i
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
HOÀNG THỊ TRANG SỬ DỤNG CHỈ THỊ SSR ĐỂ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI
TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƢƠNG CÓ KHẢ
NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Thái Nguyên - 2014
ii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
hƣớng khoa học, tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong
suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Thanh Trà đã tạo mọi điều kiệ
ệm. Tôi x Hoàng Phú Hiệp và các thầy,
cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học
Th i Nguyên đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình tiến hành các thí
nghiệm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.
Tôi xin tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ khoa Khoa học sự
sống, trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ
bảo và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã
nhiệt tình động viên cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và
nghiên cứu khoa học. .
Thái Nguyên, tháng 10 năm 2014
Tác giả
Hoàng Thị Trang
iv
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN iii
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 25
2.1.1. Vật liệu 25
2.1.2. Hóa chất 26
2.1.3. Thiết bị và địa điểm nghiên cứu 27
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.2.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu và tách chiết DNA tổng số 27
2.2.2. Tuyển chọn và tổng hợp các cặp mồi SSR cho phân tích mẫu 28
2.2.3. Phản ứng PCR-SSR 30
2.2.4. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose 31
2.2.5. Phƣơng pháp phân tích và xử lý dữ liệu PCR-SSR 31
Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
3.1. NHÂN BẢN CÁC PHÂN ĐOẠN DNA BẰNG PHẢN ỨNG PCR-SSR 32
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mầm đậu tƣơng 32
3.1.2. Kết quả ằng phản ứng PCR- SSR 33
ỀN CỦA CÁC GIỐ
TƢƠNG KHÁNG BỆ 41
44
KẾT LUẬ 49
1. Kết luận 49
2. Đề nghị 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
vi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2-DE Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều
SDS Sodium Đoecyl Sulphat
SNP Single nucleotide polymorphism
SSR Simple Sequence Repeats -trình tự lặp lại đơn giản
STSs Sequence Tagged Site
TAE Tris – Acetate – EDTA
Tris Trioxymetylaminometan
XK Xuất khẩu
USDA United State Department of Agriculture - Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ
UPGMA Phƣơng pháp phân nhóm
viii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Bảng 1.1. Diện tích thu hoạch đậu tƣơng một số nƣớc trên thế giới 4
Bảng 1.2. Sản lƣợng sản xuất đậu tƣơng ở một số quốc gia trên thế giới 5
Bảng 1.3. Năng suất đậu tƣơng một số nƣớc trên thế giới 7
ới cặp mồi Sat_640 –F
/Sat_640-R 34
với cặp mồi Sct_187-F
/Sct187-R 35
với cặp mồi Satt431-F/
Satt431-R 36
với cặp mồi Satt460-F
/Satt460-R 38
12 giống đậu tƣơng có
phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắ 42
1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá
trị kinh tế cao, mang ý nghĩa trong cải tạo đất trồng, dễ canh tác, đặc biệt có khả
năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác nhau. Hạt đậu tƣơng chứa 30-55%
protein, chứa nhiều loại amino acid không thay thế, 12-25% lipid và các vitamin
cần thiết cho cơ thể. Các sản phầm từ đậu tƣơng đƣợc sử dụng rộng rãi cho các
mục đích khác nhau nhƣ làm thức ăn, dầu ăn, thực phẩm chức năng, nguyên liệu
cho y học và công nghiệp…Bên cạnh giá trị dinh dƣỡng cao, cây đậu tƣơng còn
có khả năng cố định đạm nhờ vi khuẩn R. japonicum sống cộng sinh trên rễ cây
tạo thành các nốt sần, giúp cải tạo đất hiệu quả. Do đó, cây đậu tƣơng đã đƣợc
quan tâm trồng và phát triển mạnh ở nhiều quốc gia trên thế giới. Ở Việt Nam,
đậu tƣơng là nhóm cây trồng chính đƣợc ƣu tiên khuyến khích phát triển, sản
xuất đứng sau lúa, ngô và lạc.
Đánh giá đƣợc mức độ đa dạng di truyền của một số giống đậu tƣơng
kháng bệnh gỉ sắt khác nhau bằng chỉ thị SSR.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tách và nhân bản các phân đoạn SSR bằng phản ứng PCR - SSR.
- Nghiên cứu, phân tích mức độ đa dạng di truyền của các giống đậu
tƣơng dựa trên chỉ thị SSR. 3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY
ĐẬU TƢƠNG
1.1.1. Cây đậu tương
Đậu tƣơng hay đỗ tƣơng, đậu tƣơng (tên khoa học Glycine max) là loại
cây họ Đậu (Fabaceae), là loài bản địa của Đông Á. Cây đậu tƣơng đƣợc thuần
hóa và trồng nhiều ở Trung Quốc vào khoảng thế kỷ XVII trƣớc công nguyên.
Sau đó cây đậu tƣơng đƣợc truyền bá và du nhập sang các nƣớc Nhật Bản, Thái
Lan, Philipppin, Việt Nam vài thế kỷ sau đó. Cây đậu tƣơng đƣợc trồng ở châu
Âu và ở Hoa Kỳ vào khoảng thế kỷ XVII và XVIII. Loài này giàu hàm
lƣợng chất đạm protein. Hạt đậu tƣơng có hàm lƣợng protein cao từ 20% – 45%
dễ tan và hầu hết chứa các loại axit amin, đặc biệt là các loại axit amin không
Quốc gia
Diện tích thu hoạch (Nghìn ha)
Năm 2010
Năm 2011
Năm 2012
Năm 2013
Hoa kỳ
78849447
79260943
80359578
85632823
Brazil
23327296
23968663
24975258
27864915
Nhật Bản
137700
136700
131100
128800
Argentina
18130799
18746227
17577320
19418825
Ấn Độ
9554190
10180000
10840000
sản xuất đậu tƣơng đứng đầu thế giới: Mỹ, Brazin, Argentina và Trung Quốc
chiếm khoảng 90-95% tổng sản lƣợng đậu tƣơng trên thế giới.
Bảng 1.2. Sản lượng sản xuất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới
Quốc gia
Sản lƣợng ( nghìn tấn)
Năm 2010
Năm 2011
Năm 2012
Năm 2013
Hoa Kỳ
227932,4
224594
203008,3
240826,1
Brazil
68756,3
74815,5
65848,9
81699,8
Argentina
52677,4
48878,8
40100,2
49306,2
Trung Quốc
15083,2
14485,1
13050,2
12500,2
Ấn Độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu tới năng suất và sản lƣợng đậu tƣơng không nhỏ. Năng suất đậu tƣơng của các
nƣớc cũng biến động tăng giảm theo từng năm 1.3).
7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu Bảng 1.3. Năng suất đậu tương một số nước trên thế giới
Quốc gia
Năng suất (tấn/ha)
Năm 2010
Năm 21011
Năm 2012
Năm 2013
Brazil
2947,5
3121,4
2636,6
2932,0
Hoa kỳ
2922,4
2819,9
2664,2
2914,5
Argentina
2905,4
quốc (FAO) ().
Ở Việt Nam, hiện nay đậu tƣơng đƣợc trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp,
trong đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất là 46,6%, đồng
bằng Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%,
đồng bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% và vùng Duyên hải miền
Trung 1,6% [4]. Cây đậu tƣơng chiếm một vị trí rất quan trọng trong nền
nông nghiệp nƣớc ta, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chƣa
phát triển. Tuy nhiên việc sản xuất đậu tƣơng ở trong nƣớc vẫn chƣa đƣợc
đầu tƣ cao, năng suất còn thấp, do vậy nghiên cứu cải tiến các đặc điểm nông
học của các giống địa phƣơng và tạo giống mới có năng suất cao, thích nghi
với điều kiện sinh thái ở những vùng khác nhau bằng phƣơng pháp truyền
thống kết hợp với hiện đại sẽ đáp ứng đƣợc yêu cầu của thực tiễn đặt ra và đó
cũng là chiến lƣợc quan trọng về sự phát triển cây đậu đỗ ở nƣớc ta.
Năm 2013, Việ 556 nghìn tấ
8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu , giảm 3,7% so với năm trƣớc nhƣng tăng 145% so với năm 2011. Đế
ụ 2013/14, với tình hình ngành công nghiệ ự
tăng trƣờng, lƣợng xuất khẩu đậu tƣơng đƣợc dự đoán sẽ lên 600 nghìn tấn.
Cũng trong 2012/13, với sự phục hồi của ngành thức ăn sau suy thoái
kinh tế, tổng lƣợng khô đậu tƣơng nhập khẩu tăng trở lại đạt 2,97 triệu tấn,
tăng 19% so với năm trƣớc. Đây là lĩnh vực tiếp tục đƣợc cải thiện và USDA
dự đoán sẽ tăng nhẹ, đạt 3,1 triệu tấn vào năm 2014 và 3,2 triệu tấn năm
2015. Sản lƣợng dầu đậ 2013 đã giảm 9,8% do
nhu cầu thấp hơn so với dự kiến, lƣợng xuất khẩu cũng giảm xuống còn 13%
so với năm 2012 do sản lƣợng thấp.
Điều kiện thời tiết không thuận lợi đã khiến sản lƣợng đậu tƣơng nƣớc ta
năm 2013 giảm 3% so với năm 2012, xuống còn 168 nghìn tấn. Mƣa bão nặ
ốt năm đã khiến năng suất cây trồng và diện tích thu hoạch đậ
1.1). Quy mô sản xuất nhỏ lẻ so với các loại cây trồng khác chính là
nguyên nhân khiến ngành đậu tƣơng vẫn không đáp ứng đƣợc nhu cầu tiêu thụ
trong nƣớc. Tổ chức USDA dự báo nếu điều kiện thời tiết thuận lợi, diện tích
9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu gieo trồng đậu tƣơng năm 2013 và 2014 lần lƣợt đạt 120 nghìn và 130 nghìn
héc-ta, với mức sản lƣợng tăng nhẹ khoảng 176 và 192 nghìn tấn. Khả năng
cạnh tran ậu tƣơng so với ngô vẫn còn thấ ỗi
héc-ta trồng đậu tƣơng thấp hơn so với trồng ngô. Khu vực trồng đậu tƣơng
chính tập trung ở vùng Đồng bằng sông Hồng, miền Bắc nƣớc ta.
1.1: Diện tích trồng và sản lƣợng cây đậu tƣơng tại Việt Nam
(2011-2015)
* Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam, *số liệu dự báo
Sự biến động sản lƣợng, năng suất hay diện tích đậu tƣơng của nƣớc ta
là không cao, dự kiến các năm tiếp theo 2014 và 2015 cũng tăng không đáng
kể, nguyên nhân là ngƣời dân và nhà nƣớc vẫn chƣa đầu tƣ sâu sắc tới cây
đậu tƣơng, bên cạnh đó bệnh dịch hại cây hay điều kiện khí hậu làm thiện
hại đáng kể sản lƣợng đậu tƣơng.
1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương
Hạt đậu tƣơng có thành phần chủ yếu là protein, lipid, glucid, các
vitamin và các chất khoáng. Trong hạt đậu tƣơng, hàm lƣợng protein chiếm
Bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra là một trong những
bệnh chính trên cây đậu tƣơng (Glycine max) ở Châu Á và gây thiệt hại đáng
11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu kể về năng suất ở các nƣớc trồng đậu tƣơng. Hầu hết các nƣớc nhiệt đới và
cận nhiệt đới đều ghi nhận có sự xuất hiện của bệnh gỉ sắt đậu tƣơng địa
phƣơng [50]. Ở Đài Loan, bệnh gỉ sắt có thể gây thiệt hại nghiêm trọng trên
cây đậu tƣơng không đƣợc bảo vệ bằng thuốc trị nấm và ở một số vùng, bệnh
gỉ sắt là một yếu tố làm giới hạn việc sản xuất đậu tƣơng vụ xuân. Do sự thiếu
thông tin về bệnh gỉ sắt đậu tƣơng ở Tây Bán cầu và nguy cơ tiềm năng ảnh
hƣởng đến việc sản xuất đậu tƣơng ở Mỹ, Bộ Nông nghiệp Mỹ, Phòng thí
nghiệm Nghiên cứu Bệnh Thực vật và Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển
Rau Châu Á (AVRDC) đã khởi động một dự án hợp tác vào năm 1978 để
nghiên cứu dịch tể học của bệnh gỉ sắt đậu tƣơng. Dự án hợp tác này kéo dài
đến năm 1982 và các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tƣơng đƣợc tiếp tục tiến
hành ở AVRDC cho đến năm 1992.
Ngoài ra, FAO đã thiết lập một mạng lƣới nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu
tƣơng liên kết các nƣớc Châu Á. Chƣơng trình quốc gia của Thái Lan đã và
đang tiến hành các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tƣơng với các chƣơng trình
lai giống chủ động kéo dài hơn 10 năm qua [34]. Ở Indonesia, bệnh gỉ sắt
đƣợc xem là loại bệnh nghiêm trọng nhất trên cây đậu tƣơng, xuất hiện cả ở
mùa mƣa và mùa khô. Các hoạt động nghiên cứu ở Indonesia bao gồm cải
thiện tính kháng , thử nghiệm thuốc trị nấm, sự tồn lƣu của hạ bào tử
trên đồng ruộng, quản lý bệnh gỉ sắt thông qua trồng thử nghiệm và các
nghiên cứu về sự phát tán bào tử.
Dấu hiệu và triệu chứng bệnh: là những chấm màu trong ở phiến lá, cỡ
1mm, sau lớn dần và chuyển màu vàng rồi nâu, đạt tới kích thƣớc từ 2-5mm
1.2.2. Tính chống chịu bệnh gỉ sắt của cây đậu tương
Tính chống chịu bệnh gỉ sắt là khả năng cho năng suất tƣơng đối của cây
dƣới áp lực của bệnh gỉ sắt. Để so sánh năng suất tƣơng đối, ngƣời ta so sánh
một dòng đƣợc trồng trên ô đƣợc và không đƣợc bảo vệ bằng thuốc trừ nấm.
Mặc dù cần có thêm diện tích ruộng, tính chống chịu cần đƣợc đánh giá vào
mỗi mùa vụ chứ không giống nhƣ việc thu thập dữ liệu đƣờng cong tiến triển
bệnh, sự rụng lá và đếm nốt bệnh cho tính kháng gây giảm tốc độ phát bệnh.
13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu Sự tƣơng tác giữa vật chủ và vật ký sinh theo mô hình tƣơng tác gen đối
gen (gen for gen). Đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện thấy có năm gen
chính liên quan đến tính kháng bệnh gỉ sắt ở đậu tƣơng bao gồm: gen Rpp1,
gen Rpp2; gen Rpp3; gen Rpp4; gen Rpp5 và gen Rpp6. Các nghiên cứu về
gen cho thấy sáu gen Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5 và Rpp6 đã đƣợc phát
hiện và mô tả có khả năng liên quan tới tính kháng đối với một số chủng nấm
P.pachyrhizi. Tuy nhiên vẫn chƣa có nghiên cứu nào công bố giống đậu
tƣơng nào kháng đƣợc với tất cả các chủng nấm P.pachyrhizi.
1.2.3 ở cây
đậu tương
Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về gỉ sắt [35], [36],
[37], [38], [39], [40], [43], [44]. Ở các nƣớc trên thế giới, bệnh gỉ sắt gây thiệt
hại nghiêm trọng đến cây đậu tƣơng và một số cây trồng khác, làm hạn chế
năng suất đậu tƣơng vụ xuân. Vì vậy ở nhiều quốc gia trên thế giới đã có rất
nhiều công trình nghiên cứu khắc phục và chọn tạo nhiều giống đậu tƣơng có
tính kháng bệnh gỉ sắt cao và năng suất vợt trội nhƣ: giống Tainung 4 có sức
kháng bệnh nhiều hơn các giống khác. Các nƣớc đã đầu tƣ rất nhiều kinh phí
và Trung Quốc [21] Các phát hiện của của nhóm nghiên cứu này đã chỉ ra
rằng các giống đậu tƣơng của các nƣớc Đông Nam Á và Trung Á phần lớn bắt
nguồn từ Trung Quốc. Trong khi đó, Cregan và cộng sự (1999) đã sử dụng
đồng thời các chỉ thị SSR, RAPD, AFLP và thiết lập đƣợc bản đồ gen với 20
nhóm gen liên kết ở đậu tƣơng trên cơ sở ba quần lai của các trƣờng đại học
Iowa, Utah và Nebraska [25].
Hiện nay ở Việt Nam, mặc dù cây đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill)
chiếm một vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp và nền kinh tế quốc dân,
nhƣng diện tích trồng và sản lƣợng vẫn còn rất thấp so với các nƣớc trên thế
giới. So với năm 2001, diện tích trồng đậu tƣơng ở nƣớc ta trong năm 2005
15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu tăng 24,16%, sản lƣợng tăng 29,10%. Nhƣng đáng chú ý là năng suất đậu
tƣơng gần nhƣ không tăng hoặc tăng không đáng kể, do nhiều nguyên nhân
nhƣ hạn chế về giống và điều kiện canh tác, bên cạnh đó là các bệnh sƣơng
mai, phấn trắng, gỉ sắt… là những loại bệnh thƣờng xuyên xuất hiện gây ảnh
hƣởng nghiêm trọng tới tình hình sản xuất đậu tƣơng. Thực tiễn này đòi hỏi
phải có sự đánh giá, lựa chọn các giống đậu tƣơng mới có năng suất cao, chất
lƣợng tốt đồng thời có khả năng kháng đƣợc các bệnh, đặc biệt là bệnh gỉ sắt
[12]. Trong những năm gần đây, các công trình nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu
tƣơng đã đƣợc tiến hành nhiều nơi trên thế giới và ở Việt Nam [17], [32],
[33], [34], [35], [36], tuy nhiên việc nghiên cứu một các hệ thống về bệnh gỉ
sắt và khả năng kháng bệnh này ở cây đậu tƣơng còn ít đƣợc đề cập đến.
Ở nƣớc ta, kết quả thí nghiệm của một số tác giả thuộc trƣờng Đại học
Nông nghiệp Hà Nội cho thấy các giống đậu tƣơng trồng đều bị nhiễm bệnh
với các mức độ khác nhau. Các giống ít bị bệnh hay bị nhiễm muộn trên đồng
ruộng hiện nay là M103, DT93, DT84, AK03, AK05, VX93, dòng 42. Các
DT95, M103 và DT96, con lai của DT84 và DT90 (có khả năng kháng bệnh
gỉ sắt) đƣợc đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ số tích luỹ bệnh
theo thời gian AUDPC kết hợp các phân tích về phản ứng bệnh, khả năng tạo
bào tử và tạo quầng [17]. Kết quả cho thấy, các giống DT95 và CBU8325 có
chỉ số AUDPC thấp khả khả năng kháng bệnh gỉ sắt gần tƣơng đƣơng với
giống kháng đối chứng (DT2000). Hạt giống của các giống này đƣợc tiếp tục
nghiên cứu về chất lƣợng hạt trên phƣơng diện hoá sinh và cho thấy chúng có
hàm lƣợng protein và lipid từ trung bình đến cao, có mặt đầy đủ các loại dự
trữ chính, đảm bảo là nguồn cung cấp thực phẩm có chất lƣợng dinh dƣỡng
cao cho con ngƣời và gia súc.
Copyright: Tài liệu đại học ©