Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
THU NHẬN ENZYM PAPAIN
THU NHẬN ENZYM PAPAINTỪ ĐU ĐỦ
TỪ ĐU ĐỦ
Nhóm HTV:
Nhóm HTV:Phan Huy Huy
Phan Huy Huy
Phạm Quốc Trung
Phạm Quốc Trung
Lư Quốc Việt
Lư Quốc Việt
Nhóm: HTV 1
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
I.
I.
TỔNG QUAN VỀ ENZYM PAPAIN [2]:
TỔNG QUAN VỀ ENZYM PAPAIN [2]:Hình
HìnhI.1: Nguồn nguyên liệu thu nhựa
I.1: Nguồn nguyên liệu thu nhựa

cơng bố báo cáo của mình trong tạp chí “Calaitta Medical Journal’’. Đến năm 1879, Wrutz
cơng bố báo cáo của mình trong tạp chí “Calaitta Medical Journal’’. Đến năm 1879, Wrutzvà Bouchet là những người đầu tiên sử dụng thuật ngữ “papain” để diễn tả tính chất phân
và Bouchet là những người đầu tiên sử dụng thuật ngữ “papain” để diễn tả tính chất phânhuỷ protein của enzym trong nhựa đu đủ. Ngày nay, thuật ngữ “papain” tiếp tục được sử
huỷ protein của enzym trong nhựa đu đủ. Ngày nay, thuật ngữ “papain” tiếp tục được sửdụng để miêu tả mủ đu đủ khơ được dùng rộng rãi trong cơng nghiệp và cả trong chế phẩm
dụng để miêu tả mủ đu đủ khơ được dùng rộng rãi trong cơng nghiệp và cả trong chế phẩmenzym thuỷ phân dạng kết tinh từ mủ.
enzym thuỷ phân dạng kết tinh từ mủ.
Nhóm: HTV 2
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trãi rộng khắp tồn bộ cây, ngoại trừ rễ.
Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trãi rộng khắp tồn bộ cây, ngoại trừ rễ.Quả xanh vào khoảng 10 tuần tuổi chứa nhiều nhựa nhất. Nhựa là hỗn hợp enzyme chứa
Quả xanh vào khoảng 10 tuần tuổi chứa nhiều nhựa nhất. Nhựa là hỗn hợp enzyme chứacác protease sau: papain, chymopapain A (gốc aa cuối là glutamic acid), chymopapain B
các protease sau: papain, chymopapain A (gốc aa cuối là glutamic acid), chymopapain B

20
(10
(10
-7
-7
giây.cm
giây.cm
2
2
)
)
10,27 ± 0,13
10,27 ± 0,13
Phân tử lượng
Phân tử lượng
20700
20700
Độ triền quang [
Độ triền quang [
α
α
]D
]D
-66,7
-66,7
o
o
Độ xoắn
Độ xoắn
17%


Cấu tạo hóa học
Cấu tạo hóa học:
:
-
-
Papain là một endoprotease chứa 16,1% N và 1,2% S.
Papain là một endoprotease chứa 16,1% N và 1,2% S.
-
-
Theo kết quả phân tích bằng tia X, papain là một chuỗi polypeptide gồm 212
Theo kết quả phân tích bằng tia X, papain là một chuỗi polypeptide gồm 212amino acid không chứa methionine, đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine,
amino acid không chứa methionine, đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine,có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vò trí 22-63, 56-95, 153-200
có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vò trí 22-63, 56-95, 153-200không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính chất bền vững của cấu trúc và
không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính chất bền vững của cấu trúc vàmột nhóm –SH tự do ở vò trí cysteine 25.

Phân tử papain có hai nhân kỵ nước, mỗi nhân nằm ở một phần của papain và cả hainhân đều bắt đầu với một chuỗi xoắn
nhân đều bắt đầu với một chuỗi xoắn
α
α
. Ngoài ra trong phân tử còn chứa một số cầu nối nội
. Ngoài ra trong phân tử còn chứa một số cầu nối nộiphân tử.
phân tử.


Cấu trúc tâm hoạt động của papain:
Cấu trúc tâm hoạt động của papain:
Tâm hoạt động của papain gồm nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của
Tâm hoạt động của papain gồm nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 củahistidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên
histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liênkết hydrogen.
kết hydrogen.
Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là:
Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là:
Lys – Asp – Glu – Gly – Ser – Cys – Gly – Ser – Cys.

k
ki + k = n
i + k = n
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành các amino acid
Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành các amino acid
So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng
So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năngthủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu
thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầuhết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxyl tự
hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxyl tựdo. Papain có thể nhận biết một chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ chất peptide của mình và sẽ
do. Papain có thể nhận biết một chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ chất peptide của mình và sẽưu tiên cắt liên kết peptide trên một chuỗi có phenylalanine như sau: nếu peptide có dạng X-
ưu tiên cắt liên kết peptide trên một chuỗi có phenylalanine như sau: nếu peptide có dạng X-
Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papain sẽ cắt tại vò trí giữaY và Z, nhưng nếu
Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papain sẽ cắt tại vò trí giữaY và Z, nhưng nếu


chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để thu đượchoạt tính cao nhất thì thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine
hoạt tính cao nhất thì thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteineđóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion
đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ionkim loại nặng có trong nhựa đu đủ.
kim loại nặng có trong nhựa đu đủ.


Bất hoạt:
Bất hoạt:
Papain bò kìm hãm (ức chế bất thuận nghòch) bởi các chất oxi hoá như: O
Papain bò kìm hãm (ức chế bất thuận nghòch) bởi các chất oxi hoá như: O
2
2
, O
, O
3
3
, H
, H
2
2
O

2
2
N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)
N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)
n
n
+ HOH (H
+ HOH (H
2
2
N-CH(R)-COOH)
N-CH(R)-COOH)
n’
n’
+ (H
+ (H
2
2
N-CH(R)-CO-)
N-CH(R)-CO-)
k’
k’n’ + k’ = n
n’ + k’ = n
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ


Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính papain:

hoạt hóa vào dung dòch vì cấu trúc tâm hoạt động của enzym đã bò phá hủy hoàn toàn.
Papain đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở
Papain đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể có độ bền nhiệt thấp hơn papain ởtrong mủ nhựa, vì trong mủ nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó. Papain
trong mủ nhựa, vì trong mủ nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó. Papaintrong dung dòch NaCl giữ ở 4
trong dung dòch NaCl giữ ở 4
o
o
C bền trong nhiều tháng. Trong dung dòch dẫn xuất thủy ngân,
C bền trong nhiều tháng. Trong dung dòch dẫn xuất thủy ngân,papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng, trong khi enzym mất hoạt tính mỗi ngày
papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng, trong khi enzym mất hoạt tính mỗi ngày1-2% do sự tự phân hoặc oxi hoá. Papain dạng ổn đònh (có cấu trúc không gian ổn đònh) ở
1-2% do sự tự phân hoặc oxi hoá. Papain dạng ổn đònh (có cấu trúc không gian ổn đònh) ởtrạng thái khô có thể chòu được nhiệt độ sấy ở 115
trạng thái khô có thể chòu được nhiệt độ sấy ở 115
o
o
C trong 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được


trong dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M, nhưng trong dung dòch TCA
trong dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M, nhưng trong dung dòch TCA10% papain bò biến đổi bất thuận nghòch.
10% papain bò biến đổi bất thuận nghòch.
Nhóm: HTV 6
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
II.
II.
PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PAPAIN [2], [4], [7]:
PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PAPAIN [2], [4], [7]:
Quy trình công nghệ:
Quy trình công nghệ:
Nguyên liệu
Nghiền
Trích ly
bã
cát sạch
celite
Lọc
Chỉnh pH
Lọc
Kết tủa
bã
tủa
xám
NaOH
(NH


Nhựa là hỗn hợp enzym chứa các protease sau: papain, chymopapain A (gốc amino acid cuối
Nhựa là hỗn hợp enzym chứa các protease sau: papain, chymopapain A (gốc amino acid cuốilà glutamic acid), chymopapain B (gốc amino acid cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase
là glutamic acid), chymopapain B (gốc amino acid cuối là tyrosine), proteinase III, proteinaseIV, thiolprotease, trong đó papain chiếm tới 95%.
IV, thiolprotease, trong đó papain chiếm tới 95%.


Điều kiện lấy nhựa:
Điều kiện lấy nhựa:
-
-
Cây đang sinh trưởng tốt, không bò sâu bệnh, thân cây mập mạp cho nhựa
Cây đang sinh trưởng tốt, không bò sâu bệnh, thân cây mập mạp cho nhựanhiều.
nhiều.
-
-
Quả: lấy ở những quả còn xanh, vỏ mòn, từ 0,3 – 1kg, độ 10 tuần tuổi là tốt
Quả: lấy ở những quả còn xanh, vỏ mòn, từ 0,3 – 1kg, độ 10 tuần tuổi là tốtnhất.

Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4 - 6 phút, lấynhựa xong phải đậy nắp kín, giữ trong tối và bảo quản lạnh trong thời gian chờ
nhựa xong phải đậy nắp kín, giữ trong tối và bảo quản lạnh trong thời gian chờcác công đoạn xử lý tiếp theo. Mục đích của giai đoạn này là tránh không cho
các công đoạn xử lý tiếp theo. Mục đích của giai đoạn này là tránh không chonhựa tiếp xúc lâu với không khí, đảm bảo hoạt tính papain có trong nhựa. Khi
nhựa tiếp xúc lâu với không khí, đảm bảo hoạt tính papain có trong nhựa. Khilấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc côn trùng lẫn vào.
lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc côn trùng lẫn vào.
Nhóm: HTV 8
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
Hình II.1.2: Công nhân đang thu nhận nhựa từ trái đu đủ
Hình II.1.2: Công nhân đang thu nhận nhựa từ trái đu đủ
•
•
Lưu ý:
Lưu ý:
-
-
Không nên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì sẽ làm giảm chất lượng nhựa.
Không nên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì sẽ làm giảm chất lượng nhựa.
-

Thu nhận papain :
2.1.
2.1.
Chuẩn bò:
Chuẩn bò:
Do trong nhựa đu đủ tươi ngoài papain, chymopapain còn có một số loại enzym,
Do trong nhựa đu đủ tươi ngoài papain, chymopapain còn có một số loại enzym,protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác nên để có được quy trình tách
protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác nên để có được quy trình táchvà làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ nhằm
và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ nhằmloại bỏ các tạp chất trên. Cách làm như sau:
loại bỏ các tạp chất trên. Cách làm như sau:
-
-
Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150g cát sạch, nghiền kó trong cối ở
Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150g cát sạch, nghiền kó trong cối ởnhiệt độ phòng với 200-300mL dung dòch cysteine 0,04M (hòa tan 6,3g cystein
nhiệt độ phòng với 200-300mL dung dòch cysteine 0,04M (hòa tan 6,3g cysteinNhóm: HTV 9

5,7.
-
-
Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzym được tiến hành trong điều kiện
Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzym được tiến hành trong điều kiệnlạnh.
lạnh.
2.2.
2.2.Loại bỏ các chất không tan ở pH 9:
Loại bỏ các chất không tan ở pH 9:
Thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110mL dung dòch NaOH 1M để điều
Thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110mL dung dòch NaOH 1M để điềuchỉnh pH của dòch chiết thu được ở trên lên pH 9. Lọc hoặc ly tâm ở 2600 vòng/phút trong 1
chỉnh pH của dòch chiết thu được ở trên lên pH 9. Lọc hoặc ly tâm ở 2600 vòng/phút trong 1giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dòch trích trong.
giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dòch trích trong.
2.3.
2.3.
Quá trình phân đoạn bằng (NH
Quá trình phân đoạn bằng (NH
4

2
SO
SO
4
4
40% độ bão hòa.
40% độ bão hòa.
2.4.
2.4.Quá trình phân đoạn bằng NaCl:
Quá trình phân đoạn bằng NaCl:
Hòa tan tủa trong 600mL dung dòch cysteine 0,02M, dung dòch thu được có pH 7-7,5,
Hòa tan tủa trong 600mL dung dòch cysteine 0,02M, dung dòch thu được có pH 7-7,5,sau đó thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau một giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút trong 1 giờ để thu tủa,
sau đó thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau một giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút trong 1 giờ để thu tủa,bỏ dòch lỏng.
bỏ dòch lỏng.
2.5.
2.5.
Kết tinh:
Kết tinh:
Hoà tan tủa với 400mL dung dòch cysteine 0,002M ở nhiệt độ phòng thu được một
Hoà tan tủa với 400mL dung dòch cysteine 0,002M ở nhiệt độ phòng thu được một


hòa (10mL/300mL dung dòch protein). Khi 75% thể tích dung dòch NaCl đã cho vào, papainbắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dòch huyền phù được giữ ở 4
bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dòch huyền phù được giữ ở 4
o
o
C qua đêm, sau đó ly tâm
C qua đêm, sau đó ly tâmlạnh ở 2500 vòng/phút trong 4 - 5 giờ để thu nhận tinh thể. Hoạt độ riêng của enzym có thể
lạnh ở 2500 vòng/phút trong 4 - 5 giờ để thu nhận tinh thể. Hoạt độ riêng của enzym có thểtăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên.
tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên.
Để tăng hoạt tính enzym, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể papain trong
Để tăng hoạt tính enzym, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể papain trongdung dòch đệm phosphate chứa cysteine, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A
dung dòch đệm phosphate chứa cysteine, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A
o
o
và
vàđem kết tinh dòch lỏng thu được sau siêu lọc.

nhau.
•
•
Trong công nghệ thực phẩm:
Trong công nghệ thực phẩm:
Protease, trong đó có papain được sử dụng rất rộng rãi trong chế biến thòt, cá và đã
Protease, trong đó có papain được sử dụng rất rộng rãi trong chế biến thòt, cá và đãmang lại hiệu quả kinh tế cao. Với phương pháp này, người ta có thể biến đổi những loại thòt
mang lại hiệu quả kinh tế cao. Với phương pháp này, người ta có thể biến đổi những loại thòtcá rẻ tiền, khô cứng, những phần không ngon thành các chế phẩm có tính chất tốt hơn.
cá rẻ tiền, khô cứng, những phần không ngon thành các chế phẩm có tính chất tốt hơn.
Nhóm: HTV 11
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
Trong quy trình sản xuất bột cá cổ điển, người ta lợi dụng hệ enzym VSV thuỷ phân
Trong quy trình sản xuất bột cá cổ điển, người ta lợi dụng hệ enzym VSV thuỷ phânprotease có sẵn trong trong cá để phân giải các protein trong thời gian dài và ở nhiệt độ thích
protease có sẵn trong trong cá để phân giải các protein trong thời gian dài và ở nhiệt độ thíchhợp. Ngày nay, việc bổ sung chế phẩm enzym, đặc biệt là papain không những rúùt ngắn thời
hợp. Ngày nay, việc bổ sung chế phẩm enzym, đặc biệt là papain không những rúùt ngắn thờigian thuỷ phân mà còn ngăn ngừa được các vi khuẩn gây thối, do nhiệt độ hoạt động tối ưu

Lòng trắng
trứng
trứng
0
0
35,42
35,42
Albumin bò
Albumin bò
22,33
22,33
41,86
41,86
Protid cá
Protid cá
28,59
28,59
50,02
50,02
Protid tôm
Protid tôm
38,22
38,22
50
50
Ngoài ra, papain còn ngăn ngừa sự làm đục bia và các loại nước giải khát khi ướp lạnh
Ngoài ra, papain còn ngăn ngừa sự làm đục bia và các loại nước giải khát khi ướp lạnhdo nó phân huỷ các vết protein hoà tan trong bia và các loại nước giải khát khác.


Staphylococus rất nhạy cảm với papain.
Staphylococus rất nhạy cảm với papain.
Papain có tác dụng giảm độc tố với toxin và toxabumin: 18mg papain trong dung dòch
Papain có tác dụng giảm độc tố với toxin và toxabumin: 18mg papain trong dung dòchtrung tính được 10mg rixin là chất độc có trong hạt thầu dầu, 2mg papain trung tính được 4
trung tính được 10mg rixin là chất độc có trong hạt thầu dầu, 2mg papain trung tính được 4liều độc của toxin uốn ván .
liều độc của toxin uốn ván .
Dung dòch papain cysteine salicilate c ó công dụng chữa bỏng.
Dung dòch papain cysteine salicilate c ó công dụng chữa bỏng.
•
•
Trong các ngành công nghệ khác :
Trong các ngành công nghệ khác :
Papain làm mềm da trong công nghệ thuộc da. Len đã qua xử lý papain sẽ tăng độ
Papain làm mềm da trong công nghệ thuộc da. Len đã qua xử lý papain sẽ tăng độsạch và nhuộm được những màu sống động. Trong công nghệ sản xuất dầu cá, nếu cho
sạch và nhuộm được những màu sống động. Trong công nghệ sản xuất dầu cá, nếu chopapain tác dụng trước lên gan thì việc tách dầu sẽ dễ dàng hơn và chất lượng dầu cũng tăng
papain tác dụng trước lên gan thì việc tách dầu sẽ dễ dàng hơn và chất lượng dầu cũng tăng


hoạt tính 80000u/g
Hình III.5:
Hình III.5:
Chế phẩm enzym thô,
Chế phẩm enzym thô,
hoạt tính 800000u/g
hoạt tính 800000u/g
Hình III.6:
Hình III.6:
Chế phẩm papain tinh khiết,
Chế phẩm papain tinh khiết,
Hoạt tính 2000000 – 2300000u/g
Hoạt tính 2000000 – 2300000u/g
Hình III.7:
Hình III.7:
Bột enzym papain, trong đó
Bột enzym papain, trong đó
thành phần chứa 362,5mg papain và không
thành phần chứa 362,5mg papain và không
chứa nấm men, bột mì, đậu nành, bắp,
chứa nấm men, bột mì, đậu nành, bắp,
đường, chất tạo ngọt tẩng hợp, chất màu,
đường, chất tạo ngọt tẩng hợp, chất màu,
mùi và chất bảo quản
mùi và chất bảo quản
Nhóm: HTV 14
Đề tài: Thu nhận enzym papain từ trái đu đủ
Hình III.8:
Hình III.8:
Chế phẩm hỗn hợp enzym bromelin , papain và một số chất khác.

Trường Đại học Dược Hà Nội.
[4]. Rubens Monti, Carmelita A. Basilio, Henrique C. Trevisan and Jonas, “
[4]. Rubens Monti, Carmelita A. Basilio, Henrique C. Trevisan and Jonas, “
Purification
Purification
from fresh latex of Carica papaya”
from fresh latex of Carica papaya”
, Braz. Arch. Biol. Tech., Vol 43, 501-507, 2000.
, Braz. Arch. Biol. Tech., Vol 43, 501-507, 2000.
[5].
[5].


/
/
[6].
[6].
hritist_agriculture.com/
hritist_agriculture.com/[7]. http://
[7]. http://
www.javely.com/
www.javely.com/[8].
[8].


II. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PAPAIN tr7
II.1 Thu nhận nhựa đu đủ tr8
II.1 Thu nhận nhựa đu đủ tr8
II.2 Thu nhận papain tr9
II.2 Thu nhận papain tr9
III. ỨNG DỤNG tr11
III. ỨNG DỤNG tr11
Nhóm: HTV 16