thường dùng ở Việt
Nam hiện chưa có hay thiếu các dữ liệu tin cậy phục vụ công tác
kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược.
− Chiết xuất, phân lập và tinh chế được 3 chất đối chiếu đạt yêu cầu làm
chất đối chiếu từ các dược liệu trên.

Đưa ra quy trình thiết lập bộ dữ liệu chuẩn từ dược liệu.

c. Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến trong bản đề cương
+ Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong đề cương +
Đề tài đã tạo ra đầy đủ các sản phẩm như đã nêu ở mục b theo đúng dự
kiến trong bản đề cương. Ngoài ra, còn xây dựng tiêu chuẩn dự thảo đối với
3 chất phân lập được.

d. Đánh giá viêc sử dụng kinh phí
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 400 triệu đồng
Trong đó: Kinh phí sự nghiệp khoa học: 400 triệu đồng
Kinh phí từ nguồn khác: Không
Toàn bộ kinh phí đã được thanh quy
ết toán.

4. CÁC Ý KIẾN ĐỀ XUẤT
− Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của đề tài và quy trình thiết lập dữ liệu
chuẩn của dược liệu, có thể tiếp tục nghiên cứu áp dụng trên nhiều dược liệu
khác
− Triển khai ứng dụng nghiên cứu chỉ thị ADN của dược liệu để bổ sung dữ
liệu về đặc tính di truyền, giúp cho việc định danh và
định tính dược liệu
được chính xác hơn.
− Từ các kết quả nghiên cứu của một số đề tài về chuẩn dược liệu và dấu vân
tay sắc ký, hội đồng Dược điển nên tập hợp toàn bộ những dữ liệu chuẩn này
BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
4
để tiến tới hoàn chỉnh bộ dữ liệu chuẩn của dược liệu lưu hành tại Việt Nam
và làm cơ sở xây dựng, sóat xét và thẩm định một số chuyên luận dược liệu.
− Tiếp tục triển khai nghiên cứu thiết lập chất chuẩn từ dược liệu với quy mô
lớn hơn để cung cấp nguồn chuẩn cho các cơ sở kiểm tra, giám sát chất lượng
dượ
c liệu và thuốc đông dược.


PHẦN B- NỘI DUNG CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, việc sử dụng thuốc từ dược liệu có xu hướng
gia tăng trên phạm vi toàn cầu, không chỉ đối với phần đông dân số ở các nước
đang phát triển mà còn cả ở những nước phát triển. Ở Mỹ, số đơ
n thuốc có sử
dụng hoạt chất từ dược thảo chiếm 25% tổng số đơn thuốc pha chế tại cửa hàng;
hàng năm Trung Quốc sử dụng khoảng 700.000 tấn dược liệu và sản xuất
khoảng 6.266 mặt hàng; giá trị buôn bán dược liệu ở Ấn Độ hàng năm đạt hơn
60 tỷ Rupi [12].
Ở nước ta, việc sản xuất, kinh doanh các mặt hàng thuốc có nguồn gốc từ
dược liệu tăng lên không ngừng. Theo thống kê của Cục quản lý dược Bộ Y tế,
tính đến tháng 5 năm 2007, cả nước đã có hơn 3000 mặt hàng thuốc có nguồn
gốc dược liệu đã được Bộ Y tế cấp số đăng ký, chiếm gần 1/3 tổng số thuốc sản
xuất trong nước đã được cấp số đăng ký [24]. Thị trường dược liệu và các sản
ph
ẩm từ dược liệu cũng vì thế rất đa dạng và phong phú về nguồn gốc và chủng
loại. Do đó nhu cầu về dược liệu rất lớn, hàng năm nước ta tiêu thụ từ 30 -
50.000 tấn dược liệu các loại [25]. Trong khi đó, chất lượng dược liệu đang là
vấn đề bức xúc không chỉ đối với các cơ quan quản lý mà còn của toàn ngành Y
tế cũng như của cả
cộng đồng. Dược liệu dùng làm thuốc được cung cấp từ
nguồn thu hái hoang dại, trồng trọt và nhập khẩu. Nguồn dược liệu sản xuất
trong nước hiện nay mới đáp ứng được 46% nhu cầu của thị trường [6], còn
khoảng 60% phải nhập khẩu. Nguồn nhập khẩu chủ yếu theo con đường tiểu
ngạch, thiếu kiểm sóat. Do nguồn gốc dược liệu phức t
ạp, không rõ ràng, số
lượng lại lớn khó kiểm sóat dẫn đến tình trạng dược liệu giả mạo, nhầm lẫn, kém
chất lượng vẫn được tự do lưu thông trên thị trường gây ảnh hưởng không tốt
đến độ an toàn, hiệu lực và chất lượng của các chế phẩm từ dược liệu
Trước thực trạng trên, đã có nhiều đề tài, hội nghị, bài báo về vấn đề qu
ản
lý chất lượng dược liệu nhưng tình hình chất lượng dược liệu chưa có chuyển
biến đáng kể [20]. Vì vậy, việc kiểm tra chất lượng dược liệu trong giai đoạn
hiện nay cần được đẩy mạnh hơn bao giờ hết. Trong mấy năm gần đây,Bộ
Y tế cũng đã quan tâm nhiều đến vấn đề này và đã cấp kinh phí cho dự án nâng
cao n
ăng lực phòng kiểm tra chất lượng đông dược, dược liệu. Song đối với việc
kiểm tra chất lượng thuốc nói chung và kiểm tra chất lượng dược liệu nói riêng,
bên cạnh trang thiết bị hiện đại, cần có chất chuẩn đối chiếu.
BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
5
Mặt khác, đối với dược liệu,muốn áp dụng tiêu chuẩn DĐVN III để định
tính, định lượng các hoạt chất hay chất đặc trưng, cần có chuẩn dược liệu
hay chất đối chiếu hóa học là hoạt chất hay chất đặc trưng của dược liệu đó để
so sánh mà những chuẩn này thực tế còn thiếu chưa đáp ứng được. Vì thế, việ
c
kiểm tra chất lượng dược liệu ở nhiều nơi chủ yếu chỉ dừng lại ở mức độ cảm
quan, dựa vào kinh nghiệm hay làm một số phản ứng hoa học thông thường nên
kết quả đánh giá chất lượng còn hạn chế. Hiện nay, đã có một số công trình
nghiên cứu của Viện Dược liệu, Kiểm nghiệm thuốc trung ương, Trường Đại
họ
c dược [4,16,22] nhằm cung cấp những dữ liệu chuẩn về dược liệu khắc
phục phần nào những khó khăn về chuẩn. Song các công trình nghiên cứu này
mới chỉ khảo sát trên một số dược liệu với một số khía cạnh nhất định như vi
phẫu, bột, TLC hay HPLC và còn hàng trăm dược liệu khác chưa được khảo sát
hay khảo sát chưa đầy đủ. Ngoài ra, đã có không ít đề tài nghiên c
ứu chiết xuất
và phân lập được các chất đặc trưng từ dược liệu, một số ít trong đó có thể dùng
làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc nhưng nhìn chung việc nghiên cứu
chiết xuất, phân lập hoạt chất từ dược liệu nhằm đạt yêu cầu làm chuẩn vẫn còn
ít, chưa đáp ứng được nhu cầu về chất chuẩn trong kiểm nghiệm thuốc có nguồ
n
gốc từ dược liệu.
Để góp phần phát triển, bổ sung thêm nguồn dữ liệu chuẩn của các dược
liệu thường dùng và chất đối chiếu từ dược liệu phục vụ việc kiểm tra giám sát
chất lượng dược liệu và thuốc đông dược, trên cơ sở kết quả đạt được của đề tài
cấp cơ sở đã được nghiệm thu 2003-2005, chúng tui tiến hành
đề tài “Nghiên
cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường dùng phục vụ công
tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược”.
Mục tiêu của đề tài :
− Xây dựng bộ dữ liệu chuẩn của 30 dược liệu thường dùng ở Việt Nam mà
chưa có hay thiếu các dữ liệu tin cậy về chất lượng phụ
c vụ công tác kiểm
tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược.
− Chiết xuất, phân lập ít nhất 3 chất đối chiếu từ các dược liệu nghiên cứu đạt
yêu cầu làm chất đối chiếu.
− Đưa ra quy trình thiết lập bộ dữ liệu chuẩn từ dược liệu.
Nội dung nghiên cứu:
− Thu thập, định danh 30 dược liệu nghiên cứu
− Phân tích các đặ
c điểm hình thái, vi học của 30 dược liệu nghiên cứu
− Phân tích các đặc điểm hóa học đặc trưng của 30 dược liệu trên bằng phương
pháp TLC,HPLC và /hay GC-MS. Từ các sắc ký đồ thu được lựa chọn các
đặc điểm đặc trưng làm dấu vân tay sắc ký cho các dược liệu.
− Tập hợp các dữ liệu phân tích thành file dữ liệu cho mỗi dược liệu nghiên
cứu.
− Lư
u trữ và bảo quản cơ sở dữ liệu thu thập được vào đĩa CD.
BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
6
− Đóng gói, theo dõi, bảo quản các mẫu dược liệu nghiên cứu trong điều kiện
phòng thí nghiệm, đưa ra nhận xét về thời hạn bảo quản thích hợp ở điều kiện
phòng thí nghiệm đối với dược liệu nghiên cứu.
− Từ kết quả nghiên cứu đưa ra quy trình thiết lập dữ liệu chuẩn cho một dược
liệu.
− Chiết xuất, phân lập và tinh ch
ế 3 chất hesperidin, emodin và geniposid từ
trần bì, đại hoàng và dành dành để làm chất đối chiếu sử dụng trong kiểm
nghiệm đông dược dược liệu. Xác định cấu trúc các chất phân lập được.

2. TỔNG QUAN
2.1. Tổng quan về tình hình nghiên cứu xây dựng dữ liệu chuẩn của các
dược liệu
Để tiến hành nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dược liệu, vấn đề đầu tiên có tính
chất quyết định là phải đả
m bảo tính đúng của dược liệu, có nghĩa là dược liệu
đó phải được định danh đúng tên, đúng loài, đúng bộ phận dùng [24]. Cần tiêu
chuẩn hóa và ghi lại các đặc điểm về hình thái bên ngoài, vi phẫu, bột, các đặc
điểm hóa học đặc trưng để thể hiện tính đúng đó. Tập hợp những đặc điểm thể
hiện tính đúng của dược liệu
được coi là dữ liệu chuẩn của dược liệu. Dữ liệu
chuẩn có thể góp phần làm căn cứ để định tính, phòng chống giả mạo, nhẫm lẫn,
tiêu chuẩn hóa, kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu và chế phẩm của chúng.
Do đó, việc nghiên cứu xây dựng dữ liệu chuẩn của dược liệu đã và đang được
chú ý nhiều không chỉ ở nước ta mà còn ở các nướ
c trên thế giới.
Trước kia, trong các chuyên luận dược liệu, để định tính dược liệu, dược
điển các nước chỉ đưa ra yêu cầu về đặc điểm hình thái bên ngoài, vi phẫu, bột
của dược liệu và một số phản ứng hóa học đặc trưng bằng phản ứng trong ống
nghiệm hay bằng kỹ thuật TLC. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ
thu
ật,việc sử dụng kỹ thuật số để chụp lại ảnh của dược liệu hay đặc điểm vi
phẫu, bột dược liệu dưới kính hiển vi làm dữ liệu chuẩn về mặt thực vật của
dược liệu đã trở nên phổ biến. Để ghi lại các đặc điểm đặc trưng của dược liệu,
người ta sử d
ụng kỹ thuật điểm chỉ dấu vân tay (fingeprint) như dấu vân tay hóa
học, dấu vân tay ADN bằng các phương pháp phân tích hiện đại như phương
pháp sắc ký, điện di, quang phổ, nhiễu xạ tia X, phân tích gen
[33,36,41,42,67,73,99] hoăc kết hợp nhiều phương pháp khác nhau.Trong
những phương pháp trên, sắc ký như TLC, HPTLC, HPLC, GC hay sắc ký kết
hợp phương pháp đo phổ như LC-MS, GC-MS, FTIR, HPLC-DAD là phương
pháp hay được sử dụng nhất để định tính và kiể
m tra chất lượng dược liệu
[44,45,46,53,58,115] Các dấu vân tay sắc ký là các sắc ký đồ chỉ ra các đặc
trưng hóa học đa thành phần của dược liệu. Vì vậy, trong những năm gần đây,
bên cạnh TLC,dược điển các nước như USP, BP, CP, JP đã có nhiều chuyên
luận dược liệu và chế phẩm đông dược áp dụng phương pháp HPLC, GC hay
HPTLC trong định tính, định lượng hoạt chất hay nhóm chất đặc trưng củ
a dược
liệu.
BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
7
Trên thế giới, đã có nhiều tác giả tiến hành thu thập mẫu dược liệu và
nghiên cứu về các mặt thực vật học, hóa học và đưa ra các dữ liệu dưới dạng
atlas.
Ở Đức và Ấn Độ, việc nghiên cứu thiết lập dữ liệu chuẩn của dược liệu
nhằm tiêu chuẩn hóa và kiểm tra chất lượng dược liệu và các thuốc từ dược liệu
đã s
ớm được quan tâm. Tính đến năm 2002, cuốn sách “Herbal Drugs and
Phytopharmaceuticals” của Max Wichtl đã được xuất bản 4 lần bằng tiếng Đức,
trong đó đưa ra các ảnh chụp về đặc điểm hình thái và sắc ký đồ TLC [102].
Năm 1996, 2 tác giả người Đức là H.Wagner và S. Bladl đã cho ra mắt lần thứ
nhất Atlas TLC của 170 dược liệu và đến năm 2001 xuất bản lần 2 với 230 dược
liệu [93].
Năm 2002, Pulok K Mukhejee, khoa Công nghệ Dượ
c phẩm, trường Đại học
Jadavpur, Kolkata, Ấn Độ đã nghiên cứu đưa ra các hình ảnh về đặc điểm hình
thái và sắc ký đồ TLC của các chất đặc trưng của 25 vị dược liệu ở Ấn Độ [78].
Trung Quốc là một nước đóng góp nhiều công trình khoa học nghiên cứu
về dược liệu, đặc biệt về lĩnh vực phân tích đặc điểm hóa học, đặc
điểm di
truyền, thiết lập dấu vân tay hóa học, dấu vân tay ADN coi đó là phương tiện
hữu hiệu để so sánh, phân loại, định tính và đánh giá chất lượng dược liệu
[33,71,105,106]
Năm 2005, Hồng Kông Trung Quốc đã xuất bản tập 1 bản tiêu chuẩn của
8 dược liệu trồng tại Hồng Kông, tiếp đó 7/2008 tập 2 ra đời với 24 chuyên luận
dược liệu. Các chuyên luận này bao gồm những hình
ảnh về hình thái bên ngoài,
vi phẫu, sắc ký đồ của HPLC phân tích các chất đặc trưng thay mặt cho các dược
liệu trong tiêu chuẩn [38].
Ở nước ta, việc nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dược liệu cũng đã được Bộ Y
tế quan tâm, chỉ đạo nhiều, đặc biệt trong mấy năm gần đây, đã có không ít các
đề tài nghiên cứu về vấn đề này đã công bố hay đang trong giai đoạn thực hiệ
n.
Năm 2002, Nguyễn Viết Thân đã cho ra mắt tập 1 quyển “Kiểm nghiệm
dược liệu bằng phương pháp hiển vi”, trong đó có ảnh màu chụp cây thuốc, vị
thuốc, vi phẫu, bột của 100 dược liệu [20]. Năm 2005, Trịnh Văn Quỳ và cộng
sự đã công bố các dữ liệu chuẩn bao gồm ảnh chụp vị thuốc,vi phẫu, bột và sắc
ký đồ TLC của 25 dược liệ
u và sắc ký đồ HPLC, GC-MS của 11 dược liệu [16].
Tiếp theo, Nguyễn Kim Bích và cộng sự đã phân tích dấu vân tay TLC của 20
dược liệu [4], Nguyễn Thị Bích Thu đã phân tích dấu vân tay HPLC của 10
dược liệu [22] Ngoài ra, người ta còn nghiên cứu xây dựng chỉ thị dấu vân tay
ADN của một số dược liệu và coi đó là một đặc trưng của dược liệu cần kiểm tra
khi định tính [17].

2.2. Tổng quan về một số phươ
ng pháp liên quan
Phương pháp kiểm tra chất lượng dược liệu nói chung đã được WHO và
dược điển các nước quy định bao gồm các phương pháp kiểm tra đặc điểm hình
thái bên ngoài, vi phẫu, bột, định tính, định lượng hoạt chất hay chất hay nhóm
chất đặc trưng, thử tinh khiết [2,31,51,77,78,103].
BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
8
Để kiểm tra tính xác thực của dược liệu, người ta kiểm tra về các đặc
điểm hình thái bên ngoài, vi phẫu, bột và định tính bằng các phép thử hóa học,
quang phổ, sắc ký, chỉ thị ADN Cho đến nay, phương pháp dùng chỉ thị ADN
đã được áp trong kiểm tra chất lượng dược liệu ở một số nước trên thế giới
nhưng ở nước ta phương pháp này chưa được nghiên cứu nhiều.

2.2.1. Phương pháp cả
m quan
Là phương pháp dùng các giác quan để kiểm tra về hình dáng, màu sắc,
đặc điểm vết bẻ ngang, mùi vị, dùng thước để xác định kích thước của dược liệu.
Đây là phương pháp đơn giản và nhanh nhất để định tính, đánh giá sơ bộ về mặt
chất lượng dược liệu. Tuy nhiên, khi mẫu dược liệu thay thế hay giả mạo có
đặc điểm bên ngoài rất giống mẫu dược liệu th
ật thì cần thiết phải áp dụng các
phương pháp khác [1].

2.2.2. Phương pháp sử dụng kính hiển vi
Là phương pháp sử dụng kính hiển vi để nhận biết các đặc điểm của các
mô, tế bào, hay các chất chứa trong tế bào, ở các lát cắt, bột, các mô đã được
làm rã ra hay các tiêu bản bề mặt của dược liệu. Phương pháp thông dụng nhất
là phương pháp soi vi phẫu và soi bột.

2.2.2.1. Phươ
ng pháp cắt, nhuộm và soi vi phẫu
Cắt dược liệu thành những lát mỏng theo chiều ngang hay dọc bằng lưỡi
dao cạo, ống cắt vi phẫu cầm tay hay máy cắt vi phẫu, đem soi ngay lát cắt hoặc
xử lý lần lượt với cloramin T 5%, cloral hydrat, dung dịch acid acetic 1%, nước
cất rồi nhuộm với dung dịch xanh methylen và dung dịch đỏ carmin, sau đó soi
dưới kính hiển vi.

2.2.2.2. Phương pháp soi bột dược liệu
Nghiền dược liệu thành b
ột mịn, cho một lượng nhỏ bột vào một giọt
dung dịch soi như nước cất, glycerin, cloral hydrat trên lam kính, khuấy kỹ và
cẩn thận bằng kim mũi mác, đậy lam kính, di nhẹ rồi quan sát dưới kính hiển vi

2.2.3. Một số phương pháp sắc ký
2.2.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lớp mỏng hiệu năng
cao (HPTLC)
TLC là một phương pháp tách mà trong đó pha tĩnh là một chất rắn thích
hợp (có thể là silicagel, silicagel đã silan hóa, nhôm oxyd, cellulose ) đượ
c trải
thành một lớp mỏng,mịn và đồng nhất trên bề mặt phiến kính, kim loại hay
nhựa; pha động là một chất lỏng gồm một hay nhiều dung môi phối hợp với
nhau. Dung dịch chuẩn và dung dịch thử được chấm riêng biệt trên cùng một
đường thẳng trên bản mỏng. Sắc ký được tiến hành khi cho pha động di chuyển
qua pha tĩnh mà trên đó đã đặt các chất cần tách. Các thành phần trong hỗn hợp
BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
9
phân tích di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động với các tốc độ khác
nhau nên được tách và phân bố khác nhau trên pha tĩnh. Kết quả thu được sắc ký
đồ trên lớp mỏng, ở đó các thành phần của hỗn hợp cần tách phân bố rải rác dọc
theo đường đi của dung môi động. Tùy thuộc bản chất chất phân tích, ta có thể
nhận biết các thành phần được tách ra trên bản mỏng bằng ánh sáng thường (nếu
chất phân tích có màu), soi huỳnh quang
ở các bước sóng 254 nm, 366 nm, phun
thuốc thử hiện màu hay dùng thiết bị densitometer để đo cường độ ánh sáng
phản xạ hay truyền qua trong vùng UV-VIS.
Khi phân tích, cần so sánh sắc ký đồ của dung dịch thử với sắc ký đồ của
dung dịch chuẩn. Để định tính, sắc ký đồ của dung dịch thử phải có những vết
chính giống với những vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn v
ề các đặc
trưng sắc ký như màu sắc, giá trị Rf
Rf là hệ số di chuyển và là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của
chất phân tích. Giá trị Rf được tính bằng tỷ lệ dịch chuyển của chất thử và
khoảng dịch chuyển của dung môi:

b
a
Rf =

Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm của vết (cm)
b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng
đường đi của vết (cm)
Rf có giá trị từ 0 đến 1 và nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như
chất làm pha tĩnh, độ dày và độ hoạt hóa của lớp mỏng, dung môi động, tạp chất,
nhiệt độ phân tích, lượng mẫu phân tích Vì vậy, để so sánh thườ
ng phải triển
khai song song với dung dịch chuẩn [2,55]
Hiện nay, mặc dù đã có nhiều kỹ thuật sắc ký hiện đại hơn nhưng TLC
vẫn là một phương tiện có hiệu quả trong phân tích các thuốc thảo dược từ việc
nghiên cứu sàng lọc ban đầu cho đến bán định lượng và định lượng vì đây là
một kỹ thuật đơn giản và rẻ tiền nhất, có thể áp dụng được vớ
i hầu hết các hợp
chất tự nhiên. Do đó, TLC là kỹ thuật chủ yếu được WHO và dược điển các
nước áp dụng trong kiểm tra chất lượng dược liệu và chế phẩm của chúng
[2,77,103].
Tuy nhiên TLC có độ nhậy và độ phân giải chưa cao, hiện nay người ta đã
cải tiến TLC thành HPTLC. Sự khác nhau cơ bản giữa TLC thông thường và
HPTLC là cỡ hạt và lỗ xốp của chất hấp phụ. V
ới HPTLC, chất hấp phụ có cỡ
hạt nhỏ (2 - 10µm) và bản mỏng có độ dày nhỏ hơn (khoảng 100 - 200 µm)
trong khi TLC thông thường dùng chất hấp phụ có cỡ hạt và khoảng phân bố lớn
hơn (5 - 25µm), độ dày của bản mỏng thường ≥ 250µm. Nhờ cỡ hạt nhỏ, lớp
chất hấp phụ mỏng kết hợp với việc sử dụng công nghệ
tinh xảo và tự động nên
HPTLC có khả năng phân giải, độ nhậy cao, lượng mẫu và dung môi ít, khoảng
di chuyển của dung môi ngắn (5 – 6 cm), thời gian phân tích nhanh. Các chất
hấp phụ thường được dùng trong các bản mỏng hiệu năng cao tráng sẵn hiện nay
là silicagel và C
18
với độ dày 100 µm. Để định tính, định lượng các thành phần
phân tích được tách ra, người ta quét bản mỏng qua thiết bị scanner, một hệ
BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
10
thống phát hiện quang phổ với phổ hấp thụ UV-VIS, kích thích huỳnh quang và
phổ phát xạ của các thành phần được tách ra trên bản mỏng. Nhờ đó, có thể phát
hiện đồng thời nhiều thành phần ở nhiểu bước sóng khác nhau và lựa chọn được
bước sóng mà ở đó cho tín hiệu pic cao nhất, giúp cho việc định tính, định lượng
chất phân tích [55].
HPTLC thích hợp cho việc phân tích định tính, định lượng thành phần
trong dược liệu và thu
ốc từ dược liệu, vì vậy, hiện nay, kỹ thuật này đã được đưa
vào DĐTQ 2005 để định tính, định lượng nhiều hoạt chất, chất đặc trưng trong
dược liệu và một số chế phẩm đông dược như định lượng berberin trong hoàng
liên, acid hyodeoxycholic trong bột mật lợn, oxymatrine trong Quảng đậu căn
[77]

2.2.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
HPLC là phương pháp tách mà trong đó pha động là ch
ất lỏng, pha tĩnh
chứa trong cột là một chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân hay là chất
lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang rắn đã được biến đổi bằng
liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Cơ chế của quá trình sắc ký lỏng là hấp
phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ.
Trong HPLC, mẫu phân tích được tiêm qua buồng tiêm và được
đi vào
cột nhờ pha động, các thành phần trong mẫu phân tích được tách ra trên pha tĩnh
chứa trong cột rồi đi qua detector để phát hiện và cho các tín hiệu được ghi trên
sắc đồ.
Pha tĩnh hay dùng nhất trong HPLC là pha tĩnh mà trong đó các nhóm
silanol trên bề mặt hạt silicagel (chất mang) đã được liên kết với các nhóm hóa
học khác nhau tạo nên các hợp chất siloxan có độ phân cực khác nhau tùy theo
nhóm liên kết: ⎢ ⎢
- Si-O-Si -R
⎢ ⎢
Khi R là các nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18), phenyl và
pha động phân cự
c, ta có sắc ký pha đảo (RP-HPLC).
Khi R là nhóm khá phân cực như alkylamin hay alkylnitril pha động là
dung môi ít phân cực, ta có sắc ký pha thuận (NP-HPLC). Hiện nay, kỹ thuật
RP-HPLC được sử dụng rộng rãi vì tách tốt được nhiều hợp chất khác nhau. Cột
thông dụng là cột ODS (RP18), C8 với cỡ hạt 5 hay 10µm. Để cải thiện khả
năng tách, tiết kiệm dung môi và thời gian, gần đây người ta đã đưa sắc ký lỏng
nhanh (UFLC) vào ứng dụng rộng rãi. Trong UFLC, kích thước hạt ch
ất mang
nhỏ (thường từ 1,7 – 2,2 µm) và có thể sử dụng cột ngắn hơn (5-10cm).
Có nhiều loại detector khác nhau như detector tử ngoại – khả kiến (UV-
VIS),tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), khúc xạ (RI), điện hóa trong đó detector
chuỗi diode (DAD) cho phép thay đổi bước sóng theo chương trình đã đặt trong
một quá trình sắc ký và đồng thời đo phổ của chất phân tích ở nhiều bước sóng
cùng lúc, cho phép so sánh phổ để định tính.
BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
11
Để định tính một chất người ta so sánh thời gian lưu của pic chất đó trên
sắc ký đồ của dung dịch thử với thời gian lưu của pic chất chuẩn trên sắc ký đồ
của dung dịch chuẩn. Đồng thời ta cũng sử dụng thời gian lưu tương đối (RRT)
của một pic để xác định pic đó, thời gian lưu tương đối của một pic được tính
toán dựa trên thờ
i gian lưu của pic được chọn để đánh dấu theo công thức sau:
Thời gian lưu của pic so sánh
RRT =
Thời gian lưu của pic đánh dấu
Hiệu lực của cột sắc ký được biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết trên cột
(N). Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức:



Để đặc trưng cho mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký người ta
th
ường sử dụng độ phân giải R giữa 2 píc cạnh nhau. Độ phân giải giữa 2 píc
(píc số 1 và số 2) được tính theo công thức sau:
4.3.24.1. Mẫu nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu bao gồm 02 mẫu dược liệu sau:
+ Mẫu 1: Mẫu dược liệu Nghệ là thân rễ đã phơi khô của cây Nghệ vàng
(Curcuma longa L.), họ Gừng (Zingiberaceae) được thu hái tại Trùng Khánh,
Cao Bằng tháng 10/2006 và đã được xác định đúng tên khoa học (Mẫu T1).
+ Mẫu 2: Mẫu dược liệu Nghệ là thân rễ đã phơi khô của cây Nghệ vàng
(Curcuma longa L.), họ Gừng (Zingiberaceae) được thu hái tại Thị Xã Cao
Bằng tháng 11/2006 và đã được xác định đúng tên khoa học (Mẫu T2).
4.3.24.2. Kết quả nghiên cứu và bàn luận
a. Mô tả
Quan sát bằng cảm quan thấy: (hình 4.3.24.1).
Dược liệu là thân rễ hình trụ, đường kính 1 – 3cm. Mặt ngoài màu nâu xám,
nhăn nheo, có những vòng ngang gần nhau, đôi khi còn vết tích của các nhánh
và rễ. Mặt cắt ngang có hai vùng vỏ và trụ giữa trong đó trụ giữa chiếm gần 2/3
đường kính. Thể chất chắc nặng mặt bẻ bóng có màu vàng cam. Mùi thơm hắc,
vị hơi đắng, hơi cay.
b. Vi phẫu
Tiến hành cắt và soi vi phẫu dưới kính hiển vi thấy các đặc điểm sau: (hình
4.3.24.2).
Tiêu bản mới cắt, chưa nhuộm tẩy thấy rõ lớp bần dày, gồm nhiều hàng tế bào
dẹt, trong đó rải rác có những tế bào màu vàng hay xanh xám. Mô mềm vỏ gồm
những tế bào tròn to, thành mỏng, chứa hạt tinh bột. Rải rác trong mô mềm còn
có tế bào tiết tinh dầu màu vàng và các bó libe – gỗ nhỏ. Nội bì và trụ bì rõ. Mô
mềm ruột có cấu tạo giống mô mềm vỏ. Trong mô mềm ruột có những bó libe
gỗ rải rác nhiều hơn.
c. Soi bột
Bằng cảm quan thấy: Bột màu vàng nâu, mùi thơm.
Soi bột dược liệu dưới kính hiển vi thấy các đăc điểm sau: (hình 4.3.24.3)
- Mảnh mô mềm gồm những tế bào thành mỏng chứa các hạt tinh bột.
- Nhiều hạt tinh bột hình trứng dài 12 – 50 µm, rộng 8-21µm, có vân đồng
tâm và rốn lệch tâm.
- Tế bào chứa tinh dầu và nhựa tạo thành những đám lổn nhổn màu vàng.
- Mảng mạch mạng và mạch vạch.
d. Phân tích các đặc điểm hóa học bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
Theo các tài liệu đã tham khảo, dược liệu Nghệ có chứa tinh dầu, protein, chất
béo, các chất màu phenolic, chủ yếu là curcumin. Trên cơ sở đó, chúng tui đã
định hướng phân tích nhóm chất màu curcumin của Nghệ dùng Curcumin I làm
chất đối chiếu.

Xem link download tại Blog Kết nối!
Music ♫

Copyright: Tài liệu đại học ©