PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ
NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM
TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID
GEN 16S-ARN RIBOSOM

Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, Lê
Thanh Hòa, Nguyễn Ngọc Dũng
Viện Công nghệ Sinh học.

Cây lúa nước đã, đang và mãi là cây trồng số một ở Việt
Nam. Chiến lược hướng tới một nền nông nghiệp bền vững
sinh thái ở Việt nam đã được thiết lập. Để góp phần thực
hiện chiến lược này, các vi khuẩn có ích cho cây lúa ở đồng
bằng sông Hồng được quan tâm nghiên cứu trong những
năm qua (Nguyễn Ngọc Dũng và cộng sự, 2000). Một trong
những nhóm vi khuẩn hữu ích cho cây lúa cần được khai
thác là vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh quang bởi chúng
được coi là tác nhân sinh học tiềm năng trong phòng chống
vi nấm gây bệnh cây trồng (O,Sullivan và cộng sự, 1992,
Berg và cộng sự, 2000). Các chủng pseudomonad sinh
huỳnh quang vùng rễ cây lúa đã được phân lập và chọn lọc
theo khả năng đối kháng Fusarium oxysporum, tác nhân
gây bệnh khô vằn cây lúa (Nguyễn Thị Tuyết Nhung và
cộng sự, đang in).

Do có những đặc điểm riêng hình thành trong suốt qúa
trình tiến hoá nên các gen sao mã các axit ARN ribosom
(ARNr) ở vi sinh vật nhân sơ, đặc biệt các gen 16S- và 23
S-ARNr, được sử dụng như một công cụ trong việc phân
loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi
khuẩn ( Woese, 1987). Theo Ludwig và Schleifer ( 2000)

được ủ ở 30
o
C và đọc kết quả sinh trưởng sau 24 và 48 giờ
ủ. Tính mẫn cảm đối với tetraxyclin (30g/ml) được tiến
hành theo phương pháp Krieg và Doebereiner (1984). Theo
đó, tế bào Ps7-1 nuôi qua đêm được ria trên môi trường LB
rắn, sau đó đặt đĩa giấy ( : 5 mm) thấm đậm dung dịch
tetraxyclin lên trên. Chủng E. coli DH5 được sử dụng làm
đối chứng. Quan sát sinh trưởng của vi khuẩn xung quanh
đĩa giấy thấm sau 24 giờ ủ.

b. Phương pháp phân loại theo kiểu gen:

-Thu ADN tổng số:

ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp Masterson
và cộng sự (1985).

-Thu nhận gen 16S-ARNr:

Gen 16S-ARNr được thu nhận bằng phản ứng nhân bản
gen (PCR) với cặp mồi có trình tự như sau. Mồi thuận
chiều Prf: 5,-GAGTTTGATCATGGCTAA-3,., tương ứng
với các vị trí nucleotid 7-26 của gen 16S-ARNr từ E. coli;
mồi nghịch chiều Prr: 5,- AGGAGGTGATCCAGCC-3,,
tương ứng với các vị trí 1540-1524 từ E. coli, do Genset-
Oligos Singapore, cung cấp. Hỗn hợp phản ứng nhân bản
gen có thể tích 25 l với thành phần: 16,7 l nước sạch ion,
2,5 l đệm Taq(10x), 2,5 l dung dịch dNTP (10mM), 1,0
l dịch mồi Prf (10mM), 1,0 l dịch mồi Prr (10mM), 1,0

RUSSELL, 2001). ADN plasmid tái tổ hợp được tách chiết
với bộ hoá chất QIAprep Spin Plasmid Extraction Kit
(QIAGEN Inc.). Độ dài sản phẩm dòng hoá được kiểm tra
trên thạch agarose 0.8%, sau khi cắt ADN của plasmid tái
tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI.

3. Giải trình trình tự chuỗi nucleotit và xử lý số liệu:

Chuỗi ADN chứa gen 16S- ARNr và nột phần plasmid
được giải trình tự trên máy giải trình tự tự động ABI 377
PRISM (Perkin- Elmer). Mồi xuôi M13F
(5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’) và mồi ngược M13R
(5’CAGGAAACAGCTATGAC3’) dùng trong giải trình tự
là các chuỗi cố định của vectơ và nằm gần hai đầu biên của
ADN tái tổ hợp cần giải trình. Trong quá trình giải trình,
một mồi khác ký hiệu là Seq16SF
(5’CAGTGGGGAATATTGGACAAT 3') nằm cách đầu 5’
của đoạn gen 16S ARNr nghiên cứu khoảng 300-320
nucleotit đã được thiết kế bởi máy không có khả năng đọc
một lần hết chiều dài chuỗi. Giải trình được thực hiện nhiều
lần với số lượng nhiều plasmid tái tổ hợp nhằm thu được
kết quả chính xác.

Chuỗi được xứ lý nucleotit bằng chương trình SeqEd1.0.3;
sắp xếp, đối chiếu trình tự tương ứng của đoạn gen bằng hệ
chương trình máy tính AsemblyLIGN 1.9; MacVector 6.5.3
(Oxford Molecular Inc.) và chương trình GENDOC 2.5
(Karl Nicholas, 1997). Giám định các chủng được thực
hiện bằng phương pháp truy cập Ngân hàng Gen thông qua
chương trình BLASTn có tại

hóa API 20NE là tập hợp của 21 phản ứng sinh lý sinh hoá
dùng để xác định vi khuẩn hình que, gram âm, không có
nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt, không thuộc Họ
Enterobacteriaceae. Kết quả phân loại chủng Ps7-1 theo hệ
thống API 20NE cho thấy, đối với nhóm 8 phản ứng cơ
bản, chủng này cho kết quả âm tính với khử nitrat, tạo
indol, tổng hợp urease, thủy phân esculin và tổng hợp -
galactosidase; và cho 3 kết quả dương tính là lên men
glucose, thủy phân gelatin và tổng hợp arginin dihydrolase.
Trong tổng số 12 hợp chất cácbon đã cho, chủng Ps7-1
không có khả năng sử dụng arabinose, maltose,, malat,
citrat và phenol-axetat. Với những kết quả như vậy, chủng
Ps7-1 được xác định bởi mã số 4156534. Đối chiếu Bảng
chỉ số Analytical Profile Index, 5
th
edition, BioMerieux
S.A, 1992, mã số 4156534 không tồn tại. Tuy vậy, căn cứ
vào các chứ số đầu tiên của mã số có trong bản chỉ dẫn,
chủng Ps7-1 có thể được xếp vào vị trí phân loại thuộc
giống Chromobacterium bởi mã số của các chủng có chữ số
ban đầu từ 4150 tới 4156 đều được xếp vào loài Ch.
violaceum. Theo Sneath (1984), một trong những đặc điểm
cơ bản của giống Chromobacterium là kỵ khí không bắt
buộc và mẫn cảm với tetraxyclin (30g/ml. Kết quả xác
định những đặc tính này đối với chủng Ps7-1 cho thấy,
chủng này là hiếu khí bắt buộc và có khả năng kháng
tetraxyclin ở nồng độ đã nêu. Theo Norberto và Palleroni
(1984), đây là những đặc tính cơ bản của vi khuẩn Chi
Pseudomonas. Ngoài ra, như đã nêu, chủng Ps7-1 được
phân lập trên môi trường S1, một môi trường thể hiện tính

thiết lập cây phả hệ với một số chủng Pseudomonas đặc
trưng bằng hệ chương trình máy tính MEGA 2.1 ( Hình 1 ).

Hình 1: Cây phả hệ ( không có rễ ) của các chủng
Pseudomonas được thiết lập theo chương trình MEGA 2.1.
Pficu: P. ficuserectae JCM 2400T, Psyr+gly: P. syringae
pv glycinea MAFF 302260,
Pmeli: P. meliae MAFF 301463T, Psyr+pha: P. syringae
pv. phaseolicola MAFF 302282,
Pchlor: P. chlororaphis DSM 50083T, Pcost: P. costantinii
CFBP 5705,
Pman: P. mandelii CIP 105273, PfluoATCC: P. fluorescens
ATCC 17386, Pfluor: P. fluorescens CHAO. Cây phả hệ cho thấy, chủng Ps7-1 cùng với 2 chủng P.
fluorescent lập nên một nhóm riêng, trong khi đó giữa các
chủng còn lại thuộc các loài Pseudomonas khác đều cho
những khoảng cách nhất định. Điều này nói lên rằng chủng
Ps7-1 có họ hàng gẫn gũi nhất vỡi loài P. fluorescent.

Việc xác định một chủng vi khuẩn dựa trên hệ thống
API 20NE và phân tích trình tự gen 16S-ARNr cho kết quả
phân loại khác nhau cũng đã được đề cập trong báo cáo
khoa học, ví dụ như chủng QC14-3-8 được xác định thuộc
loài P. aeruginosa (91,8%) theo hệ thống API 20NE,
nhưng theo phương pháp phân tích gen 16S-ARNr thì
chủng này thuộc loài P. putida (99%) (Lottmann và cộng sự
, 2000). Như vậy, ở đây sự khác nhau chỉ thể hiện ở mức độ
loài, không xẩy ra ở định loại chi. Nhưng, như đã nêu,

to Verticillum wilt. Can. J. Microbil., 46, p. 1128-1137.
3. Galdzicka, M., Plassmeyer,M.L., Blaine,L.D.,
Pienta,P.A. and Gillevet, P.M.
(Chưa công bố).
4. Gould, W.D., Hagedorn, C., Bardinelli, T.R. and R.M.
Zablotowicz, 1985. New selective media for Enummeration
and recovery of fluorescent Pseudomonads from
Various Habitats. Appl. Env. Microbiol., 49, p. 28-32.
5. Krieg, N.R. and Doebereiner,J., 1984. Genus
Azospirillum. In: Krieg, N.R.,
& Holt, J.G. (eds): Bergey, s Manual of Systematic
Bacteriology. The Williams
and Wilkin Co., Baltimore.
6. Lottmann, J., Heuer, H., Vries, J., Mahn, A., Duering,
K., Wackernagel, W., Smalla, K.,
Berg, G., 2000. Establishment of introduced
antagonistic bacteria in the
rhizosphere of transgewnic potatoes and their effect on
the bacterial community.
EFMS Microbiol., Ecol., 33, 41-49.
7. Ludwig, W. and Schleifer, K.H., 2000. Phylogeny of
Bacteria beyond the 16S-rRNA
Standerd. Vermicon. http:w.w.w.
ermicon.de/english/news/Science/khs99111.htm
8. Masterson, R.V., Prakash, R.K. and Arthely, A.G., 1985.
Conservation of symbiotic
nitrogen fixation gene sequences in Rhizobium
japonicum and Bradyrhizobium
japonicum. J. Bacteriol., 163, 2-25.
9. Moore, E.R.B., Mau,M., Arnscheidt,A., Boettger,E.C.,

SUMMARY

TAXONOMICAL POSITION OF THE ISOLATE PS7-
1 CAPABLE OF ANTAGONISM AGAINST
FUSARIUM OXYSPORUM BASED ON THE
ANALYSIS OF THE 16S-rRNA GENE NUCLEOTIDE
SEQUENCE.

NGUYEN THI TUYET NHUNG et al

To establishing the taxonomical position of the bacterial
strain Ps7-1 which was isolated from the rice rhizosphere
soil in Kim Chung, Dong Anh, Ha Noi on the selective
medium for fluorescent pseudomonad bacteria, being gram
-negative and possessed the great capable of antagonism to
the fungal phytopathogene F. oxysporum , the different
methods have been used. By the API 20NE system – a
phenotypically standardized micromethod combining 8
conventional tests and 12 assimilation tests for
identification of non-fastidious Gram-negative rods not
belong to the Enterobacteraceae, the train Ps7-1 was
positioned with the code number 4156534 which does not
be present in the catalog, nevertheles with a such code
number it also could be thought that this strain may be
belong to the group Chromobacterium. The genotypical
classification method based on the nucleotide sequence of
16s-rRNA gene has been applied to grouping the strain
Ps7-1. The 16S-rRNA gene from Ps7-1 has been obtained
by Polymerase Chain Reaction with primers Prf: 5,-
GAGTTTGATCATGGCTAA-3 and Prr: 5,-