Li Cm n

 hoàn thành khóa lun tt nghip này, bên cnh s c gng ca bn thân, em
đã nhn đc s hng dn vƠ giúp đ nhit tình ca thy cô, gia đình, bn bè.
Li đu tiên, con xin cm n ba m và các anh ch đã luôn  bên cnh ng h
tinh thn, tip sc cho con trong nhng lúc khó khn, luôn to mi điu kin tt
nht đ con an tâm thc tp.
Em xin chân thành cm n thy cô trong Khoa Công ngh Sinh hc, trng i
hc M Thành ph H Chí Minh đã truyn đt nhng kin thc nn tng vô cùng
quý giá, to tin đ đ em tip tc hc tp, nghiên cu. Em xin gi li cm n chơn
thành nht đn thy Nguyn Thanh Thun, thy Nguyn Vn Minh, cô Dng Nht
Linh, cm n thy cô luôn bên cnh đnh hng truyn đt kinh nghim, đng viên
em hoƠn thƠnh đ tài.
Em xin cm n thy an Duy Pháp, ch Võ Ngc Yn Nhi, ch Nguyn Th M
Linh, anh Hà Ch Linh và các anh, ch, các bn, các em  phòng vi sinh đã ng h,
giúp đ em trong sut thi gian em thc hin đ tài.
Cui cùng em xin chân thành cm n nhng ngi thơn đã luôn bên cnh ng h
em v mi mt và là ngun đng viên tinh thn rt ln đ em có th yên tâm thc
hin đ tài.
Em xin chân thành cm n.

Sinh viên thc hin
Lê Th Ho
Tháng 5/2014

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO

DANH MC CH VIT TT


Bng 3.11 Kt qu đnh danh sinh hóa ca vi khun thuc Bacillus 54
Bng 3.12 Kt qu chiu dài r, thân lúa, trng lng ti, trng lng khô 58
Bng 1 Giá tr OD ca đ th đng chun phospho 78
Bng 2 Kt qu OD
600nm
xác đnh phospho trong dch nuôi cy 78
Bng 3 Giá tr OD ca đ th đng chun IAA 79
Bng 4 Kt qu OD
530nm
xác đnh IAA trong dch nuôi cy 80
Bng 5 Kt qu OD
530nm
xác đnh IAA trong dch nuôi cy 87
Bng 6 Kt qu đo chiu dài r ca các nghim thc 88
Bng 7 Kt qu đo chiu dài thân ca các nghim thc 90
Bng 8 Kt qu cân trng lng ti ca các nghim thc 92
Bng 9 Kt qu cân trng lng khô ca các nghim thc 94

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO

DANH MCăSă
S đ 2.1 B trí thí nghim 19
S đ 2.2 Quy trình đnh lng phospho 22
S đ 2.3 Quy trình đnh lng IAA 24

DANH MC BIUă
Biu đ 3.1  th biu din nng đ phospho tan dch nuôi cy các chng 42
Biu đ 3.2  th biu din nng đ IAA trong dch nuôi cy các chng 45

3
-H
2
SO
4
và IAA sinh ra bi vi khun 45
Hình 3.8 Th nghim kép và kho sát phn trm c ch nm Rhizoctonia sp. ca
chng D5 47
Hình 3.9 Sn phm phân Dasvila và phân lp chng vi khun t phân. 49
Hình 3.10 Hình nh vi khun DV2 và DV1 phát trin trên môi trng vô đm
Ashby 49
Hình 3.11 Hình nh kh nng sinh IAA ca chng DV2 lp li 3 ln 51
Hình 3.12 Kt qu th kh nng tng thích gia các chng vi khun đc la chn
55
Hình 3.13 Ht lúa ny mm trên đa agar 56
Hình 3.14 Ht lúa ny mm đc ngâm trong dch khun tng ng vi tng
nghim thc 56
Hình 3.15 Giai đon lúa phát trin đc 3 ngày, 7 ngày, 19 ngày sau khi gieo 57
Hình 3.16 Chiu dài r gia các nghim thc 61
Hình 3.17 Chiu cao thân gia các nghim thc 61
Hình 1 Kh nng lên men đng glucose ca vi khun 85
Hình 2 Phn ng VP Hình 3 Phn ng citrat 85
Hình 4 Kh nng phơn gii tinh bt Hình 5 Kh nng di đng 85
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO

Hình 6 Th nghim catalase Hình 7 Th nghim oxidase 86
Hình 8 Phn ng nitrat Hình 9 Phn ng Indol 86


2.3.3 Môi trng 17
2.3.4 Thuc th 18
2.4 PHNGăPHÁPăTHC HIN 19
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO

2.4.1 B trí thí nghim 19
2.4.2 Phng pháp phơn lp 20
2.4.3 nh tính kh nng sinh NH
3
ca vi khun 20
2.4.4 Xác đnh kh nng hòa tan lơn 21
2.4.5 Xác đnh kh nng sinh IAA 23
2.4.6 Th kh nng đi kháng nm bnh và kho sát phn trm c ch 25
2.4.7 nh danh chng đc la chn 26
2.4.8 Thí nghim th kh nng tng thích gia các chng đc la chn . 31
2.4.9 Thí nghim trng lúa 32
PHN 3: KT QU NGHIÊN CU VÀ THO LUN 34
3.1 KT QU QUANăSÁTăI TH 35
3.2 KT QU QUAN SÁT VI TH 37
3.3 KH NNGăC NHăNITăPHỂNăT 39
3.4 KH NNGăHọAăTANăLỂN 40
3.4.1 nh tính kh nng hòa tan lơn 40
3.4.2 nh lng kh nng phơn gii lân ca các chng 40
3.5 KH NNGăSINHăIAA 43
3.6 KT QU KIM TRA KH NNGăI KHÁNG NM 46
3.7 KT QU PHÂN LP,ăXÁCăNH HOT TÍNH KÍCH THÍCH
TNGăTR
NG THC VT CA VI KHUN TRONG PHÂN VI SINH

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 1

T VNă
Lúa (Oryza sativa L.), thuc h Hòa Bn lƠ cơy ng cc quan trng nht trong
s phát trin th gii vƠ lƠ lng thc chính ca hn na dân s th gii
(FAOSTAT: http://faostat3.fao.org). Ngày nay, Thái Lan và Vit Nam lƠ hai nc
xut go hƠng đu trong th trng lúa go th gii. Theo FAOSTAT, tng sn
lng lúa go nm 2012 ca Vit Nam là 43.661.569,64 tn (FAOSTAT:
http://faostat3.fao.org).
Có nhiu phng pháp đ tng nng sut cng nh kim soát nm gây bnh,
trong đó có bin pháp s dng hóa cht nông nghip. Phân bón và thuc hóa hc
ngƠy cƠng đc nông dơn a chung và s dng đn mc d tha. iu này chng
nhng làm tiêu tn tin bc mà còn gây tác hi đn đt trng, ngun nc, làm
cho môi trng b ô nhim vƠ đc bit, nh hng trc tip đn cuc sng con
ngi cng nh nhng sinh vt sng trong môi trng. S dng phơn bón vi sinh đ
thay th cho phân bón hóa hc là vn đ đang quan tâm và chú ý vì phân bón vi sinh
không nhng giúp nơng cao nng sut cây trng mà còn thân thin vi môi trng
(Nguyn Th Hunh Nh và cs., 2013).
Mt s nghiên cu cho thy rng, vi khun ni sinh phân lp t đt trng hoc r
cây lúa có kh nng thúc đy tng trng bng kh nng c đnh nit t do, hòa tan
lân, sinh hormon tng trng nh acit indol acetic (IAA)… vƠ c ch các bnh trên
cây trng (Cao Ngc ip và cs., 2009; Verma và cs., 2011; Wang và cs., 2009).
Kích thích tng trng thc vt do vi sinh vt có th thông qua c ch trc tip và
gián tip. Kích thích trc tip là cung cp cht dinh dng thông qua các c ch nh
c đnh nit phơn t, hòa tan lân và các cht dinh dng khác, đng thi sn sinh
các hormon IAA, axit gibberellic, cytokinin. Kích thích gián tip mà các vi sinh vt
có li c ch các vi sinh vt gây bnh có hi cho s tng trng và phát trin ca
thc vt (Raddadi và cs., 2008), đng thi tng kh nng đi kháng nm bnh cho
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 3
PHNă1:
TNG QUAN TÀI LIU
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 4

1.1 VI KHUN NI SINH


SVTH: LÊ TH HO 5

vic phơn gii lơn vƠ c đnh đm. NgƠy cƠng có nhiu quan tơm trong vic phát
trin các ng dng tim nng công ngh sinh hc ca vi khun ni sinh đ phát trin
các ging cơy trng có kh nng kh đc đng thi có kh nng sn xut sinh khi
vƠ nhiên liu sinh hc (Ryan và cs., 2007).
1.1.2 Tình hình nghiên cu trong nc
 nc ta, vic nghiên cu các vi khun ni sinh có kh nng c đnh đm, hòa
tan lân, tng hp kích thích t IAA  các cây nông nghip đã đc tin hành khá
nhiu trong nhng nm gn đơy. Ti vin nghiên cu và phát trin sinh hc ậi
hc Cn Th, Nguyn Th Hunh Nh và cs. (2013) phân lp các dòng vi khun ni
sinh có kh nng tng hp IAA và c đnh đm trên cy chui; Nghiên cu ca
Lng Th Hng Hip và cs. (2011) phân lp và nhn din vi khun ni sinh trong
cây Cúc Xuyên Chi. Nguyn Hu Hip và cs. (2008) đã phân lp các dòng vi khun
ni sinh đ sn xut phân bón  quy mô phòng thí nghim cho cây mía ti tnh Sóc
Trng.
Phm Th Khánh Vân và cs. phát hin vi khun Azospirillum lipoferum ni sinh
trong cơy lúa mùa đc sn (Oryza sativa L.) trng  vùng đng bng sông Cu
Long. Nghiên cu ca Nguyn Th Ngc Bích, Cao Ngc ip (2009) nhn din vi
khun nt r ni sinh trong cây lúa bng k thut PCR- ARDRA IGS, kt qu cho
thy rng các dòng vi khun nt r, không phân bit là lên nhanh hay lên chm, đu
có th ni sinh  cây không phi thuc h đu nh cơy lúa. Khi vi khun nt r ni
sinh  cây lúa cao sn cho thy tính tích cc nh gia tng nng sut lúa, rm lúa vƠ
đc bit lƠ gia tng hƠm lng nit trong lá lúa t s ng dng k thut 15N đng
v thông qua s tích ly nit t s c đnh nit sinh hc. Vi khun nt r còn giúp
cây lúa hp thu nhiu lân, kali và st so vi cây không b sung vi khun nt r.
ng thi vi nhng thí nghim chng minh các dòng vi khun nt r này tng hp
và phóng thích các cht sinh trng giúp cho cây m cng cáp đn khi cây lúa
trng thành vi nhng hp cht IAA và c đnh đm sinh hc.

đi chng.
1.2 S C NHăNITăPHỂNăT CA VI KHUN
1.2.1 Quá trình c đnh nit phân t
Mt trong nhng quá trình vi sinh vt hc có Ủ ngha ln đi vi nông nghip là
quá trình c đnh nit phơn t. Trong khong không khí trên mi hecta đt có ti
80.000 tn nit nhng ngi, gia súc và cây trng đu không có kh nng s dng
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 7

đc nit  dng phân t này. Cây trng trên toƠn trái đt mi nm s dng khong
100-110 triu tn nit, trong khi đó phơn đm hóa hc ca tt c các nc trên th
gii ch b sung khong 30 % s lng nit b ly đi. Mun phá v ba liên kt trong
phân t nit (N=N) đ d to ra các loi phân hóa hc, cn phi s dng các điu
kin k thut rt phc tp (nhit đ cao, áp sut cao, cht xúc tác đt tin) (Bch
Lan Phng, 2011).
1.2.2 C ch quá trình c đnh nit phân t
C đnh đm sinh hc là quá trình kh N
2
thành NH
3
di s xúc tác ca h
enzym nitrogenase. Sau đó, NH
3
có th kt hp vi các acid hu c đ to thành
protein. Trong không khí, N
2
 dng rt bn và s lng rt phong phú, chim 78,16
% theo th tích và 75,5 % theo khi lng. Cây trng cng nh các loƠi đng vt và
ngi không có kh nng đng hóa trc tip ngun N

(Bch Lan Phng, 2011).

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 8

1.3 VI KHUN HÒA TAN LÂN
1.3.1 Vai trò ca lân đi vi cây trng
Lân gi vai trò quan trng trong đi sng cây trng vì nó có thành phn ca
protit to nên nhân t bào, cn cho vic to ra các b phn mi cho cây, tham gia
tng hp acid amin. Nh vy lân gi vai trò rt quan trng trong đi sng ca t
bƠo. Khi cơy tng trng, hình thành nên nhiu t bào mi thì cn phi có thêm
nucleo-protit và cây phi hút thêm c đm ln lân. Nu trong đt có lân mà không
có đm cơy cng không phát trin đc.
Nhiu hp cht phc tp khác nhau tham gia vào quá trình hô hp và quang hp
ca cơy đu cha lân. Trong rt nhiu quá trình sinh hóa xy ra trong cây luôn có s
tham gia ca lân.
Vi sinh vt s bin đi lân thành dng mui ca acid phosphoric. Di dng này
mt phn đc cây s dng, mt phn đc c đnh di dng khó tan nh
Ca
3
(PO
4
)
2
. Nhng dng khó tan nƠy trong môi trng có pH thích hp s chuyn
hóa và bin thành dng d tan. Trong quá trình này vi sinh vt gi vai trò quan trng
(Bch Lan Phng, 2011).
1.3.2 Vi sinh vt hòa tan lân hu c
Vi sinh vt hòa tan lân hu c ch yu gm Bacillus và Pseudomonas. áng chú

3
(PO
4
)
2
có liên quan mt thit đn s sn sinh acid trong quá
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 9

trình sng ca vi sinh vt. Tác dng vi mt trong bn loi acid: H
3
PO
4
, H
2
CO
3
,
HNO
3
, H
2
SO
4
, trong đó H
2
CO
3
rt quan trng. Chính H

3
)
2
1.4 VI KHUN SINH IAA
IAA là mt hormon quan trng đc sn xut bi mt s PGPR, có rt nhiu
nghiên cu đã chng minh rng khi cây trng đc x lý vi IAA do PGPR sn
xut s gia tng s phát trin. Vic  vi khun Bacillus RC23, Paenibacillus
polymyxa RC05, B. subtilis OSU142, Bacillus RC03, Comamonas acidovorans
RC41, B. megaterium RC01, B. simplex RC19 vi trƠ đã lƠm gia tng t l r so vi
đi chng do vi khun có kh nng sinh IAA (Maheshwari K, 2011). Mt nghiên
cu khác cho thy Azospirillum không ch có kh nng c đnh đm mà còn có kh
nng sn xut IAA. Các chng Azospirillum đc nghiên cu cho thy rng sn
phm IAA ph thuc vƠo môi trng nuôi cy và tin cht tryptophan.
Cytokinins là mt nhóm hormon hin din vi lng rt nh trong sinh vt và
thng gơy khó khn cho vic phát hin vƠ đnh lng. Cytokinins đc sn xut
bi mt s vi khun nh Azospirillum và Pseudomonas spp. Ngoài ra, mt vài vi
khun PGPR đc báo cáo là có kh nng sn sinh cytokinins nh Rhizobium
leguminosarum, Paenibacillus polymyxa, Pseudomonas fluorescens (Maheshwari
K, 2011).
Trong mt vài nghiên cu, các PGPR nh R. phaseoli, A. lipoferum,
Azotospirillum brasilense, Acetobacter diazotropicus, Herbospirillum seropedicae,
Bacillus licheniformis, B. pumilus, Bacillus cereus MJ-1, Bacillus macroides CJ-29
đã đc báo cáo là có kh nng sn xut GAs, nhng điu nƠy cha đc chng
minh mt cách rõ ràng. Tuy nhiên, trong nhng nghiên cu gn đơy, Gutierrez-
Manero và cng s (2001) đã cung cp chng c v bn loi GAs đc sn xut bi
Bacillus pumilus và Bacillus licheniformis

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 10

trin mnh, tc đ lơy lan nhanh. Bnh thng phát sinh trc tiên  các b vƠ lá
giƠ sát mt nc hoc  di gc. Tc đ lơy lan lên các lá phía trên ph thuc rt
nhiu vƠ thi tit ma nhiu, lng nc trên đng rung quá cao, đc bit  các
rung nhiu nc, cy quá dƠy.
S phát trin ca bnh khô vn  thi k đu t cơy m đn đ nhánh có mc đ
bnh ít. Giai đon đòng tr đn chín sáp lƠ thi k nhim bnh nng.  min Bc
nc ta bnh khô vn gơy hi trong v mùa ln hn  v đông xuơn.
S phát sinh phát trin ca bnh có liên quan nhiu ti ch đ nc trên đng
rung vƠ ch đ phơn bón. Bón phơn đm nhiu, bón đm mun thúc đòng bnh s
phát sinh phát trin mnh hn. Bón nhiu ln cng lƠm cho mc đ b bnh cao.
Bón Kali có tác dng lƠ gim mc đ nhim bnh ca cơy.
Ngun bnh ch yu lƠ hch nm tn ti  trên đt rung vƠ si nm  gc r vƠ
lá b bnh còn sót li sau thu hoch. Hch nm có th sng mt thi gian dƠi sau thu
hoch lúa thm chí trong điu kin ngp nc ngn hn vn có ti 30 % s hch gi
đc sc sng, ny mm thƠnh si vƠ xơm nhim gơy bnh cho v sau. Quá trình
xơm nhim lp li thng xy ra qua tip xúc gia hch vƠ b lá úa (V Triu Mân,
2007).
Ch s ca đt gơy bnh ln đu có liên quan mt thit vi s lng hch tip
xúc vi cơy, nhng s phát trin ca bnh sau khi tip xúc vi kỦ ch li chu nh
hng ln ca nhit đ, m đ vƠ tính mn cm ca cơy kỦ ch.
Phn ng ca các ging đu nm trong phm vi t nhim nm đn tng đi
chng chu. Cha có ging lúa nƠo th hin đc tính chng bnh cao. Ging lúa
Indica chng chu bnh tt hn ging lúa Japonica.  nc ta, hu ht các ging lúa
đa phng vƠ ging nhp ni đu có mc đ nhim bnh khô vn t trung bình đn
nhim nm. Mt s ít các ging nh KV10, IR9965, IR50, IR17494, OM80, có
mc đ nhim bnh nh hn so vi các ging khác, lúa thun, lúa lai, (V Triu
Mân, 2007).
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 12

có th nm  gia, gn cui hoc  cui, vƠ túi bƠo t phng hoc không phng.
Tr B. anthracis và B. mycoides, hu ht các loƠi Bacillus đu di đng, mc dù có
s khác bit rt ln v kh nng di đng trong mi loƠi. a s các loài có catalase
dng tính (Nguyn c Qunh Nh vƠ cs, 2009; Nguyn Vn Thanh và cs.,
2009).
Phn ln các chi Bacillus phát trin tt trên các môi trng dinh dng thng
mi gm các thƠnh phn c bn nh: pepton, cao tht, glucose, lactose, cht
khoáng,…, mc dù trong mt s trng hp đc bit, các môi trng nƠy cn đc
điu chnh pH hoc nng đ mui (pH t 2 ậ 11, vƠ nng đ mui t di 2 ậ 25
%). Trong phòng thí nghim, di điu kin phát trin ti u, thi gian th h ca
Bacillus khong 25 phút. Trong môi trng nuôi cy lng chúng to váng trên b
mt. Trên môi trng thch to khun lc to, tròn hay hình dng bt thng, có mƠu
xám ng vƠng nht, b mt khóm sn sùi, hi nhn hoc to mƠng mn lan trên b
mt thch (Gibson và cs., 1975).
Hình dng khun lc thay đi tùy theo đ tui, vƠ các đa nuôi cy riêng l có th
to ra các dng khun lc khác nhau. B. larvae và B. popilliae trong môi trng
nuôi cy cn có thêm thiamine. Chúng thng phát trin trên môi trng J cha
trypton, glucose, dch chit nm men. B. pasteuri cn b sung 0,5 ậ 1 % urea vƠo tt
c môi trng nuôi cy. B. stearothermophilus phát trin trên môi trng dinh
dng có b sung calci vƠ st (Gibson và cs., 1975).
Phn ln các chng Bacillus a nhit trung tính. Các loƠi a nhit nh B.
stearothermophilus phát trin t 55 đn 70
o
C, thng lƠ khong 60
o
C. Các loài này
a nhit bt buc vƠ không th phát trin  37
o
C. LoƠi a nhit trung bình nh B.
coagulans phát trin tt ti 45 ậ 50

mƠu tím đ.
- Azotobacter vinelandi: có kh nng di đng, sc t mƠu vƠng lc đn hunh
quang, khuych tán vƠo môi trng.
- Azotobacter armeniacus: có kh nng di đng, sc t mƠu nơu đen cho ti
mƠu tím đ.
Azotobacter thuc loi vi khun hiu khí nhng có th phát trin đc trong các
điu kin vi hiu khí. Nhit đ thích hp khong 26-30
o
C, pH thích hp nht đi
vi Azotobacter là 7,2 - 8,2.
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

SVTH: LÊ TH HO 15

Azotobacter thuc loi vi khun có kh nng chu đc nhng nng đ mui khá
cao, có th phát trin đc ngay c trong nhng môi trng cha 2,5-3 % NaCl.
Vi khun Azotobacter có kh nng t túc v các cht sinh trng khác nhau:
tiamin (vitamin B1), riboflavin (vitamin B2), xianocobalamin (vitamin B12), acid
pantotenic, acid folic, biotin, gibberellins.
Mt s nghiên cu còn xác đnh rng Azotobacter có kh nng tng hp ra mt
s cht kháng nm, kh nng nƠy không ging nhau  các chng Azotobacter. Mt
s chng Azotobacter chroococcum có kh nng sinh ra mt s cht kháng nm có
ph tác dng khá rng c ch Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria,…
S phát trin và c đnh nit ca Azotobacter trong đt chu nh hng mt thit
ca khu h vi sinh vt đt. Bên cnh nhng nhóm vi sinh vt có nh hng tt đi
vi s phát trin ca Azotobacter (tng hp các cht hot đng sinh hc, phân gii
các cht hu c bn vng) còn có nhiu nhóm vi sinh vt có kh nng c ch s
phát trin ca Azotobacter (cnh tranh thc n, sn xut cht kháng sinh,…)
(Nguyn Lơn Dng và cs.).