LOGO
Chương 2: CÁC KỸ THUẬT
NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI
(tiếp theo)
Nguyen Thi Viet Anh
www.themegallery.com
Nội dung
1. Các kỹ thuật chính dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp
1.2. Các enzym dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp
1.3. Các vector nhân dòng dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp
1.1. Khái niệm
1.4. Nhân dòng gen (gene cloning)
2. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
2.1. Kỹ thuật chiết tách DNA và RNA
2.2. Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA
2.3. Phương pháp PCR
2.4. Kỹ thuật xác định trình tự DNA
2.5. Kỹ thuật RFLP (dựa vào lai DNA/DNA)
2.6. Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR (AFLP, SSR)
1.5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện của gen
2.7. Genomic và proteomic
www.themegallery.com
 Ngân hàng bộ gen:
 Thư viện DNA từ bộ gen (lắc cơ học, RE);
 Khái niệm ngân hàng bộ gen (Bank of genomic DNA):
• Đoạn DNA được tách dòng (khác nhau do tế bào, bộ gen, RE,…);
• Bao gồm exon và intron;
• VD: ngân hàng bộ gen của vi khuẩn;
• tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành bộ gen và đã được tách
dòng trong tế bào chủ;
• Đầu tiên DNA 300.000-400.000 bp gắn vào YAC hoặc BAC, cắt

ngân hàng cDNA
 Kỹ thuật phiên mã ngược
tạo cDNA:
 Tách chiết và tinh sạch mRNA của
tế bào;
 Sử dụng kỹ thuật PCR: các đoạn
mồi (primer) đặc hiệu, các loại
nucleotide tự do, DNA
polymerase…
 mRNA tổng hợp nên cDNA;
 Enzyme RNase H để phân huỷ sợi
khuôn RNA;
 Tổng hợp sợi đơn cDNA thứ 2
www.themegallery.com
Kỹ thuật tạo
ngân hàng cDNA
 Kỹ thuật phiên mã ngược tạo cDNA: có 2 nhóm
phương pháp chủ yếu:
 Phiên mã ngược bằng phân huỷ hoàn toàn sợi khuôn mRNA
(cDNA có cấu trúc kẹp tóc-hairpin loop, S
1
nuclease cắt bỏ);
 Phiên mã ngược tạo cDNA theo kỹ thuật RACE (rapid
amplification of cDNA ends): kỹ thuật nhân nhanh đầu cuối
cDNA.
 Video cDNA libraries
www.themegallery.com
 Ưu điểm sử dụng ngân hàng cDNA:
 Các dòng c-DNA chứa trình tự mã hoá liên tục của
một gen;

0
C);
3. Ủ dài, tổng hợp (72
0
C).
 Sử dụng các đoạn mồi (primer) để bắt cặp bổ sung với đầu
đoạn mạch tương ứng;
 DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, vi khuẩn
Thermophilus aquatus) www.themegallery.com
Phương pháp PCR
www.themegallery.com
Phương pháp PCR
 Phản ứng PCR:
 Khuôn mẫu (DNA cần khuếch đại);
 Các đoạn mồi (primer ~18-25 Nucleotide);
 DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase);
 Các nucleotide tự do (dNTP);
 Dung dịch đệm thích hợp;
 Video phản ứng PCR www.themegallery.com
Phương pháp PCR
 Lợi ích:
 Khuếch đại các trình tự nucleotide đặc hiệu
 Thời gian thực hiện cực nhanh;
 Đơn giản và ít tốn kém;
www.themegallery.com
 Phương pháp hoá học xác định trình tự
DNA của Maxam và Gilbert:
1. Đánh dấu đồng vị phóng xạ P
32
ở đầu 5’ của DNA;
2. Xử lí với hoá học làm biến đổi 1 hay 2 base
(dimethylsulphate làm biến đổi Guanine, hydrazine và
NaCl làm biến đổi Cytosine…);
3. Các Nucleotide biến đổi sẽ bị lấy ra khỏi chuỗi DNA;
4. 4 loại Nucleotide4 nhóm với 4 bản điện di  Tổng
hợp đầy đủ 4 bản điện di sẽ phản ánh đầy đủ trình tự
các nucleotide của đoạn DNA. Kỹ thuật xác định trình
tự DNA
www.themegallery.com
 Phương pháp hoá học xác định trình tự
DNA của Maxam và Gilbert:

Kỹ thuật xác định trình
tự DNA
www.themegallery.com
 Phương pháp hoá học xác định trình tự DNA của
Maxam và Gilbert:

Kỹ thuật xác định trình

www.themegallery.com
 Các phương
pháp xác định
trình tự DNA
thế hệ mới:
 Dùng 4 màu
huỳnh quang khác
nhau để đánh dấu
4 loại dNTP
Kỹ thuật xác định trình
tự DNA
www.themegallery.com
Kỹ thuật xác định trình
tự DNA
Kỹ thuật giải trình tự 454
pyrosequencing
Kỹ thuật giải trình tự dựa trên sự
nối với chất hoá học 4 màu