Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
––––––––––––––––– NGUYỄN QUỐC NAM HẢI

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN
HÓA HỌC CỦA LÁ CÂY CÀ PHÊ CHÈ
(COFFEA ARABICA, RUBIACEA)

L
L
U
U
Ậ

H
O
O
Á
ÁH
H
Ọ
Ọ
C
C
THÁI NGUYÊN - 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
–––––––––––––––––


Ă
N
NT
T
H
H
Ạ
Ạ
C
CS
S
Ĩ
ĨH
H
O
O
Á
ÁH

NGUYỄN QUỐC NAM HẢI Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
LỜI CẢM ƠN

Bản luận văn này đƣợc hoàn thành tại phòng Hoạt chất Sinh học, Viện
Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc của mình tới TS.
Nguyễn Quyết Tiến, TS. Phạm Thị Hồng Minh, PGS.TS. Phạm Văn Thỉnh
những ngƣời thầy đã chỉ ra hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn tận tình, động viên
và giúp đỡ từng bƣớc đi của tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện luận văn.
Xin chân thành cảm ơn Phòng Hoạt chất Sinh học, Phòng Nghiên cứu
Cấu trúc -Viện Hóa học đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi
để tôi hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu.
Nhân dịp này, tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh
đạo Khoa Hóa, Khoa Sau đại học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên, Sở
giáo dục và đào tạo tỉnh Bắc Ninh, Ban Giám hiệu Trƣờng THPT Thuận Thành
số 3 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bố, Mẹ tôi, những ngƣời thân
trong gia đình và các đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi rất nhiều trong
quá trình thực hiện luận văn.

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2009
Tác giả


1.3.2.2.2. Xác định hàm lượng ancaloit bằng phương pháp “không nước”. 15
1.3.3. Phƣơng pháp phân lập ancaloit 15
1.3.3.1. Chiết tách phân lập ancaloit bằng phương pháp bazơ - dung môi
hữu cơ 15
1.3.3.2. Chiết tách phân lập ancaloit bằng phương pháp axit-nước 16
1.3.4. Phân loại các ancaloit quan trọng trong Y dƣợc theo khung cơ bản 16

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
1.3.4.1. Ancaloit khung indol 17
1.3.4.2. Ancaloit khung pyridin - (pyperidin) 18
1.3.4.3. Ancaloit vòng ngưng tụ pyrrolidin-pyperidin (khung tropan) 20
1.3.4.4. Ancaloit khung ruban (quinin, quinidin, cinchonin, cinchonidin) 21
1.3.4.5. Ancaloit khung benzyl-isoquinolin 22
1.3.4.6. Ancaloit khung morphinan 23
1.3.4.7. Ergot ancaloit (dẫn xuất axit lysergic) 23
1.3.4.8. Ancaloit khung imidazol 24
1.3.4.9. Ancaloit strychnin 25
1.3.4.10. Ancaloit kháng sinh 25
Chƣơng 2. THỰC NGHIỆM 30
2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu 30
2.1.2. Phƣơng pháp ngâm chiết 31
2.1.3. Thử hoạt tính sinh học 31
2.1.4. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ dịch chiết 31
2.1.5. Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc hoá học các chất 31
2.2. DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 32
2.2.1. Dụng cụ, hoá chất 32
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu 33
2.3. THU NHẬN CÁC DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY CÀ PHÊ CHÈ 33

36
H
74
O 46
3.2.2. Các hợp chất sterol 46
3.2.2.1.

-Sitosterol 47
3.2.2.2. Stigmast-5,22-dien-24R-3

-ol 47
3.2.2.3. 3

-Sitostery-1l-O-

-D-glucopyranosit 49
3.2.2.4. Hợp chất axit lupan-3β-hydroxi-12(13)-en-28-oic (COF18E3-C
30
H
48
O
3
) 50
3.2.2.5. Hợp chất cafein (COF.An – C
8
H
10
N
4
O

13
C- Nuclear Magnetic Resonance
DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
COSY : Correlated Spectroscopy
HMQC : Heteronuclear Multiple - Quantum Coherence
HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation
 Các lĩnh vực khác
MIC : Minimum inhibitory concentration
HIV : Human Immunodeficiency Virus
đvC : Đơn vị Cacbon
v/v : Thể tích/thể tích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9
DANH MỤC CÁC BẢNG Trang
Bảng 2.1: Các hệ dung môi triển khai SKLM 32
Bảng 2.2: Khối lƣợng cặn chiết từng phân đoạn của lá cây Cà phê chè 35
Bảng 2.3: Kết quả định tính nhóm các chất trong lá cây Cà phê chè 37
Bảng 2.4: Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các cặn
chiết của lá cây Cà phê chè 39
Bảng 3.1: Số liệu phổ 13C-NMR (CDCl3, 125MHz) của một số sterol
trong lá cây cà phê chè (Coffea arabica) 48
Bảng 3.2: Bảng tƣơng tác xa C  H(HMBC) của COF18E3 59
Bảng 3.3: Bảng tƣơng tác xa C  H(HMBC) của COF.Anc 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

thực vật đƣợc sử dụng làm thuốc trong y học dân gian [5].
Từ xƣa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức
quan trọng trong đời sống của con ngƣời. Ngày nay, những hợp chất tự nhiên
có hoạt tính sinh học đƣợc phân lập từ cây cỏ đã đƣợc ứng dụng trong rất
nhiều ngành công nghiệp cũng nhƣ ngành nông nghiệp, chúng đƣợc sản xuất
thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công
nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm…
Ngày nay, ngành công nghệ tổng hợp hoá dƣợc phát triển mạnh mẽ đã
tạo ra các biệt dƣợc khác nhau đƣợc sử dụng trong công tác phòng, chữa
bệnh nhờ đó giảm tỉ lệ tử vong, nâng cao tuổi thọ. Tuy nhiên, vai trò của
những thảo dƣợc không vì thế mất đi chỗ đứng trong Y học. Nó vẫn tiếp tục
đƣợc dùng làm nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất dẫn
đƣờng (lead-compounds) cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những
dƣợc phẩm mới đáp ứng cho việc điều trị các chứng bệnh thông thƣờng cũng
nhƣ các bệnh nan y (Ung thƣ, HIV, ).
Trên cơ sở trên cho thấy, nguồn cây thuốc dân gian cũng nhƣ các bài
thuốc của đồng bào dân tộc vẫn là kho tàng vô cùng quí giá để khám phá,
tìm kiếm các loại thuốc mới có hiệu lực cao cho công tác phòng và chữa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
bệnh. Việc nghiên cứu cây thuốc đã giúp cho chúng ta hiểu rõ về thành
phần và cấu trúc hoá học, hoạt tính sinh học, tác dụng dƣợc lí của cây
thuốc. Từ đó, ngƣời ta có thể tạo ra các chất mới có hoạt tính sinh học cao
hơn để làm thuốc chữa bệnh.
Cây Cà phê chè (Coffea arabica) không chỉ là một cây công nghiệp
quan trọng, mà nó còn là một trong những dƣợc liệu quí. Ở Malaysia và
Indonesia ngƣời ta sử dụng lá cây Cà phê chè sắc nƣớc để làm thuốc lợi tiểu.
Lá cây Cà phê chè còn đƣợc dùng điều trị các bệnh hen xuyễn, nhiễm độc
atropin, cúm, đau đầu, nhiễm độc thuốc phiện. Ngoài ra, đồng bào dân tộc

1.1.2. Những nghiên cứu về thành phần hoá học
Từ các bộ phận của các loài cà phê, ngƣời ta đã phân lập đƣợc một
số lớp chất nhƣ: glycosit (este), ancaloit, aminoaxit, tecpenoit và các amit
[9], [20].

Ancaloit:
NH
2
H
NO
O
H
N
NH
2
O
OH

NH
O
CH
3
N
OH
CH
3

1.1 Axit allantoic
1.2a 3-Metylindolin-2-on
1.2b 2-Hydroxy-3-metyl-1H-indol

N
O
H
3
CO
N
NH
3
C
CH
3
O
CH
3

1.3 Caffein
1.4 Liberin
1.5 Methylliberin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
Glycosit:

O
OH
OH
HO
O
HO
O

O
O
HO
OH
6-O--D-Apiofuranosyl-
1-O-3-Methyl-2-butenoyl-D-glucoz¬

1.8
O
O
OH
OH
HO
O
O
OH
HO
HO
OH

O
O
O
OH
HO
O
OH
HO
HO
OH

1.11Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5
Amit

N
H
HN
O
OH
O
HO
N-coumaroyltryptophan

1.12
N
H
HN
O
OH
O
HO
N-Caffeoyltryptophan
OH

1.13

N

nhiều nơi trên thế giới nhƣ: Suriman, Jamaica, Tây Ấn, Trung Mỹ, Yemen,
Việt Nam …[39]
Ở nƣớc ta, cây cà phê chè đƣợc trồng lần đầu tiên vào năm 1984, lấy
giống từ Cuba. Cho đến nay đã phát triển rộng rãi ra các tỉnh Quảng Ninh,
Đắk Lắk, Đắk Nông, Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng…[6], [45], [46]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
Đặc điểm sinh trƣởng và phát triển: Cây có tán lớn màu xanh đậm, lá
hình bầu dục chiều dài 12cm rộng 5 cm. Cây trƣởng thành có thể cao từ 4 - 6
m, nếu để mọc hoang dã có thể cao tới 15 m. Hoa màu trắng, nhị vàng, hoa
thƣờng nở về đêm và nở hết vào 4 - 5 giờ sáng, cây cà phê chè có khả năng tự
thị phấn cao khoảng 90%. Quả hình oval, mỗi quả chứa hai hạt cà phê.

Hình 2.1: Cây Cà phê chè (Coffea arabica)

Cây Cà phê chè đƣợc trồng chủ yếu ở các nƣớc có khí hậu nhiệt đới.
Tuy nhiên điều kiện thuận lợi nhất cho sự phát triển của cây Cà phê chè là
những vùng đất cao từ 1375-1830 m và khô ráo. Nhiệt độ thích hợp từ 16-25
0
C,
lƣợng mƣa khoảng trên 1000 mm. Cà phê chè sau khi trồng khoảng 3 đến 4
năm thì có thể bắt đầu cho thu hoạch cho đến 25 năm thì dừng lại. Thực tế
nó có thể sống đƣợc khoảng 70 năm [1], [5], [6], [38-44].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7
Đây là loài cây có giá trị kinh tế nhất trong các loài cà phê, nó chiếm
61% các sản phẩm cà phê trên toàn thế giới. Colombia và Brasil là hai nƣớc

qua lạc: 12g, Vƣơng bất lƣu hàng: 12g. Sắc uống.
Tác dụng: Thanh nhiệt lợi thấp, thông lâm, bài thạch. Trị thấp nhiệt hạ
chú, uất kết lâu ngày làm cho tạp chất của nƣớc tiểu đọng lại thành sỏi, đƣờng
tiểu có sỏi.
* Niệu Lộ Bài Thạch Thang: Biển súc: 24g, Chi tử: 20g, Chỉ xác: 10g,
Chích thảo: 10g, Cù mạch: 15g, Đại hoàng: 12g, Hoạt thạch: 15g, Kim tiền thảo
30g, Mộc thông: 10g, Ngƣ tất 15g, Thạch vi: 30g, Xa tiền sử: 24g. Sắc uống.
Tác dụng: Tiêu sỏi, thông lâm, hành khí, hoá ứ, thanh lợi thấp nhiệt. Trị
thấp hạ chú, sỏi ở đƣờng tiểu.
Bài thuốc này thích hợp với các chứng sau:
+ Sỏi có đƣờng kính ngang nhỏ hơn 1cm, đƣờng kính dài nhỏ hơn 2cm.
+ Hệ tiết niệu không có dị dạng về giải phẫu và những biến đổi bệnh lý.
* Liệu Lộ Kết Thạch Thang: Bạch vân linh: 10g, Hải kim sa: 15g, Hoạt
thạch: 12g, Hổ phách: 3g, Kim tiền thảo: 15g, Mộc thông: 6g, Thanh bì: 10g,
Xa tiền tử: 10g. Sắc uống.
Tác dụng: lợi thấp, hoá ứ, trị sỏi ở bàng quang.
* Thược Dược Cam Thảo Thang Gia Vị: Bạch thƣợc, Trân châu mẫu:
30g, Cam Thảo, Đàn hƣơng, Nga truật, Nguyên hồ, Hồi hƣơng đều: 10g, Điền
sâm, Mạch môn, Bạch vân linh đều 12g. Sác uống.
Tác dụng: Hoãn cấp, chỉ thống. Trị thận hƣ, lƣng đau, khí âm đều suy,
khí nghịch, sỏi niệu quản.
* Phụ Kim Thang: Kim tiền thảo: 30g, Phụ tử 12g, Thục địa: 20g,
Trạch tả 10g. Sắc uống.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9
Tác dụng: Ôn thận, hành thuỷ. Trị thận khí hƣ tổn, sỏi đƣờng tiểu
[28-36]. Hầu hết các bài thuốc trị sỏi thận ở trên gồm nhiều vị thuốc phổ
biến có mặt Kim tiền thảo, điều trị kéo dài. Riêng bài thuốc cổ truyền của
dân tộc Dao, thuộc loại độc vị, đó là bài thuốc cổ truyền khá độc đáo chỉ sử

chứa nitơ quan trọng nhất, cho dù trong những năm gần đây có rất nhiều dƣợc
phẩm dị vòng chứa nitơ đã đƣợc tổng hợp và đƣa ra chữa bệnh.
Trong cùng một thực vật, các ancaloit thƣờng có cấu trúc hóa học gần
giống nhau. Ancaloit trong tự nhiên phần lớn thƣờng ở dạng liên kết (dạng
muối) với các axit hữu cơ đơn giản (axit axêtic, axit oxalic, axit sữa, táo, axit
2,3-dihydroxisuccinic, axit chanh, ), đôi khi trong một vài thực vật (đặc biệt
trong các thực vật giàu ancaloit) các ancaloit chỉ liên kết với các axit hữu cơ
đặc chƣng với chúng nhƣ: axit fumaric, axit cevadinic, axit meconic,
Phần lớn các ancaloit là hợp chất tinh thể rắn, một vài hợp chất trong số
chúng dạng lỏng có thể làm sạch bằng phƣơng pháp chƣng cất mà không bị
phân hủy (coniin, arecolin, nicotin ) ở nhiệt độ phòng. Các ancaloit rắn
thƣờng có vị đắng còn các ancaloit lỏng thƣờng có vị cay.
Các hợp chất ancaloit dạng bazơ tự do hầu hết không tan trong nƣớc,
tuy nhiên tan tốt trong chloroform. Trong các ancaloit thƣờng chứa các
cacbon bất đối, hoạt động quang học (α
D
) và thƣờng chỉ tồn tại trong thực vật
ở một dạng nhất định [21], [22].
1.3.2. Phƣơng pháp phân tích
1.3.2.1. Phân tích định tính
Ngƣời ta đã sử dụng khá nhiều thuốc thử để xác nhận sự có mặt của
ancaloit trong thực vật. Do cơ sở các phản ứng hóa học của ancaloit phần lớn
không rõ ràng, nên ngƣời ta chỉ phân biệt các phản ứng này là phản ứng màu
hoặc phản ứng tạo tủa.
1.3.2.1.1. Các phản ứng tạo tủa
 Thuốc thử Mayer (1865): K
2
HgI
4
[kali-thủy ngân (II) iodua -

O
10
)
4
], axit silicowonframic: Ngƣời
ta sử dụng dung dịch nƣớc 5% muối natri của nó, cho phản ứng rất nhạy với
ancaloit cho tủa màu trắng.
 Axit cheric (tannin): Tạo tủa vô định hình không màu hoặc trắng vàng.
 Muối Reinecke: NH
4
[Cr(SCN)
4
(NH
3
)
2
], Amoni-tetrarodanato-diammin-
cromat(III): Ban đầu, ngƣời ta sử dụng nó nhƣ tác nhân tạo tủa với các amin bậc
II và amin tercier. Rosenhaler đã sử dụng nó để xác nhận sự có mặt của các
ancaloit và cho tinh thể rất đặc trƣng.
 Natri-tetraphenyl-borat (Kalignost), Na[B(C
6
H
5
)
4
]: Ban đầu, ngƣời ta
sử dụng nó nhƣ tác nhân thử kali, sau đó đƣợc sử dụng thử ancaloit thông
thƣờng, cho tủa màu trắng trong axit axêtic.
Cần lƣu ý rằng: các amin tổng hợp tercier hoặc quaternary amin cũng

SO
4
đậm đặc + 5% ammoni-molibdat.
Xanh tím: Morphin
Xanh oliu: Hydrastin
 Tác nhân Mandelin: axit H
2
SO
4
đậm đặc + vanadin (axit H
2
SO
4
đậm
đặc + 5% ammoni-vanadat).
Xanh da trời sang đỏ: strichnin
 Tác nhân Marquis: Formaldehide + axit H
2
SO
4
đậm đặc (1ml axit
H
2
SO
4
đậm đặc + 1 giọt formaldehide).
Đỏ tím: Morphin và các dẫn xuất
 Tác nhân Arnold-Vitali: lƣợng nhỏ KNO
2
+ axit H

4
). Tác nhân gây nhiễu
trong khi đo nếu do thành phần axit (trong trƣờng hợp muối ancaloit đƣợc tạo
bởi các axit halogenid) có thể loại trừ bằng muối thủy ngân (II) axêtat.
Phƣơng pháp này có thể xác định hàm lƣợng cho cả các ancaloit có hằng số
phân ly nhỏ (pKb ≤7) nhƣ quinin hay papaverin [21], [22].
Để xác định hàm lƣợng ancaloit có thực hiện theo các phƣơng pháp sau:
1.3.2.2.1. Xác định hàm lƣợng ancaloit bằng phƣơng pháp phân tích trọng lƣợng
a) Kiềm hóa giải phóng ancaloit tự do trƣớc khi chuẩn độ
Để kiềm hóa, thông thƣờng ngƣời ta sử dụng amoniac, đôi khi là
natri-bicacbonat (NaHCO
3
) hoặc nƣớc vôi trong. Nếu kiềm hóa bằng dung
dịch kiềm mạnh (NaOH, KOH) có thể tạo ra các phản ứng không mong
muốn. Ví dụ: các hợp chất ancaloit dạng este (atropin) có thể bị xà phòng
hóa, các ancaloit dạng phenol (morphin) có thể tạo phenolat không thể
chiết đƣợc bằng chloroform

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
14
Một số bazơ dùng để giải phóng ancaloit tự do khỏi muối của nó nhƣ:
 NaOH: Muối quinidin, muối quinin, codein-phốtphat, dihydrocodeinon
- tartarat, dihydrocodein-tartarat.
 Amoniac (NH
3
): Muối của các este-ancaloit khung tropan, muối
clorua của các dẫn xuất morphin-ancaloit (không dùng cho muối
clorua của morphin), papaverin, ephedrin, pilocarpin, strichnin.
 Natri-bicacbonat (NaHCO
3

khan, lọc lấy dịch chiết CHCl
3
và tiến hành xác định hàm lƣợng ancaloit nhƣ
trên [21], [22].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
1.3.2.2.2. Xác định hàm lƣợng ancaloit bằng phƣơng pháp “không nước”.
Trƣớc khi chuẩn độ ngƣời ta cho dung dịch thủy ngân (II) axêtat (trong
axit axêtic băng) vào dung dịch axit axêtic băng của muối ancaloit-halogenua
để tạo ancaloit-axêtat và chất không tan thủy ngân (II) halogenua.
2 B.HCl + Hg(AcO)
2
→ 2 B. AcOH + HgCl
2

Thủy ngân (II) axêtat trong axit axêtic băng là một bazơ yếu không gây ảnh
hƣởng đến xác định hàm lƣợng ancaloit bằng phƣơng pháp chuẩn độ.
Ngoài ra, ngƣời ta còn sử dụng phƣơng pháp chuẩn độ axit thành phần
muối ancaloit. Ví dụ: Để xác định thành phần ancaloit thông qua muối clorua
của nó đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp sau.
Ngƣời ta cho CHCl
3
vào dung dịch nƣớc của ancaloit-clorua, lắc đều.
Sau đó, chuẩn độ dung dịch 2 pha bằng dung dịch NaOH 0.1N. Ancaloit tự do
tan vào trong CHCl
3
và muối NaCl tan vào nƣớc. Do vậy, có thể coi đây là
phƣơng pháp xác định lƣợng axit đơn giản. Phƣơng pháp này áp dụng cho các
ancaloit quinin và papaverin rất tốt.

ancaloit có thể thu đƣợc ngay sau khi cho dịch nƣớc axit chứa ancaloit qua cột
trao đổi ion dƣơng bằng cách dùng kiềm để giải phóng các ancaloit-bazơ tự
do đƣợc giữ lại trên cột trao đổi ion và với dung môi hữu cơ thích hợp
(chloroform, ete) rửa giải chúng ra khỏi cột, các bƣớc làm sạch tiếp theo thực
hiện giống nhƣ trƣờng hợp bazơ-dung môi hữu cơ.
1.3.4. Phân loại các ancaloit quan trọng trong Y dƣợc theo khung cơ bản
Theo hiểu biết ngày nay về các hợp chất ancaloit, thì thông thƣờng
chúng là các chất quang hoạt. Trong số các đồng phân của chúng thì đồng
phân quang học quay trái (L) có hoạt tính sinh học cao hơn rất nhiều so với
các đồng phân quay phải (D). Sản phẩm raxemic của chúng thƣờng có hoạt
tính nằm ở giữa đồng phân có hoạt tính cao hơn [2], [4], [21], [22].

Trích đoạn DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

---