Khoa Sinh häc Khãa 2009 2011
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM THỊ TRÀ
NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM HẠT TỪ NANO
ĐƢỢC CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT TRONG
CHẨN ĐOÁN VIRUS EPSTEIN BARR Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN
TS. Nguyễn Thị Vân Anh


1.4.2. Phng phỏp tinh sch axớt nucleic bng dung mụi hu c 25
1.4.3. Phng phỏp tinh sch axớt nucleic bng mng xp silica 27
1.4.4. Phng phỏp tinh sch axớt nucleic bng ht t nano bc silica 28
1.4.5. iu kin v c ch phõn t ADN hp th lờn b mt ht nano t bc silica . 29
1.5. TèNH HèNH NGHIấN CU V NG DNG HT NANO T BC SILICA
TINH SCH AXT NUCLEIC 32

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

2
Chng 2: NGUYấN LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 34
2.1. NGUYấN LIU 34
2.1.1. Mu mỏu 34
2.1.2. Mi 34
2.1.3. Cỏc húa cht, nguyờn liu khỏc 35
2.1.4. Mỏy múc v thit b 36
2.2. PHNG PHP 36
2.2.1. Tỏch chit axit nucleic 36
2.2.1.1. Tỏch chit ADN bng MinElute Virus Spin Kit 36
2.2.1.2. Tỏch chit ADN bng kớt Dynabead Myone SILANE
đ
37
2.2.1.3 Tỏch chit ADN bng b kớt Virus Magnet Nano Kit 37
2.2.2. Nhõn bn on gen ớch c hiu bng k thut PCR 39
2.2.3. Nhõn dũng sn phm PCR vo vector pGEM-T easy 43
2.2.4. Tinh sch plasmid theo kớt ca Qiagen 44
2.2.5. Gii trỡnh trỡnh t gen ó c nhõn dũng 45
2.2.6. nh lng gen ớch bng k thut PCR ti thi im (Real-time PCR) 46
Chng 3: KT QU NGHIấN CU V THO LUN 48

bp base pair (cp baz)
C
t
Cycle of Threshold (Chu k ngng)
EA Early Antigen (Khỏng nguyờn sm)
EBNA Epstein Barr Virus nuclear (Khỏng nguyờn nhõn EBV)
EBV Epstein Barr Virus
EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic acid
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
(Xột nghim min dch liờn kt Enzyme)
Gp Glycoprotein
GuSCN Guanidine thiocyanate
IPTG Isopropyl -D-Thiogalactopyranoside
kb kilobase
LB Luria Bertani

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

4
LMP Latent Membral Protein (Protein mng tim tng)
PCR Polymerase chain reaction (Phn ng chui trựng hp)
VCA Virus capsid antigen (Khỏng nguyờn v capsid)
M U
Cụng ngh nano ngy nay ang cú nhng bc tin rt quan trng, c bit l
vt liu nano ngy cng c ng dng rng rói mi lnh vc. Mt trong nhng
hng i quan trng ca cụng ngh nano l ng dng ca nú trong Y sinh bao

nano do nhúm nghiờn cu thuc Trung tõm Khoa hc Vt liu ca Trng i hc
Khoa hc T nhiờn ch to v b m thớch hp (k tha kt qu ca nhúm nghiờn
cu phũng Sinh hc nano v ng dng) th nghim kh nng tỏch chit axit
nucleic ca virus Epstein Barr trong cỏc bnh phm ca bnh nhõn ghi nhim EBV.
EBV l virus truyn nhim trờn ngi, lõy truyn qua ng n ung, tip xỳc.
EBV liờn quan n nhiu bnh lý nghiờm trng nh: ung th vũm hng, Burkitt
lymphoma, ung th lymphoma v cỏc trng thỏi bin i t bo lympho [1]. ADN
tỏch chit bi b kớt Virus Magnet Nano Kit bao gm ht Magsi nano v b m
thớch hp s c s dng trong phn ng PCR v Real-time PCR phỏt hin v
nh lng nng EBV trong mỏu hay cỏc mu bnh phm nghi nhim, h tr
trong cụng tỏc chn oỏn, iu tr, tiờn lng cỏc bnh liờn quan n EBV.
Xut phỏt t thc t trờn chỳng tụi tin hnh: Nghiờn cu v th nghim ht t
nano c chc nng húa b mt trong chn oỏn Virus Epstein Barr vi cỏc
mc tiờu sau:
1. Xõy dng phng phỏp phỏt hin nh tớnh v nh lng EBV bng PCR
v Real-time PCR.

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

6
2. Nghiờn cu th nghim kh nng tỏch chit ADN ca EBV trong mu mỏu
bng b kớt t ch to (Virus Magnet Nano Kit) gm ht t nano c chc nng
húa b mt (c th l ht t nano c bc silica hay cũn ký hiu MagSi nano) v
b m kốm theo (k tha kt qu ca nhúm nghiờn cu thuc phũng Sinh hc
Nano v ng dng th nghim trờn i tng HBV, HCV).
3. So sỏnh kh nng tỏch chit ADN EBV bng k thut PCR, Real-time PCR
vi ngun ADN khuụn tỏch bng ba b kớt: MinElute
đ
Virus Spin Kit ca hóng

kớnh hin vi in t. õy l ln u ngi ta quan sỏt c cỏc th virus thuc h
Herpesviridae trong t bo ung th ngi, do ú EBV b nghi ng l nguyờn nhõn
gõy ung th ngi [1].

EBV thuc h virus Herpesviridae, cú h gen thuc loi ADN si ụi xon
kộp mch h, kớch thc h gen khong 184 kb nu tớnh c phn lp li hai u.
H gen EBV cú 6 t hp gen mó húa cho cỏc loi protein khỏng nguyờn nhõn
(Epstein Barr Virus nuclear antigen), c ký hiu l: EBNA-1, EBNA-2,
EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-LB v 3 gen mó húa cho protein mng
tim tng (latent membral protein), c ký hiu l: LMP-1, LMP-2A, LMP-2B
[13]. Vai trũ ca sỏu protein EBNA cú liờn quan n quỏ trỡnh nhõn lờn ca EBV
trong t bo lympho B giai on u xõm nhim cũn 3 loi protein LMP cú liờn
quan n chu k nhõn lờn ca EBV trong t bo lympho B.

Gen mó húa cho protein EBNA-2 l mt phõn on c bn trong gen EBNA
ca h gen EBV. EBNA -2 cú vai trũ bit húa t bo lympho B thnh t bo mm
non húa EBV thc hin quỏ trỡnh gõy ung th. Hn na gen EBNA-2 l gen
c sao chộp sm nht do vai trũ ca nú trong quỏ trỡnh iu tit s nhõn lờn ca t
bo b nhim. EBNA-2 iu hũa quỏ trỡnh sao chộp gen v tng hp protein ca c
virus v t bo b nhim EBV, protein EBNA-2 c coi l yu t quan trng trong
cm ng tng sinh dũng t bo lympho B [25]. Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

8
Ton b h gen EBV c cha trong mt v capsid. V capsid ny cú hỡnh
thỏi i xng hỡnh khi, ú l cu trỳc protein úng kớn bo v nhõn ADN ca virus
v mang tớnh khỏng nguyờn c hiu ca EBV (khỏng nguyờn VCA), c xỏc nh

Hỡnh 1.3: S hp ph ca EBV lờn t bo lympho B qua th th CR21 [46]

EBV trng thỏi tim tan, nhiu bn sao ADN ca EBV c tỡm thy trong
t bo cht ca nhng t bo lympho B b nhim nhng ch cú vi gen c sao
chộp. EBV cú th gõy nhim dng tim tan v tn ti lõu di trong c th m
khụng gõy bnh. Nhng trong nhng c th cú th trng h min dch suy yu thỡ
EBV cú th l nguyờn nhõn gõy bnh tng bch cu n nhõn nhim khun
(IM-infectious mononucleosis), liờn quan n c ch tin trin ca mt s loi ung
th nh tng lympho B, UTVMH, Burkitt lymphoma. c trng ca cỏc khi u
trong cỏc bnh ung th ny l trong cỏc t bo ca khi u cú cha mt lng ln
cỏc bn sao h gen EBV v xut hin s biu hin nhiu protein cú vai trũ chuyn
húa khi u t lnh tớnh thnh khi u ỏc tớnh [25].
V mt sinh bnh hc, s nhim virus xy ra u tiờn vựng ming, hu ri
lan vo mỏu, ti õy t bo lympho B b nhim. S ỏp ng min dch u tiờn
trong nhim EBV l c th sinh khỏng th IgM chng li khỏng nguyờn VCA ca
EBV, ỏp ng khỏng th IgM ch xut hin trong vi tun u sau khi nhim, tip
theo l khỏng th IgG v khỏng th IgG ny tn ti sui i ngi nhim [19]. EBV
thng gõy ra nhim trựng cp vựng ming hng, cú th hoc khụng biu hin
triu chng gỡ. Sau quỏ trỡnh nhim ú EBV tn ti tim tng trong cỏc t bo biu
Ngi ta a ra rt nhiu gi thit v nguyờn nhõn ca bnh ung th vũm hng.
Cỏc gi thit ny c tp trung thnh ba nhúm ch yu ú l: do EBV, do di truyn,

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

11
do cỏc yu t mụi trng, tp quỏn n ung, li sng, húa cht [34]. ó cú rt nhiu
cụng trỡnh nghiờn cu v mi liờn quan gia EBV v bnh ung th vũm mi hng, cỏc
nghiờn cu ny cho thy s biu l cỏc khỏng nguyờn virus trong cỏc giai on ca
bnh v vai trũ ca EBV trong phỏt sinh bnh [11, 17, 22, 23].

1.1.3. Quỏ trỡnh nhõn lờn, tng nhim v kh nng gõy ung th ca EBV
EBV sau khi nhim vo c th cú cỏc hng tin trin c minh ha hỡnh
1.4 gm hai trng hp:

UNG
TH
7
T bo
biu mụ
T bo B
khỏc
Nhõn lờn
2
1
4
5
3
6 8 Hỡnh 1.4: S minh ha quỏ trỡnh tin trin ca Epstein Barr Virus
trong c th ngi b nhim [45] Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

12
2. Gõy nhim trc tip vo t bo lympho B, cú tim nng cm ng bin i t
bo nhim tin trin gõy ung th ((2) (3) (4) (5) (6) (7) (8))
- i vi trng hp th nht, EBV tỡm thy s thớch ng trong t bo biu

ti ti trong c th ngi bnh sut i sau khi nhim nờn kt qu chn oỏn thng
khụng cú ý ngha do t l dng tớnh rt cao khụng phõn bit c ngi ó tng b
nhim trong quỏ kh ó khi bnh v ngi ang b nhim EBV [19]. Cỏc phng
phỏp min dch thng khụng em li hiu qu nhiu trong chn oỏn v h tr
iu tr cỏc bnh liờn quan n EBV.
Phng phỏp phỏt hin EBV bng PCR/ Real-time PCR vi chớnh xỏc, c
hiu v nhy cao cho phộp phỏt hin nh tớnh, nh lng s lng EBV trong
mỏu, cỏc mụ bnh phm ca ngi nhim h tr cho chn oỏn, iu tr, tiờn lng
cỏc bnh do tỏc nhõn EBV gõy ra [4, 26]. Trong khuụn kh ti cp nh nc v
nghiờn cu c im cu trỳc phõn t virus Epstein Barr Vit Nam v qui trỡnh
sn xut b sinh phm chn oỏn (KC.10.31/06-10) do TS. Nguyn ỡnh Phỳc
(Trng i hc Y H ni) ch trỡ ó bc u thnh cụng trong vic ch to b kớt
sinh hc phõn t chn oỏn EBV bng PCR nhõn bn c hiu on gen EBNA-1
cú kớch thc khong 0.8 kb. Tỏc gi Van Baarle Debbie v cs s dng nested PCR
nhõn bn c hiu on gen ENBA-2 kớch thc 250 bp nghiờn cu t l
nhim EBV trờn cỏc i tng b hi chng suy gim min dch HIV/AIDS [32].

1.2. NHNG KHI NIM C BN V HT NANO T V NG DNG
1.2.1. Ht nano t
Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

14
Hỡnh 1.5: Hỡnh nh TEM ca ht nano t Fe

nano khi s phỏt hin ca h thng min dch ca c th v to cỏc mi liờn kt
húa hc vi cỏc phõn t khỏc trong iu kin phự hp. Dung mụi l cht lng mang
ton b h.
1.2.2. Cỏc phng phỏp ch to ht nano t [3]
Cỏc ht nano t tớnh cú th c ch to theo cỏc phng phỏp thụng dng
di õy.

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

15
1.2.2.1. Phng phỏp nghin
Phng phỏp nghin c phỏt trin t rt sm ch to cht lng t dựng
cho cỏc ng dng vt lý nh truyn ng t mụi trng khụng khớ vo bung chõn
khụng, lm cht dn nhit trong cỏc loa cụng sut cao. Trong nhng nghiờn cu u
tiờn v cht lng t, vt liu t tớnh oxit st Fe
3
O
4
, c nghin cựng vi cht hot
húa b mt (acid Oleic) v dung mụi (du, hexane). Cht hot húa b mt giỳp cho
quỏ trỡnh nghin c d dng v ng thi trỏnh cỏc ht kt t vi nhau. Sau khi
nghin, sn phm phi tri qua mt quỏ trỡnh phõn tỏch ht rt phc tp cú c
cỏc ht tng i ng nht. Phng phỏp nghin cú u im l n gin v ch to
c vt liu vi khi lng ln. Vic thay i cht hot húa b mt v dung mụi
khụng nh hng nhiu n quỏ trỡnh ch to. Nhc im ca phng phỏp ny l
tớnh ng nht ca cỏc ht nano khụng cao vỡ khú cú th khng ch quỏ trỡnh hỡnh
thnh ht nano. Cht lng t ch to bng phng phỏp ny thng c dựng cho
cỏc ng dng vt lý.
1.2.2.2. Phng phỏp ng kt ta

húa hc to cỏc cht mong mun s xy ra khi ta hũa trn cỏc h vi nh tng ny
li vi nhau. Cú 2 cỏch cỏc phõn t cht phn ng gp nhau:
Cỏch th nht: Cỏc phõn t cht phn ng thm qua lp mng cht hot húa b
mt ra ngoi v gp nhau. Nhng thc t thỡ t l sn phm to thnh theo cỏch ny
l rt nh, khụng ỏng k.
Cỏch th hai: Khi cỏc ht vi nh tng ca cỏc cht phn ng gp nhau, nu

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

17
cú lc tỏc ng thỡ 2 ht nh (A, B) cú th to thnh mt ht ln hn (C). Cỏc
cht phn ng trong 2 ht nh s hũa trn, phn ng xy ra trong lũng ht ln v sn
phm mong mun c to thnh ( õy l cỏc ht nano t Fe
3
O
4
). Cỏc ht nano t
Fe
3
O
4
sau khi to thnh s b cht hot húa b mt bao ph v ngn cn khụng cho
phỏt trin thờm v kớch thc. Hỡnh 1.7: C ch hot ng ca phng phỏp vi nh tng.

Cng bng phng phỏp ny, ngi ta cú th ch to ht oxớt st bao ph bi
mt lp vng trỏnh oxy húa v tng tớnh tng hp sinh hc.

mt v trớ no ú trờn b mt t bo hoc phõn t m cũn giỳp cho cỏc ht nano
phõn tỏn tt trong dung mụi, tng tớnh n nh ca cht lng t. Ging nh trong h
min dch, v trớ liờn kt c bit trờn b mt t bo s c cỏc khỏng th hoc cỏc
phõn t khỏc nh cỏc hormone, axớt folic tỡm thy. Cỏc khỏng th s liờn kt vi cỏc
khỏng nguyờn. õy l cỏch rt hiu qu v chớnh xỏc ỏnh du t bo. Cỏc ht t
tớnh c bao ph bi cỏc cht hot húa tng t cỏc phõn t trong h min dch
nờn cú th to ra cỏc liờn kt vi cỏc t bo hng cu, t bo ung th phi, vi khun,

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

19
t bo ung th ng tit niu v th golgi [28]. i vi cỏc t bo ln, kớch thc
ca cỏc ht t tớnh ụi lỳc cng cn phi ln, cú th t kớch thc vi trm nano
một. Quỏ trỡnh phõn tỏch c thc hin nh mt gradient t trng ngoi. T
trng ngoi to mt lc hỳt cỏc ht t tớnh cú mang cỏc t bo c ỏnh du. Cỏc
t bo khụng c ỏnh du s khụng c gi li v thoỏt ra ngoi.

Hỡnh 1.8: Nguyờn tc chn lc v phõn tỏch t bo bng t trng
(a) Nam chõm c t bờn ngoi hỳt cỏc t bo ó c ỏnh du v loi
b cỏc t bo khụng c ỏnh du; (b) Nam chõm cú th t vo mt dũng chy cú
cha t bo cn tỏch
Tỏch t bo bng t trng ó c ng dng thnh cụng trong Y-Sinh hc.
õy l mt trong nhng phng phỏp rt nhy cú th tỏch t bo ung th t mỏu,
c bit l khi nng t bo ung th rt thp, khú cú th tỡm thy bng cỏc phng
phỏp khỏc. Ngi ta cú th phỏt hin kớ sinh trựng st rột trong mỏu bng cỏch o t

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011


thng dựng iu tr cỏc khi u ung th). Nhng ng dng ny c gi l dn
truyn thuc bng ht nano t tớnh. Cú hai li ớch c bn l: (i) thu hp phm vi
phõn b ca cỏc thuc trong c th nờn lm gim tỏc dng ph ca thuc; (ii) gim
lng thuc iu tr.
Ht nano t tớnh cú tớnh tng hp sinh hc c gn kt vi thuc iu tr.
Lỳc ny ht nano cú tỏc dng nh mt ht mang. Thụng thng phc h ht
nano-thuc to ra mt cht lng t v i vo c th thụng qua h tun hon. Khi cỏc
ht i vo mch mỏu, ngi ta dựng mt gradient t trng ngoi rt mnh tp
trung cỏc ht vo mt v trớ nht nh trờn c th. Mt khi phc h ht nano-thuc
c tp trung ti v trớ cn thit thỡ quỏ trỡnh nh thuc cú th din ra thụng qua c
ch hot ng ca cỏc enzyme hoc cỏc tớnh cht sinh lý hc do cỏc t bo ung th
gõy ra nh pH, quỏ trỡnh khuych tỏn hoc s thay i ca nhit .
Quỏ trỡnh vt lý din ra trong vic dn truyn thuc cng tng t nh trong
phõn tỏch t bo. Gradient t trng s giỳp tp trung phc h ht nano-thuc. Hiu
qu ca vic dn truyn thuc ph thuc vo cng t trng, gradient t trng,
th tớch v tớnh cht t ca ht nano. Cỏc cht mang (cht lng t) thng i vo
cỏc tnh mnh hoc ng mch nờn cỏc thụng s thy lc nh thụng lng mỏu,
nng cht lng t, thi gian tun hon úng vai trũ quan trng nh cỏc thng s
sinh lý hc nh khong cỏch t v trớ ca thuc n ngun t trng, mc liờn

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

22
kt gia ht nano vi cỏc phõn t thuc v th tớch ca khi u. Cỏc ht cú kớch
thc micromet hot ng hiu qu hn trong h thng tun hon c bit l cỏc
mch mỏu ln v cỏc ng mch. Quỏ trỡnh dn thuc bng ht nano t tớnh cú hiu
qu nhng vựng mỏu chy chm v gn ngun t trng.
Cỏc ht nano t tớnh thng dựng l ụxớt st bao ph xung quanh bi mt hp
cht cao phõn t cú tớnh tng hp sinh hc nh PVA, dextran hoc silica. Cht bao

n k thut ny nhng cha cú cụng b no thnh cụng trờn ngi. Khú khn ch
yu ú l vic dn truyn lng ht nano t phự hp to ra nhit lng khi cú
s cú mt ca t trng ngoi mnh trong phm vi iu tr cho phộp [28].
1.2.3.4. Tng tng phn cho nh cng hng t
Cỏc ht nano siờu thun t c to thnh t oxit st thng c s dng
nh cỏc tỏc nhõn lm tng tng phn nh trong chp cng hng t. S cú mt
ca chỳng lm nhiu loi t trng a phng nờn lm thay i giỏ tr t trng i
rt nhiu. Da trờn c tớnh ca tng mụ trong c th m hp th ht nano mnh
hay yu. Vớ d, ht nano cú kớch thc 30nm c bc dextran cú th nhanh chúng
i vo gan v lỏch trong khi cỏc c quan khỏc thỡ chm hn. Nh vy, mt ht
nano cỏc c quan l khỏc nhau dn n s nhiu loi t trng a phng cng
khỏc nhau lm tng tng phn trong nh cng hng t.
1.3. VAI TRề CA VIC TINH SCH AXIT NUCLEIC

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

24
Axớt nucleic cú vai trũ quan trng, trung tõm ca sinh hc thc nghim. Hu
ht cỏc nghiờn cu, cỏc ng dng ca sinh hc phõn t u cn vic tinh sch v
lm giu c axớt nucleic.
Cỏc ng dng quan trng ú cú th c k n nh chn oỏn v nh
lng tỏc nhõn vi sinh vt gõy bnh trong cỏc mu bnh phm bng phng phỏp
PCR hay Real-time PCR, xỏc nh quan h huyt thng, truy tỡm ti phm v
nghiờn cu gen.
Trong ú, tin hnh phỏt hin hay nh lng tỏc nhõn vi sinh vt gõy
bnh trong cỏc mu bnh phm bng phng phỏp PCR hay Real-time PCR thỡ u
cn ngun axớt nucleic tinh sch. Do ú quỏ trỡnh tinh sch acid nucleic l rt quan
trng do quỏ trỡnh ny cung cp nguyờn liu cho phn ng PCR, Real-PCR xỏc nh
tỏc nhõn gõy bnh. Tựy thuc vo tng tỏc nhõn vi sinh vt, axớt nucleic ớch l