PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ
NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM
TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID
GEN 16S-ARN RIBOSOM

Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh,Lê Thanh
Hoà, Nguyễn Ngọc Dũng
Viện Công nghệ Sinh học.

Cây lúa nước đã, đang và mãi là cây trồng số một ở Việt
Nam. Chiến lược hướng tới một nền nông nghiệp bền vững
sinh thái ở Việt nam đã được thiết lập. Để góp phần thực
hiện chiến lược này, các vi khuẩn có ích cho cây lúa ở đồng
bằng sông Hồng được quan tâm nghiên cứu trong những
năm qua (Nguyễn Ngọc Dũng và cộng sự, 2000). Một trong
những nhóm vi khuẩn hữu ích cho cây lúa cần được khai
thác là vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh quang bởi chúng
được coi là tác nhân sinh học tiềm năng trong phòng chống
vi nấm gây bệnh cây trồng (O,Sullivan và cộng sự, 1992,
Berg và cộng sự, 2000). Các chủng pseudomonad sinh
huỳnh quang vùng rễ cây lúa đã được phân lập và chọn lọc
theo khả năng đối kháng Fusarium oxysporum, tác nhân
gây bệnh khô vằn cây lúa (Nguyễn Thị Tuyết Nhung và
cộng sự, đang in).

Do có những đặc điểm riêng hình thành trong trong suốt
qúa trình tiến hoá nên các gen sao mã các axit ARN
ribosom (ARNr) ở vi sinh vật nhân sơ, đặc biệt các gen
16S- và 23 S-ARNr, được sử dụng như một công cụ trong
việc phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các
chủng vi khuẩn ( Woese, 1987). Theo Ludwig và Schleifer

o
C và đọc kết quả sinh trưởng sau 24 và 48 giờ ủ. Tính
mẫn cảm đối với tetraxyclin (30g/ml) được tiến hành theo
phương pháp Krieg và Doebereiner (1984). Theo đó, tế bào
Ps7-1 nuôi qua đêm được ria trên môi trường LB rắn, sau
đó đặt đĩa giấy ( : 5 mm) thấm đậm dung dịch tetraxyclin
lên trên. Chủng E. coli DH5 được sử dụng làm đối chứng.
Quan sát sinh trưởng của vi khuẩn xung quanh đĩa giấy
thấm sau 24 giờ ủ.

b. Phương pháp phân loại theo kiểu gen:

-Thu ADN tổng số:
ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp Masterson
và cộng sự (1985).

-Thu nhận gen 16S-ARNr:
Gen 16S-ARNr được thu nhận bằng phản ứng nhân bản gen
(PCR) với cặp mồi có trình tự như sau. Mồi thuận chiều
Prf: 5'-GAGTTTGATCATGGCTAA-3', tương ứng với các
vị trí nucleotid 7-26 của gen 16S-ARNr từ E. coli; mồi
nghịch chiều Prr: 5'- AGGAGGTGATCCAGCC-3', tương
ứng với các vị trí 1540-1524 từ E. coli, do Genset-Oligos
Singapore, cung cấp. Hỗn hợp phản ứng nhân bản gen có
thể tích 25 l với thành phần: 16,7 l nước sạch ion, 2,5 l
đệm Taq(10x), 2,5 l dung dịch dNTP (10mM), 1,0 l dịch
mồi Prf (10mM), 1,0 l dịch mồi Prr (10mM), 1,0 l dịch
ADN khuôn và 0,3 l Taq Polymerase. Phản ứng được
thực hiện với chu trình nhiệt như sau: Giai đoạn đầu, ADN
được biến tính ở 95

(QIAGEN Inc.). Độ dài sản phẩm dòng hoá được kiểm tra
trên thạch agarose 0.8%, sau khi cắt ADN của plasmid tái
tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI.

3. Giải trình trình tự chuỗi nucleotid và xử lý số liệu:

Chuỗi ADN được giải trình tự trên máy giải trình tự động
ABI 377 PRISM (Perkin- Elmer) từ sản phẩm dòng hoá là
ADN của plasmid tái tổ hợp đã tiếp nhận đoạn gen 16S
ARNr. Mồi xuôi M13F (5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’)
và mồi ngược M13R (5’CAGGAAACAGCTATGAC3’)
dùng trong giải trình tự là các chuỗi cố định của vectơ và
nằm gần hai đầu biên của ADN tái tổ hợp cần giải trình.

Trong quá trình giải trình, chúng tôi thiết kế thêm một mồi
khác ký hiệu là Seq16SF
(5’CAGTGGGGAATATTGGACAAT 3') nằm cách đầu 5’
của đoạn gen 16S ARNr nghiên cứu là khoảng 300-320
nucleotid. Giải trình được thực hiện nhiều lần với số lượng
nhiều plasmid tái tổ hợp nhằm thu được kết quả chính xác.

Xử lý chuỗi nucleotid bằng chương trình SeqEd1.0.3; sắp
xếp, đối chiếu trình tự tương ứng của đoạn gen bằng hệ
chương trình máy tính AsemblyLIGN 1.9; MacVector 6.5.3
(Oxford Molecular Inc.) và chương trình GENDOC 2.5
(Karl Nicholas, 1997). Giám định các chủng được thực
hiện bằng phương pháp truy cập Ngân hàng Gen thông qua
chương trình BLASTn có tại
().


nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt, không thuộc Họ
Enterobacteracae. Kết qủa phân loại chủng Ps7-1 theo hệ
thống API 20NE cho thấy, đối với nhóm 8 phản ứng cơ
bản, chủng này cho kết qủa âm tính với khử nitrat, tạo
indol, tổng hợp urease, thủy phân esculin và tổng hợp -
galactosidase; và cho 3 kết qủa dương tính là lên men
glucose, thủy phân gelatin và tổng hợp arginin dihydrolase.
Trong tổng số 12 hợp chất cácbon đã cho, chủng Ps7-1
không có khả năng sử dụng arabinose, maltose,, malat,
citrat và phenol-axetat. Với những kết qủa như vậy, chủng
Ps7-1 được xác định bởi mã số 4156534. Đối chiếu Bảng
chỉ số Analytical Profile Index, 5th edition, BioMerieux
S.A, 1992, mã số 4156534 không tồn tại. Tuy vậy, căn cứ
vào các chứ số đầu tiên của mã số có trong bản chỉ dẫn,
chủng Ps7-1 có thể được xếp vào vị trí phân loại thuộc
giống Chromobacterium bởi mã số của các chủng có chữ
số ban đầu từ 4150 tới 4156 đều được xếp vào loài Ch.
violaceum. Theo Sneath (1984), một trong những đặc điểm
cơ bản của giống Chromobacterium là kỵ khí không bắt
buộc và mẫn cảm với tetraxyclin (30g/ml. Kết qủa xác
định những đặc tính này đối với chủng Ps7-1 cho thấy,
chủng này là hiếu khí bắt buộc và có khả năng kháng
tetraxyclin ở nồng độ đã nêu. Theo Norberto và Palleroni
(1984), đây là những đặc tính cơ bản của vi khuẩn Chi
Pseudomonas. Ngoài ra, như đã nêu, chủng Ps7-1 được
phân lập trên môi trường S1, một môi trường thể hiện tính
chọn lọc cao đối với vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh
quang (Gould và cộng sự, 1985). Chính vì vậy, đến đây có
thể tạm thời kết luận, chủng Ps7-1 khó có thể là một chủng
Chromobacterium.

(vị trí 15; 77; 315 và 496), GA (vị trí 25; 57; 331; 335;
460; 505; 509 và 605), AG (vị trí 72; 78 và 320), GC
(vị trí 317), AT (vị trí 332), TGC (vị trí 333), GT
(vị trí 469), AGT (vị trí 507) và AG (vị trí 508).
Với kết qủa như vậy cho phép kết luận rằng chủng Ps7-1
thuộc loài P. fluorescenss.

Hình 1: So sánh trình tự nucleotid của một đoạn gen
ribôxom 16S - ARNr của chủng Ps7-1 với các loài
Pseudomonas đã được biết. Ghi chú: dấu chấm (.) biểu thị
sự giống nhau của trình tự nucleotid của các loài; sự sai
khác về nucleotid được thể hiện bằng chính các chữ cái ký
hiệu của chúng; PluoATCC : P. fluorescens chủng ATCC
17386; Pfluor : P. fluorescens chủng CHAO; Pchlor: P.
chlororaphis chủng DSM50083T; Pcost: P. costantinii
chủng CFBP 5705; Pficu: P. ficuserectae chủng JCM
2400T; Pman: P. mandelii chủng CIP 105273; Pmeli: P.
meliae MAFF 301463T; Psyr+gly: P. syringae pv. glycinea
chủng MAFF 302260; Psyr+pha: P. syringae pv.
phaseolicola MAFF 302282. Việc xác định một chủng vi khuẩn dựa trên hệ thống API
20NE và phân tích trình tự gen 16S-ARNr cho kết qủa
phân loại khác nhau cũng đã được đề cập trong báo cáo
khoa học, ví dụ như chủng QC14-3-8 được xác định thuộc
loài P. aeruginosa (91,8%) theo hệ thống API 20NE, nhưng

Smalla, K., 2000. Successful strategy for the selection of
new strawberry-associated rhizobacteria antagonistic to
Verticillum wilt. Can. J. Microbil., 46, p. 1128-1137.
3. Galdzicka, M., Plassmeyer,M.L., Blaine,L.D.,
Pienta,P.A. and Gillevet, P.M.(Chưa công bố).
4. Gould, W.D., Hagedorn, C., Bardinelli, T.R. and R.M.
Zablotowicz, 1985. New selective media for Enummeration
and recovery of fluorescent Pseudomonads from Various
Habitats. Appl. Env. Microbiol., 49, p. 28-32.
5. Krieg, N.R. and Doebereiner,J., 1984. Genus
Azospirillum. In: Krieg, N.R.,& Holt, J.G. (eds): Bergey, s
Manual of Systematic Bacteriology. The Williams and
Wilkin Co., Baltimore.
6. Lottmann, J., Heuer, H., Vries, J., Mahn, A., Duering,
K., Wackernagel, W., Smalla, K., Berg, G., 2000.
Establishment of introduced antagonistic bacteria in the
rhizosphere of transgewnic potatoes and their effect on the
bacterial community. EFMS Microbiol., Ecol., 33, 41-49.
7. Ludwig, W. and Schleifer, K.H., 2000. Phylogeny of
Bacteria beyond the 16S-rRNA Standerd. Vermicon.
http:w.w.w.
ermicon.de/english/news/Science/khs99111.htm
8. Masterson, R.V., Prakash, R.K. and Arthely, A.G., 1985.
Conservation of symbiotic nitrogen fixation gene sequences
in Rhizobium japonicum and Bradyrhizobium japonicum.
J. Bacteriol., 163, 2-25.
9. Moore, E.R.B., Mau,M., Arnscheidt,A., Boettger,E.C.,
Hutson, R.A., Collins,M.D., Van de Peer,Y., De
Wachter,R. and Timmis,K.N.(1996). Syst. Appl. Microbiol.
19, 478-492.


Nguyen Thi Tuyet Nhung et al
Institute of Biotechnology

To establishing the taxonomical position of the isolate
Ps7-1, the different methods have been used. For Ps7-1,
with the API 20NE system there was the code number
4156534 which does not be present in the catalog,
nevertheles with a such code number it also could be
thought that this strain may be belong to the groupe
Chromobacterium. With the method of the 16S-rRNA gene
analysis the isolate Ps7-1 is a Pseudomonas strain and
possesses the highst homology (100%) with the P.
fluorescens. Additionally, the isolate Ps7-1 is a strictly
aerobic one and resistent to tetracyclin those are the main
characteristics of genus Pseudomonas. With such results it
may be conclused that the Ps7-1 strain belongs to P.
fluorescens and can not be a Chromobacterium.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Trương Nam
Hải