Trường ĐH Nông Lâm Tp HCM
Bộ môn Công nghệ sinh học
Lớp DH06SH

CHỦ ĐỀ
:

GVHD: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
SVTH: BÙI THỊ HỒNG GẤM
MSSV: 06126031


ấp phụ 14
IV. KẾT TINH PROTEIN ENZYEM 15
V. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TINH SẠCH ENZYME 15
1.Xây dựng đường biểu diễn về độ hòa tan 15
2. Phân tách protein/enzyme bằng điện di trên gel 16
3. Phương pháp siêu ly tâm 17
4. Kỹ thuật khối phổ 18
VI. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME 18
VII. TỔNG KẾT 19 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 2

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trước thế kỷ XVII người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống song
chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của vi sinh vật. Ðó là các quá trình
lên men rượu, muối dưa, làm tương và nước chấm Ở thời kỳ này người ta chưa hiểu về bản
chất enzyme và các quá trình lên men. Cho đến nữa đầu thế kỷ XIX các nhà khoa học đã khái
quát được quá trình lên men là hiện tượng phổ biến trong sự sống và vai trò qua tr
ọng của
enzyme trong chuyển hoá các chất trong quá trình lên men.

đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp. E có tất cả trong tế bào sống, là các chất xúc tác
sinh học. (CNSH Enzyme và Ứng Dụng - Phạm Thị Trân Châu,Phan Tuấn Nghiã).
Trong phản ứng E xúc tác các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là cơ chất
(substrate), E sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau. E có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất
cả các chất xúc tác h
ữu cơ và vô cơ khác. E không chỉ có thể xúc tác các phản ứng trong cơ thể
sống , mà sau khi tách ra khỏi hệ thống sống chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác ở những điều
kiện nhất định.Có trên 4000 phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzym [1]. E có tính đặc hiệu
cao, nghĩa là mỗi E chỉ tác dụng trên một hay một số S (cơ chất ) nhất định ở nhiệt độ và áp suất
bình thường.
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 3

2. Tính chất của enzyme
1. Enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein. Đa số E có
dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn.
2. Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực, không tan trong ete và các dung môi
không phân cực.
3. Không bền dưới tác dụng của nhiệt, nhiệt độ cao E bị biến tính. Môi trường axít hay
bazơ cũng làm E mất khả năng hoạt động.
4. Enzym có tính lưỡng tính: Tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các d
ạng: cation, anion
hay trung hòa điện.
5. Enzym chia làm hai nhóm: E một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin, amylase và các
E hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phải protein).
 Trong phân tử enzyme hai cấu tử có hai phần:
• Apoenzym: Phần protein, nâng cao lực xúc tác của E, quyết định tính đặc hiệu.
• Coenzym: Phần không phải protein, trực tiếp tham gia vào phản ứng E, bản chất là

Nước đá : muối 100:33 (3:1) -21,3
o
C
Nước đá : H
2
SO
4
đậm đặc 100:25 (4:1) -20,0
o
C

Tiến hành tinh sạch ở nhiệt độ thấp vừa hạn chế biến tính E cũng như tác dụng phân giải
của các E proteolytic có mặt trong dịch chiết. Đối với nhiều E có thể bổ sung chất ức chế
của E proteolytic vào dịch chiết để hạn chế sự thủy phân đối với E quan tâm. Các E
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 4

proteolytic được phân thành 4 lớp: protease serin, protease cystein, protease acid, protease
chứa kim loại.
Trên cơ sở 4 lớp của protease này, người ta cũng chia chất ức chế của E này thành 4 lớp
tương ứng. chất ức chế hai E protease serine và protease cystein được sử dụng nhiều do sự
phổ biến của hai E này. Đối với một số E nhạy cảm với các phân cắt proteolytic, thì cả 4
loại chất ức chế đều được sử dụng.
Bảng 2:
Một số chất ức chế E proteolytic thường dùng trong tách chiết, tinh sạch
protein/E

Chất ức chế

o
C
Protease kiểu trypsin
và một số kiểu
protease cystein
Iodoacetic acid
hay iodoacetate
(IAA)
10-100μM
vài giờ
100mM
trong H
2
O
Chỉ chuẩn bị trước
khi dùng
Protease cystein
Ethylene diamine
tetra acetic acid
(EDTA)
1-2mM,
lâu dài
500mM
pH 8,0
6-12 tháng ở nhiệt
độ phòng
Protease chứa kim
loại (trừ loại chứa
Ca
2+

5

2. Thu nhận enzyme
a . Chọn nguồn nguyên liệu
Việc điều chế chúng bằng phương pháp hoá học rất khó khăn và tốn kém, nên người ta
thường thu nhận chúng từ nguồn nguyên liệu sinh học. Có 3 nguồn nguyên liệu sinh học:
 Động vật: Tuyến tuỵ, màng nhầy dạ dày, tim…dùng để tách E rất thuận lợi. Dịch tuỵ
tạng có chứa amylase, lipase, protease, ribonuclease, và một số E khác.
Ví dụ
: Renin tách từ dạ dày bê nghé làm đông sữa trong sản xuất fomat.
 Thực vật: Thông thường E có mặt nhiều ở cơ quan dự trữ như hạt, củ, quả. Cơ quan dự
trữ giàu chất gì thì nhiều E chuyển hoá chất ấy.
Ví dụ:
hạt cây thầu dầu có nhiều lipase, trong hạt đậu nành có nhiều E urease, papain
thu từ nhựa đu đủ xanh, bromelain thu từ các bộ phận cây dứa, fixin tách từ dịch ép của thân
và lá cây Ficus…
Tuy nhiên từ nguồn nguyên liệu động thực vật thì không thể sản xuất chế phẩm E với
quy công nghiệp bởi các nhược điểm:
- Chu kỳ sinh trưởng của chúng dài
- Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được
- Đây là ngu
ồn nguyên liệu dùng làm thực phẩm không thể dùng để sản xuất sản
phẩm ảnh hưởng an ninh lương thực.
 Vi sinh vật: Là nguồn nguyên liệu dùng sản xuất E có nhiều ưu điểm nổi bật, là nguồn
nguyên liệu vô tận, có thể chủ động tạo ra được.Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn
(16-100 giờ). Hệ E vi sinh vật vô cùng phong phú. Và phần lớn thức ăn nuôi vi sinh vật dễ
kiếm và rẻ.
E vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, trong vòng 24 giờ vi sinh vật có thể chuyển hoá một
lượng thức ăn gấp 30-40 lần trọng lượng cơ thể chúng.
b. Thu dịch chiết E thô

2
…
* Lưu ý
: Các nguyên liệu động vật, thực vật thường có mặt những chất có màu làm ảnh
hưởng đến việc làm sạch và xác định hoạt lực của E, nên ta thêm vào chất khử để loại màu.
Dịch chiết có thể được cô đặc ở nhiệt độ thấp để tăng nồng độ E, hoặc bổ sung các tác
nhân gây kết tủa protein/E để loại một số chất không mong muốn, sau đó hoà tan E trong
một thể
tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp.
III. TINH SẠCH ENZYME
Thu nhận E dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực. Hỗn hợp chứa E
sẽ phải trải qua nhiều công đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên đặc tính nhất định để thu
được một E tinh sạch. Sau mỗi bước thu nhận ta đều phải tiến hành xác định hoạt tính và
nồng độ E để đảm bảo hiệu quả tinh sạch. Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: tủa, màng
bán dẫn, sắc ký.
1. Các phương pháp tủa protein enzyme
Có nhiều phương pháp khác nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các dung môi hữu cơ hoặc
thay đổi pH của dung dịch có chứa protein/E, dùng nhiệt. Trong đó tủa bằng muối được sử
dụng nhiều nhất.
a. Tủa bằng muối
Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của
protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối…
Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ
muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out), mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một
nồng độ nhất định. Lượng muối có thể được loại bỏ thông qua bướ
c thẩm tách.
Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn:
log S = B - KI
Trong đó
S: độ hòa tan của protein

+ Dạng bột:
Người ta cho từng ít một vào dịch chiết E. Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết
tủa ban đầu của E. Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để
đảm bảo sự
hòa tan của muối.
0,515 x V (S
2
-S
1
)
X(g) =
1-0,272S
2

+ Dịch bão hòa:
Cho dung dịch (NH
4
)2 SO
4
vào dịch chiết E thì độ (NH
4
)2 SO
4
không tăng dột ngột. Sau
khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2h để qua đêm, mục đích là tạo kết tủa
hoàn toàn (ở phương pháp dùng dung môi hữu cơ thì không cần để lâu). Kết được lấy ra
bằng cách ly tâm hoặc lọc qua phễu Buckner. Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thêm
ion Ca

++

2
)
V (ml) =
1-S
2

* Lưu ý khi sử dụng muối ammonium sulfatese
+ Cho muối vào dung dịch E một cách từ từ, đồng thời khuấy đều để tránh tăng nhanh
cục bộ nồng độ muối dẫn đến mất tính kết tủa chọn lọc, thậm chí làm mất hoạt tính E.
+ Sử dụng muối ammonium sulfatese mất nhiều thời gian và cần phải ly tâm tốc độ cao
và ở nhiệt độ thấp để tách protein tủa.
b. Tủa bằng các dung môi hữu cơ
Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan
của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung môi hữu cơ lại có ái lực với các
bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá
trình tủa. Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp, trừ một số
dung môi như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl sulfoxide (DMSO) và
ethanol có thể được sử dụng ở nồng độ cao.
Ethanol hay aceton thường được dùng để tủa protein cho mục đích tinh sạch. Sự kết tủa
có thể có tính chọn lọc một phần, nghĩa là các protein khác nhau có thể được tủa bằng các
nồng độ khác nhau của dung môi (nồng độ dung môi thường chiếm 80% (v/v) trở lên). Sau
X: khối lượng (NH
4
)
2
SO
4

S1: độ bão hoà cho trước
S2: độ bão hoà cần thiết

Hình 2
: Mức tinh sạch và hiệu suất thu hồi protease có trong dịch trích từ
ruột cá Basa khi sử dụng các tác nhân kết tủa khác nhau
(Nghiên Cứu Thu Nhận Chế Phẩm Enzyme Protease Từ Ruột Cá Basa (Pangasius Bocourti)-TrầnQuốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn -
Trung Tâm Công Nghệ Sau Thu Hoạch, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II - Truờng Ðại Học Bách Khoa, ÐHQG-HCM)
c. Tủa bằng phương pháp điểm đẳng điện
Khi pH của môi trường thay đổi, mức độ tủa của protein cũng thay đổi.
+ pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton).
+ pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất đi
proton (mất H
+
).
+ Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không tích điện. Điều này
làm giảm tính tan của protein vì protein không còn
khả năng tương tác với môi trường, khi đó, các phân
tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường. Hiện tượng
này được giải thích bằng phương trình Cohn.
Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của 2 protein khác
nhau thay đổi theo pH.
Hình 3:
Tỷ lệ protein tủa theo pH
( /> )
Phương pháp này thường dùng cho các protein
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 9

đậu nành (có pI= 4.6)
d. Dùng nhiệt

o Sắc ký lỏng cao áp dựa vào
kích thước của phân tử nhưng
có độ phân giải cao nhờ vào áp
suất (high pressure liquid
chromagraphy). Hình 4: Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4
trong kết tủa protein
Túi cellophane
Đệm phosphate
có pH = 7, nồng
độ 0,01M
Hình5: Hai phương pháp
sắc ký cơ bản
A: Sắc ký trao đổi ion, dựa
vào sự tích điện của protein
B: Sắc ký phân loại kích
thước, dựa vào kích thước
protein
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 10

Ví dụ: Mẫu E
Hình6: Minh họa sắc ký trao đổi ion

Hình 7: Minh họa cơ chế giữa protein trong hệ sắc
ký trao đổi ion
(a) Những hạt mang điện tích dương sẽ trao đổi ion â
m
với dung dịch đệm. Protein tích điện âm cũng ion
dương tương tác với nó
(b) Khi protein gắn với hạt, protein thay thế những io
n
âm tương tác với hạt cũng như hạt thay thế những ion
dương tương tác với protein
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 11


bên ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và
ra ngoài trước . Phân tử có kích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào được bên trong
hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; còn nhữ
ng phân tử nhỏ sẽ phải đi qua đoạn đường dài hơn,
quanh co nên sẽ ra sau cùng. Hình7:
Sắc ký đồ trên DEAE-Cellullose
Hình 8:
kết quả điện di sau các bước tinh sạch
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 12

Các sephadex có ký hiệu khác nhau từ G10 dến G200 phục vụ trongviệc lọc phân tử cho
phép các chất có trọng luợng phân tử khác nhau lọtvào ở các nguỡng sau đây:
Các loại sephadex Trọng luợng phân tử
G. 10 0 - 700
G. 15 0 - 1.500
Sắc ký đồ trên gel acrylamide cho thấy hầu như tất cả các vạch trên mẫu trích ly đều xuấthiện ở mẫu đã qua
tinh sạch trên sephadex. Ðiều đó có nghiã trước và sau khi chạy sắc ký lọc gel trên cột Sephadex G-50 chưa có
hiệu quả lắm về mặt tinh sạch, có thể do Sephadex G-50 không phù hợp nên chưa thể loại bỏ một số tạp chất.Î
Việc chọn kích thước hạ
t gel là vô cùng quan trọng trong quá trình tinh sạch E. (Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch
urease từ đậu nành-Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Cẩm Vi, Nguyễn Tấn Ðạt-Truờng Ðại học Bán công Tôn Ðức Thắng-
Tạp chí phát triển KH&CN, tập 9, số7 -2006)

Hình 10: Sắc ký đồ của dịch trích ly từ
đậu nành khi qua cột SephadexG-50
Hình 11: Kết quả điện di mẫu đã
qua cột Sephadex, ở phân đoạn 4
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 13

c. Sắc ký ái lực
Phương pháp này cho phép tinh sạch nhanh chóng hợp chất hay E quan tâm. Nguyên tắc
của phương pháp là dựa trên sự tương tác đặc hiệu sinh học để tạo ra sự gắn kết đăc hiệu
giữa chất cần tách với gel sắc ký.
Đối với E,người ta sẽ gắn với gel một chất có ái lực đặc hiệu với E như: cơ chất,

n hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có
được một tốc độ chảy thích hợp. Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh.
4. Phương pháp dùng chất hấp phụ
Nhiều protein và enzyme gắn một cách chọn lọc vào các chất hấp phụ nhất định như
silicagel, bentonite, γ - aluminium hydroxid, hydroxyapatite và nhờ vậy, chúng có được làm
sạch với hiệu suất cao. Phương pháp hấp phụ chọn lọc - hấp phụ trong thể tích (thêm chất
hấp phụ trực tiếp vào dịch E) hoặc trên cột (sắc ký hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc
tách và làm sạch E. Chất hấp phụ chủ yếu thu
ờng được dùng là hydroxyapatite cho hiệu quả
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 14

phân tách đặc biệt cao. Hấp phụ chọn lọc enzyme có thể thực hiện bằng một trong hai cách :
chất hấp phụ hoặc hấp phụ protein tạp hoặc hấp phụ enzyme. Quá trình hấp phụ thường
được tiến hành ở 0
o
C. Bằng cách đổi độ pH hoặc lực ion của dung môi thích hợp, các E
được hấp phụ có thể được chiết khỏi chất hấp phụ.
IV. KẾT TINH PROTEIN ENZYME
Ðây là phương pháp đặc hiệu tốt nhất để tách từng phần protein enzyme ở giai đoạn tinh
chế cuối cùng. Khi protein enzyme đã được làm tinh khiết hoàn toàn, trong những trường
hợp riêng biệt, ta tiến hành kết tinh chúng.
Chú ý:
là protein enzyme ở trạng thái tinh thể không thể được coi là tinh khiết hoàn
toàn. Đặc biệt là các tinh thể protein E kết tinh lần đầu đôi khi có độ sạch không vượt quá
50% và có thể chứa các protein E khác.
Quá trình kết tinh protein E được thực hiện trong dung dịch (NH
4

ếu dùng nhiều phương pháp khác
nhau để kiểm tra độ sạch của E mà kết quả đều cho là đồng thể thì E đó được công nhận là
tinh khiết. Những phương pháp để kiểm tra tính đồng thể thường dùng là xây dựng đồ thị về
độ hòa tan, điện di và siêu ly tâm.
1. Xây dựng đường biểu diễn về độ hòa tan
Trong hàng loạt mẫu dùng một thể tích không đổi một loại dung môi (nước hoặc dung
dịch muối) lắc với những số lượng E khác nhau. Sau đó lọc và xác định số protein trong
dịch lọc. Cuối cùng xây dựng đường đồ thị. Trong những loại mẫu đầu, tất cả các protein
thêm vào bị hòa tan và số lượng protein thêm vào bằng số lượng protein có trong dịch lọc
hay dịch ly tâm. Kết quả nhận được biểu diễn là m
ột đường thẳng. Sau đó dung dịch đạt
được bão hòa. Nếu protein đem hòa tan là tinh khiết nghĩa là đồng nhất thì khi thêm protein
trong dịch lọc sẽ không tăng lên và đường biểu diễn có một điểm uốn. Nếu trong mẫu có
một protein thứ hai thì sau khi đạt được độ bão đối với protein ít hòa tan hơn, loại protein
thứ hai còn có thể hòa tan nữa.

[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 15

Kết quả là có một điểm bão hòa thứ hai và đường biểu diễn có hai điểm uốn. Nếu dịch
chiết có nhiều protein E thì sẽ có nhiều điểm uốn. Phương pháp này được Northrop và
Kunitz sử dụng rất có kết quả đến nay vẫn còn ứng dụng nhiều.

nhất là đồng trùng h
ợp cơ chất trong gel polyacrylamide, sau khi điện di rửa gel bằng một
dung dịch thích hợp, sau đó ủ gel với dung dịch cơ chất trong điều kiện phản ứng thích hợp.
Băng protein nếu có hoạt tính sẽ chuyển cơ chất thành sản phẩm có màu khác với màu của
nền gel chứa cơ chất, nhờ đó dễ dàng nhận ra băng có hoạt tính E. Ví dụ:
Với protease, cơ
chất casein, sau đó nhuộm gel với coomassie thì vị trí có E sẽ không có màu (do E phân giải
cơ chất), tạo thành vệt sáng trên gel có cơ chất nhuộm màu xanh.
Hình 1
2
:
Đ
ường biểu diễn độ hòa tan protein
A: Protein đơn thể
B: Hỗn hợp 2 protein

A
B
Số lượng protein trong dịch lọc
Số lượng protein cho thêm
Hình 13: Minh hoạ phương pháp điện di
[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 16

a. Điện di một chiều
Các protein/E có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên gel
polyacrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính. Một số chất biến tính protein như: SDS
(sodium dodecyl sulfate), LDS (lithium dodecyl sulfate), Ureùa, Formamide. Thường dùng

một protein có một pI riêng.
Ví dụ:
pI của cytochrome C, một protein vận chuyển ion có tính base cao, là 10.6, trong
khi pI của albumin huyết thanh, một protein có tính acid trong máu, là 4.8.
Khi ta cho hỗn hợp protein chạy trong điện trường trên một miếng gel với một khuynh
độ pH, không có sự hiện diện của SDS. Mỗi protein sẽ di chuyển cho đến khi nó đến vị trí
mà tại đó pH bằng pI của nó. Dựa vào hiện tượng này, ta có phương pháp phân tách protein
dựa vào điểm đẳng điện của protein. để tạo khuynh độ pH, trước hết là cho vào gel m
ột hỗn
hợp polyampholyte (những polymer nhỏ đa điện tích) có nhiều giá trị pI, sau đó điện di hỗn
hợp.
Điện di dựa vào điểm đẳng điện phân tách protein nhanh với khả năng phân biệt được
sự chênh lệch pI khoảng 0.01 hay những protein khác nhau chỉ một đơn vị điện tích cũng có
thể được phân tách bằng phương pháp này. [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 17

c. Điện di hai chiều
Đây là phương pháp có khả năng phân tách
cao do sự kết hợp SDS-PAGE với điện di dựa vào
điểm đẳng điện. Mẫu protein đầu tiên sẽ được
chạy điện di dựa vào điểm đẳng điện. sau đó, đặt
khoảng gel có chứa protein vừa được điện di lên
tấm gel SDS-polyacrylamide theo phương nằm
ngang. Protein sẽ chịu một điện trường theo chiều
dọ

[Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 18

+ Hình dạng: cũng ảnh hưởng đến vận tốc lắng vì nó tác động đến độ nhớt. Hệ số ma
sát của một phân tử cuộn lại thì nhỏ hơn những phân tử cồng kềnh dù chúng có cùng khối
lượng. Vì vậy, một phần tử dạng thẳng lắng chậm hơn những phân tử hình cầu dù chúng có
cùng khối lượng.
+ Tỉ trọng của dung dịch (p): các phân tử
lằng khi p < 1, nổi khi p > 1 và không di
chuyển khi p = 1.
 Các bước tiến hành: với tốc độ ly tâm rất lớn, bằng cách tăng số vòng quay ly tâm lên
hàng nghìn, hàng vạn vòng trong một phút. Ta có thể tách ra được các phân tử E có trọng
lượng phân tử khác nhau.Tốc độ kết tủa của protein E trong máy siêu ly tâm được xác định
bằng trọng lượng phân tử của nó.
Khi dừng quay thì các phân tử protein lại khuyếch tán vào dung dịch. Do đó, để quan sát
tốc độ lắng trong quá trình siêu ly tâm người ta gắn m
ột thiết bị quang học đặc biệt, vẽ các
đường ánh sáng của kết quả phân tích lên một màn. Nếu trong dung dịch có một loại protein
E thì trên màn sáng sẽ cho đường đồ thị có một đỉnh. Nếu làm việc với hai hay nhiều
protein enzyme thì sẽ có hai hoặc nhiều đỉnh
Sau ly tâm mẫu được hút ra nhẹ nhàng theo từng phân lớp, hay đục lỗ nhỏ ở đáy ống ly
tâm để lấy từng phân lớp.
4. Kỹ thuật phân tích khối phổ (mass spectrometry – MS)
Với phương pháp phân tích này, các protein được phân cắt bằng một protease đặc hiệu
(thường dùng là trypsin) thành các peptide nhỏ, sau đó cho qua hệ thống phân tích khối phổ.
Nhờ hệ thống này, phổ các peptide được xác định khối lượng phân tử chính xác và kết quả
được so sánh với khối phổ của các protein trong ngân hàng dữ liệu quốc tế. Protein phân
tích được nhận dạng chính xác là loại protein hay E gì.


 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme
Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong E học, người ta không định lượng
E một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác định độ hoạt động (còn gọi
là hoạt độ) của E. Trong phán ứng có E xúc tác, sự hoạt động của E được biểu hiện bằng
cách làm thay đổi các tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản
ứng. Theo dõi những biến đổi đó có thể biết đượ
c chính xác mức độ hoạt động của E thông
qua xác định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng. Ðể xác
định hoạt độ của E ở các dịch chiết hoặc ở chế phẩm người ta thường dùng các phương
pháp vật lý hoặc hóa học. Các phương pháp, so màu, đo khí, đo độ phân cực, đo độ nhớt,
chuẩn độ được dùng phổ biế
n trong nghiên cứu định lượng các phản ứng E.
Có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau:
+ Ðo lượng cơ chất bị mất di hay lượng sản phẩm tạo thành trong một thời gian nhất
định ứng với một nồng độ E xác định.
+ Ðo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản
phẩm với một nồng độ E nhất định.
+ Chọ
n nồng độ E như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên
nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
Ðơn vị hoạt độ E (U) là lượng E có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 micromole
(1μmol) cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 U = 1μmol cơ chất (10
-6
mol)/ phút.
Từ năm 1972 người ta lại đưa thêm khái niệm Katal (Kat)
Katal (Kat) là lượng E có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ chất sau một giây
ở điều kiện tiêu chuẩn
1 Kat = 6.10

20

1. Công Nghệ Sinh Học (tập ba) Enzyme và ứng Dụng-Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn
Nghĩa -Chương2: Các phương pháp nghiên cứu enzyme (trang 15-28).
2. Enzyme Học – Giáo trình điện tử -
- Chương 2: Phương pháp
nghiên cứu enzyme (trang 19-41)

3. Chromatographic Methods For Protein Purification - My Hedhammar, Amelie Eriksson
Karlström, Sophia Hober - Royal Institute of Technology, AlbaNova University Center, Dept. of
Biotechnology, SE-106 91 Stockholm, Sweden. (p. 3-23)
4. Nghiên Cứu Thu Nhận, Tinh Sạch Urease Từ Đậu Nành - Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Cẩm
Vi, Nguyễn Tấn Ðạt - Truờng Ðại học Bán công Tôn Ðức Thắng - Tạp chí phát triển KH&CN,
tập 9, số7 -2006.
5. Nghiên Cứu Thu Nhận Chế Phẩm Enzyme Protease Từ Ruột Cá Basa (Pangasius
Bocourti) -Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn - Trung Tâm Công Nghệ Sau Thu Hoạch, Viện
Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II - Truờng Ðại Học Bách Khoa, ÐHQG-HCM
6. Sự phân b
ố, thu nhận và ứng dụng enzym protease -
7. Enzym – Wikipedia Tiếng Việt -
8.
Protein Purification - Joseph Conner
9. Tinh sạch protein – Dương Văn Cường –

10.
Tinh sạch protein bằng phương pháp tủa (27-12-2006) – V.T.M.Tâm