ĐÀM THỊ HỒNG – Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng nấm

1

TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG NẤM ASPERGILLUS AWAMORI
VTCC-F312 SINH TỔNG HỢP XYLANASE
Đàm Thị Hồng, Đỗ Thị Tuyên và Quyền Đình Thi
*

1
Viện Công nghệ sinh học – Hà Nội
*Tác giả liên hệ: Quyền Đình Thi

- Viện Công nghệ sinh học - Hà Nội
Tel. 04.37.568.260; Fax: 04.38.363.144; E-mail: [email protected]
ABSTRACT
Optimization of some culture conditions for Aspergillus awamori VTCC- F312 producing xylanase
Xylanase is an endoenzyme catalyzing specific xylan hydrolysis. Xylanase have attracted considerable research
interest because of their potential industrial applications, including hydrolysis of lignocellulose to biofuel
fermentable sugars, breadmaking and clarification of beer and juices. Specific xylanase can be used in the
rearing, is food additives for animals in order to increase the body weight and enhance the meat quality as well as
food utilization efficiency in husbandary. Xylanase is produced by many bacteria and fungi. In this study, among
26 Aspergillus awamori strains, the A. awamori VTCC-F-312 strain (23,3 U/ml) produced the highest amount of
xylanase were screened. The culture time for highest xylanase production for the A. awamori VTCC-F-312 strain
(21,2 U/ml) was 96 hours after cultivation. The carbon source corncob induced the highest xylanase production
among tested carbon sources (sugar-cane bagasse, manioc residue, rice brand, corncob, peanut shell, dried
mandarin shell, xylan). Corncob with the concentration of 7% induced the A. awamori VTCC-F-312 strain
producing xylanase maximum with an activity of 31,9 U/ml. Fish powder was the best nitrogen source among
nitrogen sources tested ((NH
4

đã tối ưu một số điều kiện nuôi cấy của chủng Aspergillus oryzae DSM1863, Aspergillus
niger DSM1857, Aspergillus oryzae VTCC-F187 và Aspergillus niger VTCC-F017 (Do và cs.,
2009; Đỗ và cs, 2008b).
Trong bài báo này, chúng tôi tiến hành phân lập và sàng lọc chủng có khả năng sinh tổng hợp
xylanase cao từ 26 chủng Aspergillus awamori. Sau khi sàng lọc, chủng A. awamori VTCC-F-

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 19-Tháng 8-2009 2

312 có hoạt tính xylanase cao nhất được đưa vào tối ưu một số điều kiện nuôi cấy với mục
tiêu sản xuất chế phẩm enzyme trên quy mô công nghiệp.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chủng giống và môi trường nuôi cấy
Chủng A. awamori VTCC-F312 do Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học (Đại học Quốc
Gia Hà Nội) cung cấp. Chủng được nuôi cấy trong 3ml môi trường khoáng MTK (w/v): 0,5%
cao nấm men; 0,1% pepton; 1% xylan; 0,2% NaNO
3
; 0,1% K
2
HPO
4
; 0,05% MgSO
4
; 0,05%
KCl; pH 6,5; khử trùng (Bernier và cs,1983).
Hóa chất
Các hóa chất dùng trong thí nghiệm được cung cấp từ các hãng khác nhau: KH
2

hợp với các nồng độ khác nhau từ 0,5 đến 9%.
Tối ưu nguồn nitrogen
Trong môi trường nuôi cấy chủng nấm A. awamori VTCC-F-312 ban đầu MTK, nguồn
nitrogen sử dụng là pepton, nhưng không phù hợp để sản xuất chế phẩm enzyme do giá thành
rất cao. Với mục tiêu là sử dụng những nguồn nguyên liệu sẵn có, pepton được thay thế bằng
các nguồn nitrogen khác nhau như: bột đầu cá, bột đậu, cao thịt bò, casein, NH
4
NO
3
,
(NH
4
)
2
SO
4
.
Tối ưu nhiệt độ và pH nuôi cấy sinh tổng hợp xylanase
Để xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu, chủng nấm A. awamori VTCC-F-312 được nuôi lắc 96

ĐÀM THỊ HỒNG – Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng nấm

3

giờ với 200 vòng/phút trong môi trường khoáng MTK có bổ sung các nguồn carbon và
nitrogen đã được thay thế ở các nhiệt độ khác nhau 28˚C, 30˚C, 37˚C. Chủng nấm A. awamori
VTCC-F-312 được nuôi cấy 96 giờ trong môi trường nuôi cấy có pH thay đổi từ 3,0 - 8,0 ở
37˚C, lắc 200 vòng/phút để xác định pH môi trường tối ưu.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả

Lõi ngô 1,0 20,3 100
Trấu cám 1,0 9,8 48
Vỏ lạc 1,0 5,9 29
Vỏ quýt khô

1,0 11,6 57
Bã sắn 1,0 6,5 32
Xylan 1,0 10,9 54

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 19-Tháng 8-2009 4

0
40
80
120
0.5 2.5 4.5 6.5 8.5
Nồng độ cơ chất (%)
Hoạt tính xylanase tương đối (%)

Hình 2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợp xylanase của chủng
nấm A. awamori VTCC-F-312.
Ảnh hưởng của nguồn nitrogen
Chủng A. awamori VTCC-F-312 sinh tổng hợp xylanase cao nhất trong môi trường có nguồn
nitrogen là cao thịt đạt 33,7 UI/ml, muối vô cơ ammonium sulfate đạt 31,7 UI/ml, và bột đầu
cá đạt 27,3 UI/ml đều cao hơn so với dùng pepton (23,2 UI/ml).
Bảng 2. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến sinh tổng hợp xylanase từ chủng nấm A. awamori
VTCC-F-312


Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ bột đầu cá đến sinh tổng hợp xylanase của chủng nấm A. awamori
VTCC-F-312.

ĐÀM THỊ HỒNG – Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng nấm

5

Như vậy, chủng A. awamori VTCC-F-312 sinh tổng hợp xylanase cao nhất trong môi trường
có sử dụng nguồn nitrogen là cao thịt. Tuy nhiên, cao thịt là một nguyên liệu khá đắt tiền, nên
trong các quá trình thí nghiệm tiếp theo bột đầu cá sẽ được dùng làm nguồn nitrogen thay thế
cho cao thịt trong môi trường nuôi cấy (Bảng 2).
Bởi vì, trong môi trường có bột đầu cá, hoạt tính xylanase đạt 81% so với môi trường có bổ
sung cao thịt (100%). Để khảo sát nồng độ bột đầu cá tối ưu cho sinh tổng hợp xylanase, bột
đầu cá sẽ được khảo sát ở các nồng độ 1-7%. Hình 3 cho thấy, sau 96 giờ nuôi cấy hoạt tính
xylanase cao nhất ở nồng độ 6% bột đầu cá (133,1 UI/ml), ở các nồng độ 2%, 5%, 7% bột đầu
cá hoạt tính xylanase cũng rất cao đạt hơn 90% so với ở nồng độ 6% bột đầu cá (Hình 3).
Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sinh tổng hợp xylanase
Hoạt tính xylanase của chủng A. awamori VTCC-F-312 khá cao ở môi trường nuôi cấy có pH
3 (60,9 UI/ml), sau đó giảm dần trong vùng pH từ 4-5 và đạt cao nhất ở pH 6 (71,6 UI/ml)
(Hình 5).
0
40
80
120
3 4 5 6 7 8 9
Độ pH
Hoạt tính xylanase tương đối (%)

Hình 4. Ảnh hưởng của pH dịch nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp xylanase của chủng nấm A. awamori

với các nguồn carbon khác nhau: xylan từ bột yến mạch, xylan từ gỗ sồi và lõi ngô cho thấy
trong môi trường nuôi cấy chứa 3% lõi ngô cảm ứng sinh tổng hợp xylanase cao nhất sau 96
giờ nuôi cấy (Aachary and Prapulla, 2008).
Khi khảo sát khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp xylanase ngoại bào của chủng Aspergillus
sp. FP-470 trong môi trường có bổ sung xylan từ gỗ sồi, xylan bột yến mạch mịn, rơm lúa mì
và lõi ngô, hoạt tính xylanase đạt cao nhất trong môi trường chứa lõi ngô (Camacho and
Aguilar, 2003). Như vậy, là kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với các kết quả
nghiên cứu trên thế giới. Tuy nhiên, cũng có một số tác giả có kết quả khác như: Chủng nấm
A. niveus RS2 phân lập từ rơm rạ sinh tổng hợp xylanase cao nhất sau 5 ngày nuôi cấy và trấu
cám là một trong những nguồn cơ chất tốt nhất (Sudan and Bajaj, 2007). Chủng nấm A.
fumigatus sinh tổng hợp xylanase cao sau 48 giờ nuôi cấy và cao gấp 2,8 lần trong một môi
trường rắn tối ưu có các thành phần muối và 2% peptone và 1% cao nấm men (Thiagarajan và
cs., 2005).
Nghiên cứu khác trên chủng A. awamori cho thấy trong quá trình lên men rắn, khả năng sinh
tổng hợp xylanase ngoại bào cao nhất đạt 30UI/ml trong môi trường có nguồn carbon là bã
mía (Lemos và cs, 2001). Bột đầu cá là nguồn nitrogen sinh tổng hợp xylanase tốt nhất trong
số các nguồn nitrogen được khảo sát (Bảng 2). Trên chủng nấm A. fumigatus, A. niveus,
nguồn nitrogen tối ưu lại là cao nấm men, tiếp theo là ammonium sulfate và pepton (Sudan
and Bajaj, 2007). Khi nghiên cứu trên hai chủng nấm A. niger DSM 1975 và A. oyrzae DSM
1863, nguồn nitrogen cảm ứng sinh tổng hợp xylanase cao nhất là bột đậu. Bột đậu cũng là
nguồn nitrogen tốt nhất để sinh tổng hợp xylanase trên hai chủng A. niger VTCC-F-017 và A.
oryzae VTCC-F-187 (Do và cs, 2009; Đỗ và cs, 2008c).
Nhiệt độ 37˚C và pH 6 là tối thích cho chủng nấm A. awamori VTCC-F-312 sinh tổng hợp
xylanase (Hình 5, Bảng 4). Nhiệt độ và pH tối ưu cho sinh tổng hợp xylanase tương ứng là
30˚C và pH 7,0 ở chủng A. niger DSM1957 và A. oryzae DSM1863, bacillus subtilis G1 (Đỗ
và cs, 2008a; Đỗ và cs, 2008b). Nhiệt độ và pH tối ưu cho chủng nấm A. niger VTCC-F-017
tương ứng là 30˚C và pH 5,0 (Do và cs, 2009).
Xét trên dải pH rộng 3-8, khả năng sinh tổng hợp xylanase của chủng A. awamori VTCC-F-
312 có sự biến thiên tương đối rõ rệt. Khác với hai chủng A. niger DSM 1957 và A. oryzae
DSM 1863, trong dải pH 4 - 8 khả năng sinh tổng hợp xylanase vẫn tốt, hoạt tính xylanase đạt

Bernier RJ, Desrochers M, Jurasek L, Paice MG (1983) Isolation and Characterization of a Xylanase from
Bacillus subtilis. Appl Environ Microbiol 46 (2): p.511-514.
Đào Thị Hải Lý, Trần Hồng Phong, Mai Thị Hằng, (2006). Tuyển chọn và nghiên cứu đặc tính của xylanase từ
nấm mốc dùng cho chăn nuôi. Công nghệ sinh học 4:p.463-470
Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi, (2008a). Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng Bacillus
subtilis G1 sinh tổng hợp xylanase. Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV: p.439-442
Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi, (2008b). Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng nấm
Aspergillus niger DSM1957 và Aspergillus oryzae DSM1863 sinh tổng hợp xylanase. Tạp chí Công
nghệ sinh học 6(3): p.1-7, 2008
Do TT, Nguyen VT, Quyen DT, (2009). Optimization of some culture conditions for Aspergillus niger VTCC-F-
017 and Aspergillus oryzae VTCC-F-187 producing xylanase. Anatycal Viet Nam 2009: p.294-301
Lemos JL, Fontes MC, Pereira NJ, (2001). Xylanase production by Aspergillus awamori in solid- fermentation
and influence of different nitrogen sources. Jbiosci Bioeng 96 (3): p.232-241
Li XL, Ljungdahl LG, (1993). Purification and characterization of a new Xylanase (APX-II) from the fungus
Aureobasidium pullulans Y-2311-1. Appl Environ Microbiol 59: p.3212-3218
Li XL, Ljungdahl LG, (1994). Cloning, sequencing, and regulation of a Xylanase gene from the fungus
Aureobasidium pullulans Y-2311-1. Appl Environ Microbiol 60:p.3160-3166
Miller GL (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Anal Chem 31:
p.426-428
Phương Phú Công, (2008). Tuyển chọn và nghiên cứu ứng dụng một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men
xylan trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu xylanase phục vụ cho chăn nuôi. Luận án Tiến sĩ sinh học
Smith DC, (1991). Xylanase production by Aspergillus awamori. Development of a medium and optimization of
the fermentation parameters for the production of extracellular xylanase and beta-xylosidase while
maintaining low protease production. Biotechnol Bioeng 38(8): p.883-890
Sudan R, Bajaj BK, (2007). Production and biochemical characterization of xylanase from an alkalitolerant novel
species Aspergillus niveus RS2. J Microb Biotech 23: p.491-500

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 19-Tháng 8-2009