Nhập môn Công nghệ sinh học
270
Chương 8

Các ứng dụng trong y dược

I. Mở đầu
Cho đến nay, có lẽ thành tựu công nghệ sinh học được thể hiện rõ nét
nhất là ở lĩnh vực y học như liệu pháp protein và liệu pháp gen để chữa trị
một số bệnh hiểm nghèo (ung thư, nhiễm virus và hiện đang thử nghiệm
chữa trị bệnh AIDS...) cũng như để chẩn đoán bệnh (viêm gan, sốt xuất
huyết, sán lá gan...) và phòng bệnh (vaccine). Ngày nay, với những công cụ
của kỹ thuật gen, ngành y không chỉ dựa vào các triệu chứng lâm sàng mà
còn có khả năng tác động thẳng vào các nguyên nhân sâu xa của bệnh đó là
sự bất thường của gen. Công nghệ sinh học đã xâm nhập vào hầu như mọi
lĩnh vực của y học, trong đó đáng kể nhất là lĩnh vực chẩn đoán và phòng
ngừa với việc tạo ra các bộ kit chẩn đoán bệnh bằng phương pháp PCR và
các DNA vaccine có hiệu quả cao. Lĩnh vực sản xuất thuốc chữa bệnh như
interferon, insulin, interleukin, hormone sinh trưởng ở người... ngày càng
phát triển mạnh và trở thành một ngành công nghiệp quan trọng. Đặc biệt,
liệu pháp gen mặc dù thành tựu còn ít nhưng đã mở ra những triển vọng to
lớn trong việc chữa trị những bệnh di truyền và bệnh nan y.

II. Vaccine
Trong sản xuất vaccine, cho đến thời gian gần đây, người ta vẫn sử
dụng vaccine bất hoạt hoặc vaccine sống nhược độc làm kháng nguyên kích
thích tạo kháng thể cần thiết trong cơ thể người và vật nuôi. Nhưng vaccine
được sản xuất theo cách này có một vài hạn chế, chẳng hạn vaccine sống
nhược độc có khả năng quay trở lại dạng độc hoặc hoạt lực của nó giảm khá
nhanh trong cơ thể người và vật nuôi.
Đến nay, nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp người ta đã sản xuất được

là một dạng vaccine bất hoạt nhưng có mức độ thấp hơn. Trong trường hợp
này, một phần của tác nhân gây bệnh (như là protein bề mặt) được sử dụng
để gây tạo kháng thể nhằm trung hòa tác nhân gây bệnh.
Sử dụng rộng rãi kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B được
tinh sạch từ máu của người bệnh hoặc gần đây hơn từ nấm men tái tổ hợp là
một phương thức rất hiệu quả để tạo miễn dịch. Kháng nguyên bề mặt của
virus viêm gan B (sản phẩm của gen đơn) kích thích tạo ra sự bảo vệ và gần
như hoàn toàn chống lại sự viêm nhiễm virus viêm gan B.
Một ví dụ khác của loại vaccine tiểu đơn vị là sử dụng biến độc tố của
vi khuẩn. Nhiều loại vi khuẩn sản xuất độc tố đóng vai trò quan trọng trong
sự phát triển của bệnh. Vì vậy, một số tác nhân mang độc tố (ví dụ bệnh uốn
ván và bệnh bạch hầu) đã được bất hoạt bằng formaldehyde liên kết với một
Nhập môn Công nghệ sinh học
272
chất tá dược (adjuvant) để phát triển thành vaccine. Cơ thể tạo miễn dịch
bảo vệ bằng cách kích thích kháng thể trung hòa các ảnh hưởng của độc tố.
Một loại vaccine khác cũng thuộc loại tiểu đơn vị là các vaccine vỏ
polysaccharide. Chẳng hạn, những vaccine chống lại Haemophilus
influenzae và viêm màng não do não mô cầu. Trong trường hợp này dịch
chiết vỏ ngoài polysaccharide của vi khuẩn được sử dụng như là một
vaccine và có khi được liên kết với protein để cải thiện khả năng gây miễn
dịch. Kháng thể bền bỉ trong một vài năm và có thể bảo vệ chống vi khuẩn.

1.2. Các vaccine sống nhược độc
Các vaccine sống có hiệu lực (như một sự viêm nhiễm tự nhiên)
thường tạo ra một sự miễn dịch lâu dài. Hầu hết các vaccine nhược độc hiện
nay được sản xuất một cách khá kinh nghiệm, theo cách quá trình nuôi cấy
được cấy chuyển nhiều lần cho tới khi nhận thấy có sự mất độc lực
(virulence) của tác nhân gây bệnh bố mẹ. Độc lực này được xét nghiệm
trong các hệ thống động vật mô hình trước khi thử nghiệm trên những người

chống lại bệnh sốt rét. Nhưng giai đoạn thoa trùng trong chu kỳ sống của ký
sinh trùng sốt rét chỉ sinh trưởng với một lượng nhỏ, nên người ta cần phải
ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để sản xuất vaccine. Tuy nhiên,
genome của ký sinh trùng sốt rét lại lớn hơn genome của HBV hàng ngàn
lần, vì thế người ta đã gặp rất nhiều khó khăn trong việc thu thập các thông
tin về trình tự gen thích hợp và sản phẩm của nó để tạo ra bảo vệ miễn dịch.
Điểm khởi đầu của công nghệ DNA tái tổ hợp là xây dựng thư viện
DNA của cơ thể được nghiên cứu trong E. coli. Thư viện cDNA hoặc
genomic DNA có thể cung cấp các phương thức cơ bản để nhận dạng và
phân lập các gen quan tâm. Với các thành tựu trong kỹ thuật phân tích trình
tự gen thì thông tin trình tự bắt nguồn từ các genome hoàn chỉnh hoặc các
nhiễm sắc thể riêng biệt đã trở nên càng ngày càng quan trọng.

2.2. Phân tích các kháng nguyên vaccine
2.2.1. Những yếu tố quyết định kháng nguyên tế bào B (B-cell epitopes)
Phân tích cấu trúc của kháng nguyên vaccine có thể thu được các
thông tin giá trị trong việc phát triển vaccine. Chẳng hạn, hiểu biết về những
epitope (yếu tố quyết định kháng nguyên) chống lại các kháng thể trung hòa
có thể cho phép nghiên cứu loại vaccine peptide thích hợp. Các epitope có
thể liên tục hoặc gián đoạn. Các epitope liên tục là các peptide ở dạng xoắn
ngẫu nhiên để các huyết thanh miễn dịch cho epitope phản ứng với phân tử
hoàn chỉnh từ trình tự mà nó được bắt nguồn. Các epitope gián đoạn lắp
ghép các phân tử được nhóm lại do cấu trúc thứ cấp của protein. Một vài
epitope trung hòa ở dạng liên tục trong khi những epitope khác là gián đoạn.

Nhập môn Công nghệ sinh học
274
2.2.2. Những yếu tố quyết định kháng nguyên tế bào T (T-cell epitopes)
Các T lymphocyte có thể nhận diện các kháng nguyên ngoại lai như
các peptide được tạo thành trong sự phối hợp với phần ngoại bào của phân

vaccine viêm gan B đã cấp bản quyền được sản xuất trong tế bào động vật
có vú.
Nhập môn Công nghệ sinh học
275
3. Cải thiện và sản xuất các vaccine sống nhược độc mới
3.1. Cải thiện các vaccine sống nhược độc
Các kỹ thuật sinh học phân tử cho phép phân tích độc tính và đặc tính
kháng nguyên ở mức độ phân tử, như vậy đây là cơ sở thuận lợi để triển
khai một hướng nghiên cứu thích hợp hơn trong việc sản xuất các cơ thể
nhược độc để công nghiệp hóa vaccine sống với các tính chất mong muốn.
Các virus loại DNA và các vi sinh vật khác có thể được chuyển gen trực tiếp
hoặc gián tiếp. Tuy nhiên, các virus loại RNA ở một mức độ nào đó khó giải
quyết hơn, mặc dù đã có một vài thành công với virus bại liệt (poliovirus)
và virus bệnh cúm (influenza), do độ rắn chắc của genome virus.

3.2. Các vector sống tái tổ hợp
3.2.1. Các thể tái tổ hợp của viral vaccine
Các viral vaccine cho bệnh đậu mùa đã được sử dụng hơn 150 năm
dưới dạng vaccine sống nhược độc. Giá thành rẻ, sản xuất đơn giản, bảo
quản không cần lạnh, khả năng ổn định khi tiêm chủng và kích thích đáp
ứng kháng thể trung gian tế bào (cell-mediated) là tất cả ưu điểm của loại
vaccine này.
Tuy nhiên, những ưu điểm này chỉ thật sự hấp dẫn bởi các thể tái tổ
hợp vaccine biểu hiện gen ngoại lai (Hình 8.1). Hơn 1.000 thể tái tổ hợp
vaccine khác nhau biểu hiện các gen của virus, vi khuẩn và các tác nhân gây
bệnh ký sinh trùng đã được công bố. Đa số trong chúng đã cho thấy khả
năng bảo vệ ở các hệ thống động vật mô hình chống lại các tác nhân gây
bệnh. Thể tái tổ hợp vaccine biểu hiện glycoprotein vỏ gp160 của HIV-1
được thử nghiệm trên người cho thấy đã cảm ứng các đáp ứng miễn dịch đối
với HIV gp160. Tuy nhiên, các biến chứng kết hợp với liệu pháp vaccine và

vật có vú
Virus sinh
sản: dạng
hoang dại và
thể tái tổ hợp
mang gen
ngoại lai
Vết tan của dạng hoang
dại và thể tái tổ hợp
Các vết tan của thể tái tổ
hợp được chọn lọc để phát
triển vaccine
Nhập môn Công nghệ sinh học
277
vững đối với bệnh lao là rất hiệu quả với ít hơn một biến chứng trên một
triệu liều. Mặc dù, các vector loại phage và plasmid đã được sử dụng có một
vài thành công nhưng những nghiên cứu tiếp theo vẫn còn được tiến hành để
có thể hướng tới các mức độ biểu hiện cao và cho phép hệ thống được thao
tác dễ dàng hơn.

3.2.3. Các chủng Salmonella nhược độc (vaccine vi khuẩn sống)
Công nghệ DNA tái tổ hợp có khả năng đưa toàn bộ các đột biến hoặc
đoạn khuyết vào các chủng vi khuẩn khác nhau để làm yếu độc tính của
chúng. Các vaccine nhược độc được thiết kế hợp lý cũng có thể dùng như là
các chất mang cho các kháng nguyên được tạo dòng từ các cơ thể gây bệnh
khác. Các chủng Salmonella nhược độc được xem là một ứng cử viên tốt
cho hướng này bởi vì chúng có thể được dùng như một vaccine uống để
kích thích các phản ứng miễn dịch nội bào và bài tiết trong vật chủ. Chẳng
hạn, gen của tiểu đơn vị B không ổn nhiệt (heat labile B subunit) ở
enterotoxic E. coli được đưa vào trong chủng Salmonella nhược độc AroA.

Tuy nhiên, để sản xuất một vaccine có phạm vi bảo vệ rộng thì cần đưa vào
các thành phần kháng độc tố. Các plasmid vector được xây dựng bằng cách
sử dụng promoter mạnh của prokaryote biểu hiện cao LT toxin B subunit.

4. Các hướng tiếp cận khác trong sản xuất vaccine
4.1. Các DNA vaccine (miễn dịch di truyền)
Một điều khá ngạc nhiên là các plasmid mang các gen đặc hiệu cho
một hoặc nhiều protein kháng nguyên có thể được dùng để tạo miễn dịch
(chủng ngừa). Các plasmid được phân phối bằng cách tiêm (thường vào cơ)
đưa gen trực tiếp vào trong một số tế bào và được hấp thu bởi các tế bào lân
cận nơi kim tiêm được đưa vào. Ngoài ra, plasmid cũng có thể được phân
phối bằng súng bắn gen (các viên đạn vàng được bọc DNA của plasmid)
bằng cách đẩy các plasmid vào trong các tế bào gần bề mặt cơ thể, đặc trưng
cho loại này là tổ chức da hoặc màng nhầy. Một khi vào bên trong tế bào,
một vài plasmid tái tổ hợp sẽ đi vào nhân và do gen được điều hòa bởi một
promoter mạnh của eukaryote, các tế bào sẽ tổng hợp các kháng nguyên
được mã hóa bởi plasmid.

▪ Tối ưu các đáp ứng miễn dịch
Các đáp ứng đối với DNA vaccine thường cần một lượng nhất định
của plasmid DNA ( 50 g trên một lần tiêm) và hiệu quả miễn dịch không
bằng tiêm chủng tự nhiên với tác nhân gây bệnh hoặc được kích thích bởi
các vaccine sống nhược độc. Tuy nhiên, các đáp ứng miễn dịch có thể được
cải thiện bằng các phương pháp khác, chẳng hạn dùng súng bắn gen để đưa
DNA vào tế bào.
Nhập môn Công nghệ sinh học
279
Phản ứng miễn dịch đối với kháng nguyên bị ảnh hưởng bởi DNA của
plasmid mang gen. Do DNA của plasmid (có nguồn gốc từ vi khuẩn) có tỷ
lệ CG lớn hơn so với DNA trong động vật có xương sống, hơn nữa các đơn


Nhập môn Công nghệ sinh học
280
III. Kháng thể đơn dòng
Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng dựa trên nguyên lý sử dụng tế
bào lai (giữa tế bào ung thư myeloma với tế bào lympho B của hệ miễn dịch
ở động vật hoặc người) để sản xuất kháng thể. Kháng thể đơn dòng có rất
nhiều ứng dụng quan trọng trong y học: phát hiện kháng nguyên, ức chế
phản ứng đào thải khi ghép cơ quan, chẩn đoán sự hình thành khối u, định
hướng thuốc chữa bệnh bằng kháng thể đơn dòng, sử dụng kháng thể đơn
dòng để tinh sạch protein…

1. Sản xuất hybridoma bằng cách dung hợp tế bào sinh dưỡng
Trước đây, người ta cũng tạo ra kháng thể bằng kỹ thuật nuôi cấy tế
bào, nhưng theo phương pháp này, người ta phải định kỳ làm lại sau mỗi lần
thu được kháng thể, vì ở điều kiện nuôi cấy trong ống nghiệm, các tế bào
thường chỉ tiến hành một số lần phân bào nhất định rồi bị hủy.
Trong công nghệ sinh học, kỹ thuật tế bào lai hybridoma (lai giữa tế
bào myeloma với tế bào lympho B) đã mở ra một phương thức mới trong
miễn dịch học, để sản xuất vaccine hàng loạt. Người ta đã tạo ra một loại tế
bào lai có thể phân bào liên tục trong điều kiện nuôi cấy, đồng thời lại có
khả năng sản sinh ra kháng thể, từ đó kháng thể được sản xuất ra với khối
lượng rất lớn. Tế bào ung thư có đặc điểm rất quan trọng là loại tế bào có
tiềm năng phân chia liên tục (di căn). Khả năng sinh sản lâu dài và phân bào
liên tục của tế bào ung thư nuôi cấy có liên quan với khả năng tăng sinh của
các tế bào ung thư trong cơ thể sống. Người ta chọn một loại tế bào có khả
năng sinh ra kháng thể, hiện nay đang sử dụng tế bào lách của chuột nhắt đã
được miễn dịch chống một loại kháng nguyên nhất định. Tiến hành lai giữa
tế bào lách chuột nhắt với tế bào ung thư của tủy xương. Tế bào lai đem
nuôi cấy, phân chia liên tục, sản sinh ra một lượng rất lớn kháng thể. Kháng

các đoạn
chuỗi đơn có thể thay đổi (scFV) sẽ được tạo ra, các sản phẩm protein của
chúng có đủ khả năng để liên kết với kháng nguyên. Các cấu trúc scFV này
Sản xuất kháng thể được
cảm ứng trong chuột
bằng gây tạo miễn dịch
Các tế bào giải
phóng kháng thể
được phân lập
Các tế bào khối u
sinh trưởng in vitro
Các tế bào giải phóng kháng thể
và các tế bào khối u được dung
hợp để tạo thành hybridoma
Các hybridoma giải phóng
kháng thể được tạo dòng
Các kháng thể đơn dòng được phân lập