ỨNG DỤNG PCR/RFLP ĐỂ ĐIỀU TRA PHÂN TÍCH
KIỂU GEN GEN PROTEIN SỮA ( KAPPA - CASEIN
b-LACTOGLOBULIN ) Ở BÒ SỮA VIỆT NAM

Trịnh Thị Kim Thoa, Lê Thị Hằng, Phùng Thị Bích
Thuỷ, Nguyễn Anh,
Viện Công nghệ Sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu giấy,
Hà nội

MỞ ĐẦU.

Nhằm thúc đẩy ngành chăn nuôi bò sữa ở nước ta, các nhà
chăn nuôi di truyền quần thể đã và đang tiến hành lai tạo ra
đàn bò sữa thuần chủng, bò lai 1/2, 3/4 và 5/8 máu Hà lan
thích nghi trong điều kiện chăn nuôi trang trại và bán trang
trại ở Việt nam.

Ngày nay bên cạnh phương pháp chọn giống phenotype,
việc nghiên cứu, ứng dụng các chỉ thị gen vào chương trình
giống động thực vật ngày càng phát triển [1, 2, 3, 4, 6, 7, 8,
9, 10]. Sử dụng các chỉ thị phân tử để kiểm tra, đánh giá
chọn lọc di truyền trong lai tạo bò sữa đã được triển khai tại
một số nước như Mỹ, Canada, Đan mạch, Nauy Ở nước
ta hướng nghiên cứu này mới được đề cập trong vài năm
gần đây [12, 13]. Người ta đã sử dụng biến thể BB của gen
Kappa - casein ( K-Cn ), -lactoglobulin (-Lg) là hai trong
số các gen được sử dụng như là một chỉ thị di truyền chọn
giống bò sữa. Thật vậy, các nhà nghiên cứu trước đây đã
chứng minh được vai trò của chúng liên quan tới chất
lượng sữa, chất lượng và năng suất pho mát [1, 2]. K-Cn
còn được coi là tiêu chuẩn chọn lọc kinh tế quan trọng để


- Cặp mồi 2 gồm 25 oligonucletide dùng để nhân -lg.

Theo phương pháp của Sulimova có cải tiến [ 11 ], chúng
tôi đã tiến hành PCR để nhân đoạn gen K-Cn - 228 bp. Chu
trình Thermal cycle : biến tính sơ bộ: 7 phút ở 94
0
C, mẫu
được nhân lên bởi 35 chu trình: biến tính 2 phút ở 94
0
C,
đính mồi 1 phút 30 giây ở 57
0
C, kéo dài 4 phút ở 72
0
C.
Hỗn hợp PCR : 50 l, ( nồng độ MgCl
2
: 3 mM, Taq-
polymerase: 2,5 đơn vị, d NTP: 0,5 mM, nồng độ ADN từ
0,5 - 1,0 g/ l ).

- 15 l sản phẩm PCR được cắt bằng 10 đơn vị của
enzym cắt Hind III hoặc pst I.
Chúng tôi đã tiến hành PCR để nhân đoạn gen -Lg - 262
bp theo phương pháp của Medrano [ 7 ]:

Mẫu được nhân lên bởi 35 chu trình [ biến tính 45 giây ở
94
0


a) Điện di đồ các mẫu sản phẩm ADN 228 bp: Giếng 1 -
maker 50 base - pair ladđer;
Giếng 2,3,4,5,6 - sản phẩm ADN 228 bp nhân lên từ máu
bò giống HàLan.

b) Điện di đồ các mẫu sản phẩm PCR sau khi xử lý với
enzym Hind III và Pst 1: Giếng 1 maker 1 kb; Giếng 2,3,4
sản phẩm ADN 228 bp nhân lên từ ADN máu bò Hà lan
sau khi xử lý với Hind III; Giếng 5,6 7 - sản phẩm ADN
228 bp nhân lên từ máu bò lai Hà lan sau khi xử lý với Pst
I.

Kết quả nhân đoạn gen -Lg và các biến thể của gen -Lg
được trình bày tại hình 2.
Hình 2: Điện di đồ các mẫu sản phẩm ADN 262 bp. đã
được nhân lên sau PCR và các mẫu sản phẩm PCR sau khi
xử lý với các enzym cắt giới hạn Hind III và Pst I trên gel
agarose 2%, 3% ( nhuộm bằng ethidium bromide )

a) Điện di đồ các mẫu sản phẩm ADN 262 bp. được nhân
lên sau PCR: Giếng 1 Maker 50 base - pair ladđer; Giếng
2,3,4 đoạn ADN 262 bp. nhân lên từ ADN máu bò Hàlan;
Giếng 5,6,7,8 - đoạn ADN 262 bp nhân lên từ ADN máu
bò lai 3/4 và 5/8 máu Hà lan

b) Điện di đồ mẫu sản phẩm PCR khi xử lý với enzym Hae

Bò lai hướng sữa ( 1/2, 3/4 và 5/8 máu Hà lan) ở nước ta
được tạo ra từ bò cái lai sind ( bò vàng Việt nam x bò sind)
với bò Hà lan thuần chủng. Vì thế, chúng tôi tiến hành điều
tra kiểu gen của gen K-Cn và -Lg ở bò đực Sind.

Kết quả nghiên cứu cho thấy: tất cả 6 bò Sind được kiểm
tra đều mang biến thể A A của gen K-Cn. Có 4 đực mang
biến thể BB của gen -Lg ( đạt 66,67 %) ( bảng 1). Như
vậy biến thể BB của gen -Lg chiếm tỷ lệ khá cao ở bò đực
Sind so với bò cái và bò đực giống Hà lan.

Đồng thời với việc điều tra , phân tích kiểu gen gen K-Cn
và -Lg ở bò sữa bố mẹ, chúng tôi tiến hành điều tra, phân
tích kiểu gen gen K-Cn và -Lg ở bò lai. Kết quả điều tra
phân tích kiểu gen gen K-Cn và -Lg ở bò lai được trình
bày tại bảng 2.

Qua kiểm tra, phân tích gen protein sữa ở bò lai cho thấy,
91,67 % bò lai mang biến thể AA của gen K-Cn, chỉ có
8,33 % bò lai mang biến thể BB của gen K-Cn. Như vậy
biến thể BB gen K-Cn ở bò lai nước ta cao hơn biến thể BB
gen K-Cn của bò Hà lan của nước ngoài ( 3-4%). Tuy kết
quả phân tích kiểu gen của gen K-Cn ở một số bò bố mẹ
không có con nào mang biến thể BB gen K-Cn, nhưng ở
con lai lại có 7 con ( chiếm 8,33%) mang thể biến thể BB
gen K-Cn. Đây có lẽ do con lai được tạo ra bằng tinh trùng
nhập ngoại chăng? Tỷ lệ biến thể AB của gen -Lg cao
nhất khi so sánh với biến thể AA và BB của gen -Lg. Ở bò
lai biến thể AB gen -Lg chiếm 48,8%. Bảng 2 cho thấy
biến thể BB của gen -Lg đạt 40,5 %. Tỷ lệ này cao hơn so

(bố mẹ) hạt nhân và kiểm tra ở thế hệ lai. Vì rằng từ trước
tới nay, chúng ta chỉ mới kiểm tra chất lượng giống thông
qua phương pháp di truyền quần thể với thờì gian 6 - 7 năm
để theo dõi năng suất cũng như chất lượng sữa của các thế
hệ lai, do đó gặp nhiều khó khăn trở ngại, bởi phạm vi triển
khai trên quy mô lớn cần phải có thời gian và kinh phí
nhiều. Thực tế phát triển ngành chăn nuôi bò sữa ở nước ta
hiện nay đòi hỏi các nhà khoa học phải tạo ra một đàn bò
sữa vừa có năng suất cao lại có chất lượng sữa tốt là điều
kiện đầu tiên cần thiết và quan trọng đối với nhà nông. Chất
lượng sữa của đàn bò hướng sữa của nước ta hiện nay (hàm
lượng lipit, protein ) còn thấp so với tiêu chuẩn sữa công
nghiệp và tiêu chuẩn sữa quốc tế. Vì vậy để nâng cao chất
lượng sữa bò, song song với các biện pháp chọn giống theo
di truyền quần thể, chúng ta cần chú ý kiểm tra, đánh gía
chất lượng giống theo phương pháp kiểu gen để bổ sung
khả năng cho những tính trạng quan tâm, mới có thể thực
hiện được 1 cách nhanh chóng và ở quy mô lớn.

Sử dụng công nghệ gen trong chương trình giống sẽ cho
phép chúng ta chọn lọc các cá thể giống tốt mà khi kiểm
định phenotype ta có thể bỏ sót. Song để thực hiện được
vấn đề này đòi hỏi chúng ta cần phân tích mẫu với số lượng
lớn, đồng thời kiểm tra cả thế hệ con cháu mới có thể thực
hiện được mục tiêu của mình.

VI. KẾT LUẬN.

Từ các kết quả nhận được ở trên, chúng tôi rút ra được một
số kết luận sau:

polymorphism in Danish dairy cattle and the influence of
genetic variants on milk yeld. J. of dairy research, 57, p.53-
62.
2. Bovenhuis H. and Weller J. I; 1994. Mapping and
analysis of dairy cattle quantitave trait loci by maixmum
likelihood methodology using milk protein genes as genetic
markers. Genetics ( in America), 137, p.267-280.
3. Chung. -lactoglobuin locibE.R, Kim. W.T et all, 1998.
DNA genotyping of K-casein and in Korean Holstein AI
bulls. J. Diry sci ( in Korean) 20(2),p. 75-84.
4. Henderson D.A and Marshall, 1996. Kappa-casein
kiểu gen effects in a multiple breed beef cattle population.
J. of animal science, V. 74, supplement.
5. Hemy A. E, 1989. PCR technology principles and
application for DNA amplification. Chapter 17, p.221.
6. Lien S, etal. 1990. Milk protein mapping.
Biotechnology. J. p. 414-419.
7. Medrano J. F, 1990. Application of the PCR procedure
for genetic evalution in cattle. Procceding of the 4th the
world congress on genetics applied to livestock production.
23-27 July, p. 71-74.
8. Moody D. E, et all, 1996. Characterization of DNA
polymorphisms in three populations of hereford. Cattle and
their associations with growth and maternal EPD in line 1.
Heefords. J. Anim. Sci, 74, 1784-1793.
9. Zadworny. D and Kuhnlein, 1990. The identification
of the kappa-casein kiểu gen in Holstein dairy cattle using
PCR. Theo. Appl.genet 1990, 80: 631-634.
10. Pedersen J, 1991. Selection to increase frequency of
K-casein variant B in dairy cattle. J. Anim, Breed. Gee.

carry the AA allele K-Cn ( 100%). Frequency BB gene K-
Cn of those cattle did not founded. While frequency BB
gene K-Cn of cattle from American, Canadian and
Newzeland was 3-4%.

Frequency AA, AB and BB of gene b -Lg were 25,64%,
35,9% and 38,46% for Holland, Sind cattle, respectively.
Like that, frequency AA gene  -Lg of bulls was higher
than this frequency of cows. It was 57,14%. Contrary to the
frequency AB gene  -Lg from bulls was lower than
frequency AB gene  -Lg from cows- two times. The
frequency BB of  -Lg from Holland bulls and cows was
equivalent. It was 28% and 21,43 % respectively. From
those results were shown that, quality of Vietnamese cattle
is bad more than quality of cattle from American, Canadian
and Newzeland.

The Vietnamese cross-breed cattle have created from Sind
cross-breed cows. So we were determined genotype of gene
K-Cn and  -Lg from Sind bulls. Results were observed
that, all six Sind bulls have carrying variant AA gene K-Cn.
Only four Sind were carrying variant BB gene  -Lg (66,67
%). Thus, so variant BB of gene  -Lg from Sind bulls
were higher than that from Holland bulls and cows.

The polymorphism of K-Cn and  -Lg loci also was
determined from 84 cross-breed cows ( 1/2, 3/4 and 5/8 ).
The homozygous AA and homozygous BB of K-Cn were
observed at the frequency of 91,57% and 8,33%
respectively for cross-breed cows. In the  -Lg system three