11
lập các qui trình xác định giới tính phôi sẽ gặp khó khăn ở nguồn mẫu. Thế nhưng, nếu
không thiết lập qui trình xác định giới tính, đến khi đã tạo được phôi thì sẽ không thể
nào phân biệt được giới tính. Lúc đó, phải mất nhiều thời gian để tìm ra qui trình.
Chính vì thế, đề tài này sẽ sử dụng các nguồn mẫu như cơ, lông bò để thiết lập qui
trình chẩn đoán giới tính. Khi tạo được phôi bò, lúc đó sẽ dùng qui trình này để xác
định giới tính phôi tạo ra. Đó chính là ý nghĩa cấp thiết của đề tài.
1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU
1.2.1 Mục tiêu
Tìm ra qui trình PCR phù hợp để xác định giới tính của các giống bò ta Vàng,
lai Sind và bò sữa Hà Lan dựa trên sự khuếch đại đoạn DNA chuyên biệt giới tính đực.
1.2.2 Yêu cầu
- Ly trích DNA từ mẫu cơ và lông của 3 giống bò (ta Vàng, lai Sind và bò sữa
Hà Lan).
- Xác định chu trình nhiệt cho qui trình PCR thành công.
- Thử nghiệm loại Taq polymerase dùng trong qui trình PCR.
- Ứng dụng qui trình PCR tìm được để xác định giới tính ba giống bò ta Vàng,
lai Sind, và sữa Hà Lan.
12
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 KHÁI QUÁT VỀ NGUỒN MẪU CHIẾT XUẤT DNA
2.1.1 Đặc điểm về ngoại hình các giống bò
Hiện tại, ở nước ta có rất nhiều giống bò được nuôi. Tuy nhiên, số lượng của
mỗi giống thì rất khác nhau (Nguyễn Trọng Tiến và ctv, 2001). Chủ yếu là những
giống sau:
- Bò ta Vàng: có nguồn gốc trong nước; lông có màu vàng, vàng nhạt hoặc vàng
đậm; nhỏ vóc, năng suất thấp, trọng lượng khoảng 160 - 220 kg.
- Bò lai Sind: tạo ra từ việc lai giữa bò gốc Ấn Độ nhập vào Việt Nam lâu đời
với bò trong nước. Bò có lông màu nâu cánh dán đến đậm, u vai cao, yếm rộng, trọng
lượng khoảng 200 - 400 kg. Bò cái thường được dùng làm nền để phối với các bò đực

Thường có 2 dạng keratin là α-keratin và β-keratin. α-keratin có cấu trúc vòng với
nhiều liên kết cystine. Trong khi đó β-keratin có cấu trúc phiến xếp nếp. Nét đặc biệt
của keratin là hàm lượng cystine rất cao nên giữa các mạch polypeptide có nhiều liên
kết ngang disulfide. Vì vậy keratin có tính bền vững cao và có cấu trúc cấp hai rất khác
nhau. Chính vì lý do đó, chúng khó bị phân cắt bởi các enzyme proteinase không
chuyên biệt.
Ngoài keratin, melanin cũng là một loại protein khó bị loại khỏi DNA cần
tách chiết. Melanin có 3 loại chính là eumelanin (sắc tố nâu đen), phaomelanin (sắc tố
nâu đỏ) và allomelanin (sắc tố đen) (AIP congress, 2002). Màu sắc của lông tùy thuộc
vào loại melanin có trong lớp vỏ của lông. Đôi khi lớp vỏ bị mất hết melanin làm cho
lông có màu trắng. Sự hiểu biết về melanin cho đến nay không nhiều lắm. Người ta
thường đề cập đến melanin ở dạng polymer sinh học tự nhiên. Nhiều đặc tính hoá học
của melanin chưa được biết rõ nên rất khó cho việc tìm cách tách melanin ra khỏi dung
dịch chứa DNA mẫu.
Theo như trên, lông với cấu trúc đặc trưng của nó là chứa rất nhiều keratin
và melanin nên sẽ tạo nhiều khó khăn trong việc ly trích và tinh sạch DNA.
2.2 CƠ SỞ XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH
2.2.1 Lịch sử khám phá cơ chế xác định giới tính tự nhiên ở động vật
Từ xưa, giới tính được quan niệm là do sức nóng của tinh dịch và cái lạnh của
tử cung xác định. Dần dần, quan điểm này được bổ sung thêm các yếu tố ảnh hưởng từ
môi trường như dinh dưỡng, tuổi cha mẹ, thời gian giao phối,… Sau này, công trình
của Mendel (1900) và sự khám phá ra NST giới tính (Mc Clung, 1902) đã xác nhận
14
vai trò của NST giới tính trong xác định giới tính. Tuy nhiên, ở một số loài, có ảnh
hưởng của môi trường trong việc xác định giới tính (Phan Kim Ngọc và Hồ Huỳnh
Thùy Dương, 2000). Năm 1905, Wilson cho rằng cặp NST giới tính tạo nên sự khác
biệt giữa cá thể đực và cái (Phạm Thành Hổ, 2000).
Tiếp theo đó, nhiều công trình khoa học đã được tiến hành để tìm ra cơ chế xác
định giới tính (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Lan, 2002). Năm 1916, Bridges chứng
minh ruồi giấm (Drosophila) có giới tính xác định dựa trên số lượng NST X dù NST Y

- Gen zfy (zinc finger, Y)
Năm 1987, Page và ctv đã khám phá ra gen zfy trên người. Bằng phân tích sự
chuyển vị NST ở nam XX và nữ XY, các nhà khoa học này đã tìm thấy một đoạn xác
định tinh hoàn trên vùng giả NST của NST Y (Yp
11.32
). Trong vùng này có một gen
với tính bảo toàn cao gọi là zinc finger Y hay zfy mã hoá cho một protein gắn kết
DNA. Gen này giúp ngăn ngừa sự thiếu hụt tinh trùng trong quá trình sinh tinh. Tương
ứng với zfy, trên NST X cũng có vùng zfx (Xp
22.12
) có thể liên kết chéo với zfy trên
NST Y. Lúc này, người ta nghĩ nó là TDF (trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998).
Tuy nhiên, những nghiên cứu tiếp sau đó cho thấy zfy không phải là TDF.
Người ta phát hiện protein ZFY có biểu hiện ở tế bào giao tử (đây là những tế bào
không cần biệt hoá tinh hoàn) và những trình tự bắt nguồn từ NST Y thiếu zfy được
tìm thấy ở những người đàn ông XX (trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998).
Koopman và ctv (1991) đã khẳng định zfx / zfy không là yếu tố biệt hoá và xác định
giới tính chủ yếu ở động vật hữu nhũ mà chúng chỉ là một trong số các nhóm gen tham
gia tích cực vào quá trình này. Ngày nay, người ta thường sử dụng zfy như là một chỉ
thị cho NST Y trong việc sàng lọc giới tính (trích dẫn bởi Huỳnh Thị Lệ Duyên,
2003).
- Gen sry ( sex determining region, Y)
Năm 1959, các nhà khoa học đã khám phá NST Y có mang sry ở cả người và
chuột. Năm 1966, người ta đã xác định vị trí của sry nằm trên vai ngắn của NST Y.
Cuối thập niên 80, người ta đã xác định được sry nằm trên vùng 1 của vai ngắn NST Y
(Yp
11.3
). Năm 1990, Sinclair và ctv đã phân lập gen sry từ khu vực trên (trích dẫn bởi
Josso và ctv, 2003).
Gen sry đóng vai trò chủ đạo cho việc xác định giới tính ở động vật hữu nhũ

)

17
(Mc Elreavey và ctv, 1992; Capel và ctv, 1993; Ma và ctv, 1993; Laval và ctv, 1995;
trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998).
Ngoài những chứng cứ trên, người ta còn xét thấy rất nhiều đặc điểm về mô
học, sinh hoá và sinh học phân tử chứng minh sry là một TDF chủ yếu (Haqq và
Donahoe, 1998; Delbridge và Marshall Graves, 1999; Josso và ctv, 2003). Ngoài ra,
trên NST Y còn có chứa một số gen như amh (anti-mullerian hormone), wt1 (Wilm’s
Tumor supressor gene), azf (Azoospermia factor),…là những gen có vai trò hỗ trợ cho
quá trình biệt hoá giới tính đực của cá thể. Ngày nay, các nhà khoa học đang quan tâm
nghiên cứu các gen đó để làm rõ hơn cơ chế xác định giới tính.
2.2.2.2 Các gen trên NST X
- Nhóm gen sox (SRY - liked HMG box)
Đây là nhóm gen hiện diện trên NST X. Chúng có hơn 20 thành viên, ký hiệu
là sox1,…, sox20. Trong đó gen sox3 và sox9 có tương tác mật thiết với gen sry trong
cơ chế xác định giới tính ở động vật hữu nhũ.
Ở người, sự đột biến sox9 dẫn đến chứng rối loạn tạo cơ quan sinh dục sơ
khai. Theo đó, protein SOX9 được biểu hiện ở thời điểm mà mào niệu sinh dục đang
phát triển để phối hợp cùng với protein SRY trong việc xác định giới tính. Những tế
bào Sertoli biểu hiện protein SRY thì biểu hiện mạnh protein SOX9 (Campel và ctv,
1995; Tommerup và ctv, 1993; trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998).
Ở người nữ, sox3 ức chế sox9. Do đó, sự biệt hoá giới tính đực không xảy ra.
Khả năng này có được do bởi các gen sox cũng có bản chất là HMG box nên có thể
gắn kết DNA. Ở người nam, gen sox3 lại bị ức chế bởi protein SRY nên gen sox9 hoạt
động bình thường và giúp biệt hoá giới tính đực. Chính vì vậy, sry được xem như là
một tác nhân xác định giới tính gián tiếp. Tuy nhiên, bên cạnh đó cũng có giả thuyết
cho rằng sry xác định giới tính trực tiếp. Do vậy, việc này vẫn còn nằm trong sự bàn
cãi (Foster và Graves, 1994; trích dẫn bởi Delbridge và Marshall Graves, 1999).
- Gen dax - 1 (Dosage - sensitive sex reversal - adrenal hypoplasia congeneital

Ở phương pháp của Williams và ctv, phôi dâu (morula) đến phôi nang
(blastocyst) được kiểm tra hoạt tính của enzyme liên kết NST X (glucose 6 phosphate
dehydrogenase - G6PD) một cách trực tiếp. Còn với phương pháp của Monk và ctv,
các tế bào đơn của phôi được phân tách từ phôi 8 tế bào và được kiểm tra hoạt tính
enzyme hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) liên kết NST X. Cả hai
phương pháp đều kiểm tra hoạt động enzyme liên kết NST sinh dưỡng như mẫu đối
chứng để hạn chế sự thay đổi do biến dưỡng phôi. Kết quả được đọc dựa theo màu
đậm nhạt (đậm là con đực, nhạt là con cái).
Phương pháp này có một số hạn chế. Phương pháp của Williams và ctv có tính
độc đối với phôi vì nhuộm màu trực tiếp lên phôi. Phương pháp của Monk và ctv cải
19
thiện được khuyết điểm trên nhưng lại dùng hạn chế đối với phôi dâu nén hoặc phôi
nang (không tách được tế bào phôi đơn). Hạn chế khác là giai đoạn bất hoạt một NST
X để tạo sự cân bằng trong biểu hiện gen chưa được biết chính xác nên có thể dẫn đến
chẩn đoán sai lầm. Cuối cùng, đôi khi mRNA được tạo ra và tích trữ ở đó mà chưa
biểu hiện protein. Đến khi mRNA biểu hiện thành protein thì mới được đánh giá. Do
vậy, hoạt tính enzyme lúc này là sự tích trữ hoạt động của bộ gen từ trước mà không
phải là hoạt động của chính nó lúc đó. Vì vậy, kết quả có thể sai lệch.
Tuy nhiên, phương pháp này giúp xác định một trong những chỉ tiêu đánh giá sự
sống sót của phôi khi nghiên cứu ở các phương pháp khác.
2.3.2 Phản ứng miễn dịch đối với kháng nguyên chuyên biệt giới tính
Năm 1971, Golberg và ctv đã báo cáo một phương pháp huyết thanh học đối với
kháng nguyên H - Y (histocompatibility Y antigen – kháng nguyên Y tương thích mô).
Kháng thể của kháng nguyên này được phân lập từ huyết thanh của những con cái
được ghép mảnh da con đực và các con này có thể loại thải mảnh da đó.
Phương pháp dựa trên kháng nguyên H – Y được tiến hành qua 2 cách: phương
pháp gây độc tế bào và phương pháp miễn dịch huỳnh quang. Ở phương pháp gây độc
tế bào, nếu thấy những tế bào của phôi bị dung giải khi cho vào kháng huyết thanh H -
Y và bổ thể (chỉ ở một mức độ nào đó) thì đó là phôi đực. Phương pháp này dễ gây hư
hại phôi đực. Với phương pháp miễn dịch huỳnh quang, phôi sẽ phản ứng với kháng

thường được sử dụng để khẳng định kết quả của những kỹ thuật phân biệt giới tính
khác.
2.3.4 Sử dụng đoạn dò DNA chuyên biệt NST Y để phân biệt giới tính phôi
Nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật này là việc lai DNA tổng số lấy từ những tế bào
sinh thiết phôi cần xác định giới tính với trình tự DNA chuyên biệt cho NST Y đã
đánh dấu. Kết quả lai dương tính xác định sự hiện diện của NST Y. Vì thế, phôi là
phôi đực.
Phương pháp này nhanh về thời gian và có thể tiến hành với một số ít tế bào cho
nên không tồn tại các khó khăn như phương pháp di truyền tế bào.
Đoạn dò có thể được sử dụng từ các loại bán trên thị trường hoặc chuẩn bị theo
các bước sau: phân lập NST Y, phân lập trình tự chuyên biệt Y, xác định số bản sao
trình tự và định vị trình tự đoạn dò trên NST Y.
Khó khăn cần phải cải tiến của phương pháp này là các đoạn dò chuyên biệt Y
thường là một phần chứ không toàn phần. Nghĩa là có thể lai với một số NST khác.
Chính vì vậy, làm giảm độ chính xác của phương pháp này. Những sự khám phá về