21
các gen xác định giới tính trên NST Y sẽ giúp ngày càng hiểu rõ hơn về NST này và sẽ
tạo ra được đoạn dò chuyên biệt hoàn toàn để cải thiện độ chính xác của kỹ thuật này.
Qua việc tìm hiểu một số phương pháp xác định giới tính, ta thấy đa số các
phương pháp không mắc khuyết điểm này thì sẽ gặp phải khó khăn khác và ít có
phương pháp nào phù hợp với đòi hỏi của thương mại ngày nay. Do vậy, công cuộc
tìm kiếm phương pháp xác định giới tính phù hợp vẫn còn tiếp tục.
2.3.5 Phân biệt giới tính bằng kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR)
Vào năm 1985, Karl Mullis và ctv đã phát minh ra phương pháp tổng hợp DNA
trong ống nghiệm. Phát minh này nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi và đã ảnh
hưởng mạnh mẽ đến sự chẩn đoán giới tính ở động vật.
2.3.5.1 Cơ sở phản ứng PCR dùng để phân biệt giới tính
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây
chuyền nhờ polymerase) thực chất là một phương pháp tạo dòng trong ống nghiệm.
Nghĩa là nhằm mục đích thu nhận một lượng lớn bản sao của một trình tự xác định. Cơ
sở của phương pháp PCR chính là đặc tính hoạt động của các DNA polymerase. Các
polymerase này chỉ có khả năng tổng hợp một mạch mới từ khuôn kể từ một đoạn mồi
(là một trình tự DNA ngắn) đã bắt cặp sẵn với khuôn. Trong thực nghiệm, đoạn mồi là
những trình tự bổ sung chuyên biệt cho đoạn DNA cần tổng hợp. Phương pháp PCR
gồm 3 bước: (1) biến tính phân tử DNA; (2) bắt cặp đoạn mồi với mạch khuôn; (3)
tổng hợp mạch mới. Ba bước này hợp thành một chu kỳ và chu kỳ này được lặp lại
nhiều lần. Chính vì vậy, đoạn DNA mục tiêu được nhân lên rất nhiều lần và có thể
được quan sát thông qua những kỹ thuật phân tách và điện di DNA (Hồ Huỳnh Thuỳ
Dương , 2002).
Theo Schorder và ctv (1990), việc sử dụng đoạn mồi chuyên biệt NST Y
trong phản ứng PCR giúp khuếch đại đoạn trình tự DNA chuyên biệt đực. Sự hiện diện
hoặc vắng mặt của sản phẩm PCR cho phép xác định giới tính của phôi.
Thông thường, kèm với sự khuếch đại trình tự chuyên biệt NST Y, người ta
nhân bản đồng thời một trình tự trên NST sinh dưỡng (Chen và ctv, 2004) hoặc một
trình tự trên NST X (Alves và ctv, 2003) để làm yếu tố kiểm soát sự hiện diện của vật
liệu và các điều kiện phù hợp cho phản ứng nhân bản.

giới tính này trên các loài hữu nhũ khác như: ngựa, mèo, chó, bò, dê,… và người
nhưng kết quả không được chính xác và không đáng tin cậy như trên heo.
Vào 1999, Kitiyanant và ctv đã phân biệt giới tính từ một tế bào được tách từ
phôi giai đoạn 2 tế bào bằng 2 phương pháp: karyotyping và PCR. Kết quả cho thấy
PCR có tỷ lệ thành công cao hơn so với karyotyping rất nhiều (100% so với 56%) và
23
thời gian tiến hành thì ngắn hơn một nửa (3 giờ so với 8 giờ). Cũng vào năm này,
Chen và ctv đã khẳng định độ nhạy và độ chính xác của phản ứng PCR xác định giới
tính khi dùng 10 pg DNA, 100% thành công trên tế bào phôi của các giống Holstein,
Jussay và Swiss. Những kết quả này đã chứng minh được ưu thế của phương pháp
dùng PCR để phân biệt giới tính trong ứng dụng thương mại.
Bắt kịp với nhịp phát triển thương mại trong chẩn đoán giới tính phôi trước
khi chuyển cấy, hãng Takara Bio (Nhật Bản) đã cho ra đời bộ kit chẩn đoán giới tính
bò mang tên Cycleave PCR
TM
Bovine sexing kit (Takara bio Inc, 2005). Nguyên tắc
hoạt động của bộ kit này là dựa trên sự khuếch đại đoạn gen Amelogenin theo kiểu
real - time PCR. Phương pháp này rất nhạy và nhanh, chỉ tốn 40 phút là hoàn thành
quá trình chẩn đoán.
Để khẳng định khả năng áp dụng một qui trình PCR chẩn đoán giới tính trên
nhiều giống bò khác nhau, năm 2003, Alves và ctv đã tiến hành phân biệt giới tính trên
2 nhóm giống bò Bos indicus và Bos taurus. Kết quả là qui trình này đã thành công
100% khi áp dụng trên cả 2 nhóm giống.
Ở Việt Nam, một số công trình xác định giới tính bằng kỹ thuật PCR đã và
đang được tiến hành. Đại diện là những công trình sau.
Năm 2002, Nguyễn Thị Thu Lan đã xác định giới tính heo nhà (Sus scrofa
domestica) bằng cách khuếch đại đoạn DNA dài 166 bp đặc hiệu cho giới tính đực và
đoạn 447 bp đặc hiệu cho cả hai giới tính. DNA mẫu được ly trích từ gan, bạch cầu,
trứng, tinh dịch. Kết quả cho thấy qui trình đã phân biệt được một số mẫu nhưng có
một vài mẫu heo cái lại có kết quả giống như heo đực.

3.3.2 Đoạn mồi
Theo Alves và ctv (2003), trên cánh dài của NST Y ở bò có trình tự chuyên biệt
cho giống đực dài 3216 bp. Trình tự này chứa đoạn lặp lại với sự tương đồng rộng rãi
giữa các giống bò. Từ trình tự lặp lại đó, thiết kế ra đoạn mồi RIV và đoạn mồi UIV
nhằm khuếch đại đoạn DNA dài 655 bp qua PCR.
Ngoài ra, để kiểm chứng kết quả chính xác hay không, dựa vào trình tự chuyên
biệt cho gen thụ thể androgen liên kết NST X. Từ trình tự chuyên biệt này, người ta
thiết kế hai đoạn mồi BTANRP1 (BTA1) và BTANRP2 (BTA2) nhằm khuếch đại
25
đoạn DNA dài 370 bp. Band 370 bp phải hiện diện trên gel sau khi điện di như là sản
phẩm đặc trưng chung cho cả bò đực lẫn bò cái.
Hai cặp mồi này được cung cấp bởi hãng IDT (Intergrated DNA Technologies).
Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mồi (Alves và ctv, 2003)
Đoạn mồi

Trình tự DNA mục tiêu nằm trên
RIV 5’ GTT TTA TTA TCC CAG CAA G 3’ NST Y
UIV 5’ TAT TCC TTT GGG GAG CA 3’ NST Y
BTA1 5’ CCA ACT TTC CCT TCT TTC CC 3’ NST X
BTA2 5’ ATG GCC CAA AAG AAC ATT CA 3’ NST X

3.4 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu
- Mẫu cơ: cắt một lượng nhỏ (5g) cơ vân bò vừa được giết mổ; chứa mẫu trong
túi ni lông 5*10 cm; trữ mẫu trong thùng đá, mang về phòng thí nghiệm; trữ ở -70
o
C.
- Mẫu lông: lông đuôi bò được thu nhặt có cả phần gốc lẫn phần ngọn; rửa sạch
dưới vòi nước máy; cắt thành 2 phần: phần gốc và phần ngọn lông; mỗi phần được trữ
trong túi ni lông 10*20 cm ở -70

Thêm 20 µl sodium acetate 2 M, trộn đều; tiếp tục cho vào 500 µl ethanol tuyệt đối
lạnh, trộn đều; ủ ở -20
o
C trong 15 phút. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10
o
C,
bỏ phần nổi, lấy cặn. Rửa cặn bằng 1 ml ethanol 70 %; ly tâm 12000 vòng / phút trong
2 phút ở 10
o
C, lấy cặn. Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55
o
C. Hoà tan cặn bằng 200 µl TE
1X, ủ 55
o
C qua đêm; vortex cho tan cặn.
Sản phẩm DNA sau khi ly trích được trữ ở -20
o
C hoặc sử dụng ngay. DNA
được kiểm tra độ tinh sạch bằng cách đo mật độ quang (OD: optical density) ở bước
sóng 260 nm và 280 nm bằng quang phổ kế (model HP 8453). Hàm lượng DNA được
ước lượng theo công thức DNA (ng / µl) = 62,9*OD
260nm
– 36*OD
280nm
. Mẫu được pha
loãng 100 lần theo tỷ lệ 10 µl DNA gốc: 990 µl H
2
O cất khi đo OD. Các mẫu DNA ly
trích từ cơ có tỷ số OD
260 nm

o
C
II
Vết cặn bị mờ đi, không quan sát rõ
vị trí cặn trên thành eppendorf
Hơn 20 phút ở 55
o
C
(*)
Thời gian chỉ có tính chất tham khảo, căn cứ chính yếu là biểu hiện cặn.
3.4.2.2 Ly trích DNA từ lông
* Phương pháp ly trích
Trước khi ly trích, mẫu lông (ngọn lông và gốc lông) được xử lý. Cân 0,15 g
lông cho vào cối sành vô trùng. Đổ N
2
lỏng vào cối; dùng chày sành vô trùng nghiền
lông thành dạng bột. Chuyển nhanh chóng bột lông từ cối vào eppendorf 1,5 ml. Đặt
eppendorf chứa bột lông trong N
2
lỏng hoặc trữ ở tủ -70
o
C ngay sau đó.
DNA từ lông sẽ được ly trích theo qui trình của Sauer và ctv (2000). Mỗi
eppendorf chứa bột lông được cho thêm 20 µl dung dịch đệm. Thêm 1 µl proteinase K
(20 mg / ml) vào hỗn hợp trên rồi ủ hỗn hợp ở 55
o
C trong 30 phút. Bất hoạt proteinase
K bằng cách ủ hỗn hợp ở 100
o
C trong 5 phút.

O cất vừa đủ 30 µl

* Thí nghiệm so sánh hai chu trình nhiệt
So sánh hai chu trình nhiệt để đánh giá hiệu quả tạo sản phẩm PCR chuyên
biệt. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Hai chu trình
nhiệt khác nhau chủ yếu ở thời gian của giai đoạn 2.
Bảng 3.4 Sự khác nhau chủ yếu giữa hai chu trình nhiệt
Giai đoạn Diễn giải Chu trình I
(Alves và ctv, 2003)
Chu trình II
(điều chỉnh)
1 Biến tính 94
o
C trong 5 phút 94
o
C trong 5 phút
2 Chạy 35 chu kỳ
94
o
C trong 45 giây
55
o
C trong 45 giây
72
o
C trong 45 giây
94
o
C trong 1 phút
55

Bio-rad iTaq
TM
DNA Polymerase Tris – HCl 200 mM; KCl 500 mM
ABgene Taq DNA Polymerase
Tris – HCl 750 mM; (NH
4
)
2
SO
4
200mM; Tween®20 0,1%

Đây là thí nghiệm một yếu tố được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với đối tượng
được dùng là DNA cơ của giống ta Vàng. Chỉ tiêu được theo dõi là hiệu quả PCR
trong phân biệt giới tính đực cái.
3.4.3.2 Áp dụng qui trình PCR để xác định giới tính bò
Sau khi có được qui trình PCR phù hợp (gồm chu trình nhiệt và thành phần hoá
chất), chúng tôi tiến hành xác định giới tính ba giống bò khác nhau để xác định hiệu
quả của qui trình đồng thời kiểm tra một số yếu tố ảnh hưởng có liên quan. Chỉ tiêu
được theo dõi trong các thí nghiệm này là hiệu quả PCR xác định giới tính.
* Thí nghiệm áp dụng qui trình PCR trên DNA từ cơ của ba giống bò
Kiểm tra hiệu quả xác định giới tính của qui trình này với DNA cơ của ba giống
ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan. Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên
một yếu tố.
* Thí nghiệm áp dụng qui trình PCR với DNA từ lông
Dựa vào qui trình PCR trên nguồn DNA từ cơ, tiến hành xác định giới tính trên
nguồn DNA từ lông. Kết quả này được so sánh với kết quả PCR khi sử dụng nguồn
DNA từ cơ. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố.
3.4.4 Điện di và quan sát sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR từ các thí nghiệm được điện di trên gel agarose 1,5% và quan