BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LÊ QUANG KHÔI

KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NHÓM
VI KHUẨN TÍCH LŨY POLY-PHOSPHATE TRONG
CHẤT THẢI CHĂN NUÔI HEO VÀ CÁ TRA Ở
VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ
ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƢỚC AO CÁ TRA

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62 42 01 07
Cần Thơ, 2015
1

CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của luận án
Ngành chăn nuôi heo và cá tra ở ĐBSCL đã và đang phát triển
theo hướng tập trung và kết quả của xu thế đổi mới là làm tăng
cường hiệu quả sản xuất trên một đơn vị lao động và đất đai. Bên
cạnh sự phát triển đó là những nguy cơ ảnh hưởng đến môi trường
sống. Các nguồn gây ô nhiễm chủ yếu là chất thải bài tiết của cá và
heo, thức ăn tồn đọng… Thành phần các chất gây ô nhiễm chủ yếu là
protein, lipid, acid béo, phospholipid, carbohydrate, hàm lượng nitơ,
chất khoáng… (Lê Văn Cát, 2007). Thông qua quá trình phân hủy
của vi sinh vật, lượng thức ăn dư thừa và chất thải sẽ chuyển thành
các dạng Nitơ (N) và phốt-pho (P) vô cơ. Hàm lượng N và P hòa tan
cao trong môi trường nước sẽ kích thích mạnh mẽ khả năng tăng sinh
khối của thủy sinh vật như tảo và vi khuẩn lam là nhân tố chủ yếu
gây ra hiện tượng phú dưỡng hóa và tiến trình phân hủy tảo sẽ làm
cho môi trường nước bị ô nhiễm, thiếu oxy cung cấp cho hoạt động
hô hấp của cá, cá sẽ suy yếu và dễ nhiễm bệnh.
Để xử l‎ý P hòa tan, một số biện pháp được sử dụng là xử lý
hóa học và sinh học. Trong biện pháp xử lý bằng sinh học, nhóm vi
khuẩn có khả năng hấp thu và tồn trữ P nội bào giữ vai trò quan
trọng và chúng được xem như là vi khuẩn tích lũy poly-phosphate
(Poly-phosphate Accumulating Bacteria-PAB). Loại bỏ P hoà tan
dạng PO
4
3-
thông qua hoạt động vi khuẩn ngày càng được ứng dụng
bởi vì các đặc tính hữu dụng của chúng là dễ ứng dụng, hiệu quả về
mặt kinh tế và thân thiện với môi trường sống (Mino et al., 1998).

có khả năng tích lũy poly-P cao làm cơ sở cho việc đánh giá tính đa
dạng di truyền và chọn lọc các dòng vi khuẩn có hiệu suất loại bỏ P
hoà tan cao để ứng dụng xử lý phosphate trong nước ao cá tra.
‎Ứng dụng các kỹ thuật sinh học sinh tử hiện đại (thực hiện
trên gen 16S rRNA và gen ppk 1) và kết hợp phương pháp truyền
thống để định danh vi khuẩn cho thấy 48 loài vi khuẩn tích lũy poly-
P phân lập được thuộc 5 lớp Bacilli, Actinobacteria, Alpha-
proteobacteria, Beta-proteobacteria và Gamma-proteobacteria. Kết
quả chụp TEM và PCR cho thấy rằng các dòng vi khuẩn này có gen
đồng hóa phosphate thành dạng hạt poly-phosphate nội bào.
Các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập có sự phong phú
loài và sự đa dạng nucleotide. Phân tích các chỉ số đa dạng di truyền
cho thấy tính đa hình (=0,11) và sự đa dạng nucleotide (Pi=0,16)
vùng 16S rRNA của nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P tương đối cao.
Sự biến thiên các chỉ số  và Pi tạo nên các dạng haplotype khác
nhau, có 25 haplotype (kiểu gen) được tạo ra từ 48 trình tự
nucleotide. Sự khác nhau về cấu trúc của các haplotype tạo nên sự đa
dạng cao giữa chúng (Hd=0,91). Điều này làm xuất hiện nhiều kiểu
gen có tính biến dị di truyền và khả năng thích nghi với môi trường
sống trong quá trình tiến hóa của các dòng vi khuẩn có khả năng tích
lũy poly-P. Đây là cơ sở khoa học trong việc lựa chọn nguồn mẫu để
phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P có khả
năng thích nghi cao với môi trường.
Đề tài đã tuyển chọn được các dòng vi khuẩn có hiệu suất loại
bỏ phốt-pho hòa tan cao. Đặc biệt là hai 2 dòng vi khuẩn 3

Acinetobacter radioresistens TGT013L và Kurthia sp. TGT025L cho

succinate (0,5 g/L), NH
4
Cl (0,02 g/L), KH
2
PO
4
(0,088 g/L), pepton
(0,5 g/L), MgSO
4
.7H
2
O (0,01 g/L), CaCl
2
(0,005 g/L), agar (20 g/L).
Khoáng vi lượng (0,5 mL/L) (Smolders et al., 1994).
Môi trường cấy chuyền: NH
4
Cl (0,02 g/L), KH
2
PO
4
(0,088
g/L), pepton (0,5 g/L), MgSO
4
.7H
2
O (0,01 g/L), CaCl
2
(0,005 g/L),
agar (20 g/L). Khoáng vi lượng (0,5 mL/L) (Smolders et al., 1994).

cho đến khi khuẩn lạc rời, đồng nhất và đều nhau. Chọn một khuẩn
lạc riêng biệt cấy chuyền vào môi trường phân lập trong ống thạch
nghiêng ủ 30
0
C, 4 ngày sau đó trữ trong ủ lạnh (10
0
C) để kiểm tra độ
ròng dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400 lần).
3.2.2 Định tính và định lƣợng poly-P nội bào
3.2.2.1 Định tính
Quan sát sự hiện diện hạt poly-P nội bào thông qua chụp TEM.
Dịch huyền phù tế bào được xử l‎ý theo Boswell et al., (2001). Mẫu
được xem dưới kính hiển vi điện tử (JEOL 1400-Nhật) ở điện thế gia
tốc 100 kV tại trường Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh.
3.2.2.2 Định lƣợng
Xác định hàm lượng poly-P theo Eixler et al., (2005) và
Buzoleva et al., (2006).
3.2.3 Nhận diện gen poly-phosphate kinase 1
Cặp mồi 5’-GACGAAGAAGCGGTCAAG-3’, 5’-AACGGTCA
TCTTGATGGC-3’; 5’- AGTTCAATCTCACCGAGAGC-3’,5’-GGAA
CTTCAGGTCGTTGC-3’; 5’-GATACCCAGTTCCTGCTCG-3’, 5’-
CGGCACGAACTTCAGATCG - 3’ và 5’- TCACCACCGACGGCAA
GAC-3’, 5‘-CCGGCATGACTTCGCGGAAG-3’ được sử dụng
khuếch đại gen ppk 1. Phản ứng PCR thực hiện theo He et al.,
(2007).
3.2.4 Định danh vi khuẩn tích lũy poly-P
Ly trích DNA thực hiện theo Carr et al., (2001). Cặp mồi 27F
và 1492R (Lane et al., 1991) được sử dụng khuếch đại 16S rRNA.
Phản ứng PCR thực hiện theo Ivanov et al., (2005). Sản phẩm PCR
được tinh sạch với bộ kít Qiagen PCR. Trình tự 16S rRNA được xác

, trong đó m là chiều dài đoạn trình tự DNA
Trị số trung bình và sự biến thiên số SNP trong n trình tự
DNA được tính theo công thức Hall (1999).

Trong đó S là số SNPs, n số trình tự DNA trong quần thể và m
là chiều dài DNA (bp).
n
2 6

Kiểm định sự chênh lệch giữa chỉ số Theta () và Pi (Tajima,
1993) theo công thức:

Trong nghiên cứu này, các chỉ số k, , Pi (Watterson, 1975;
Tajima, 1993; Hall,1999) và haplotype được xác định bằng phần
mềm DNASP 5.10 (Rozas et al., 2003).
3.2.5.2 Phân tích sự đa dạng loài
Chỉ số đa dạng sinh học loài H′ (Shannon and Weiner’s index,
1963) được tính theo công thức (Richard, 2005).
s
H
′
= - ∑ P
i
* ln(P
i
), trong đó:
i=1


7

CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Phân lập và xác định đặc điểm sinh học của vi khuẩn
4.1.1 Kết quả phân lập
Kết quả phân lập được 439 dòng vi khuẩn từ 261 mẫu chất thải
chăn nuôi heo và ao nuôi cá tra thuộc 13 tỉnh ĐBSCL. Kết quả kiểm
tra hàm lượng poly-P nội bào có 391/439 dòng vi khuẩn phân lập có
khả năng tích lũy poly-P với hàm lượng từ 0-19,5 mg/L (chiếm
89,1%). Chỉ có 48/439 dòng vi khuẩn phân lập có hàm lượng poly-P
tích lũy nội bào từ 19,6-149,5 mg/L (trong đó có 29/439 dòng tích
lũy từ 19,6-50 mg/L, 14/439 dòng có hàm lượng từ 50-100 mg/L và
5 dòng tích lũy từ 100-149,5 mg/L). Các dòng này được tuyển chọn
cho nghiên cứu về các đặc tính sinh học của vi khuẩn tích lũy poly-P.
4.1.2 Đặc điểm sinh học các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P
Kết quả nhuộm Gram cho thấy đa số vi khuẩn tích lũy poly-P
có dạng Gram dương (37/48 dòng chiếm 77,1%), còn lại Gram âm
(5/48 dòng chiếm 22,9%).
Hình dạng tế bào các dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-
P có dạng que với nhiều trạng thái khác nhau như que chuyển động
có kích thước từ 0,3-1,3 m; que thẳng hoặc hơi cong chuyển động
có kích thước từ 0,6-1,3 m; que ngắn có kích thước từ 0,4-0,9 m
chuyển động; que thẳng hoặc hơi cong không chuyển động; que đơn
hoặc dính cặp (Hình 4.3).

Hình 4.3: Hình dạng
và kích thước các
dòng vi khuẩn phân
lập

với kích thước khác nhau. Bìa
khuẩn lạc có dạng nguyên đều
hoặc không đều. Một số khuẩn lạc
có bề mặt nhày hoặc ẩm ướt. Chi
tiết hình dạng khuẩn lạc của 22
dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải
ao nuôi cá tra và 26 từ chất thải
chăn nuôi heo được minh họa
trong Hình 4.4 và Hình 4.5.
Để nghiên cứu mối liên quan giữa các đặc điểm về hình dạng
và cấu trúc các hạt poly-P nội bào, các dòng vi khuẩn được xác định
thông qua chụp TEM. Chụp TEM được thực hiện theo Boswell et al. 9

(2001). Mẫu được xem dưới kính hiển vi điện tử (JEOL 1400-Nhật)
tại trường Đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh. Hình 4.7: Hình dạng và cấu trúc
bên trong các dòng vi khuẩn phân
lập trong chất thải chăn nuôi heo
Ghi chú: Ảnh chụp TEM. (E)
AGH006L (x10,000), (F) CMH002L
(X10,000), (G1+G2) CMH012L
X10,000) và (H1) BTH014L
(X30,000), (H2) BTH014L (X40,000)
Các dòng vi khuẩn khác
nhau thể hiện sự khác biệt nhau

[Hình 4.6 (D1)], bên trong có sự hiện diện các hạt sậm màu đen. Các
hình này cũng thể hiện sự tương quan giữa hàm lượng poly-P (Bảng
4.7) được xác định thông qua phương pháp định lượng bằng phương
pháp ly trích của Eixler et al., (2005) và số lượng, kích thước hạt
poly-P thông qua chụp TEM theo phương pháp của Boswell et al.
(2001). Bên cạnh đó, dưới kính hiển vi điện tử truyền quét cho thấy
các hạt poly-P hiện diện ở các vị trí khác nhau trong tế bào tuỳ thuộc
vào từng dòng vi khuẩn.
Phương pháp định tính theo Boswell et al. (2001) cho thấy
được kích thước và sự hiện diện các hạt poly-P nội bào. Tuy nhiên,
phương pháp này không xác định được hàm lượng poly-P nội bào.
Chính vì thế, việc kết hợp giữa định tính và định lượng sẽ xác định
cụ thể khả năng và hàm lượng poly-P nội bào của các dòng vi khuẩn
phân lập. Hạt poly-P nội bào của 48 dòng vi khuẩn phân lập được ly
trích thông qua phương pháp của Eixler et al., ( 2005) và Buzoleva et
al., (2006), kết quả được trình bày trong Bảng 4.7 và 4.8.
Bảng 4.7 cho thấy 22 dòng vi khuẩn phân lập được trong chất
thải ao nuôi cá tra có tiềm năng tích poly-P cao. Khả năng tích lũy có
sự khác biệt lớn, dao động từ 19,6-148,1 mg/L. Bên cạnh đó, mật số
của các dòng này khác nhau khi nhân sinh khối (dao động từ 10
7
đến
10
9
CFU/mL). Do đó hàm lượng poly-P nội bào tuỳ thuộc vào mật số
vi khuẩn trong dịch nuôi, khả năng hấp thu phosphate và đồng hoá
chúng thành poly-P. Khả năng tích lũy poly-P nội bào của từng dòng
dao động từ 2,90x10
-12
mg/tế bào (dòng DTT021L) đến 4,36x10

-10
BTT003L
39,1
1,43x10
9
2,73x10
-11
BTT006L
76,1
1,63x10
8
4,66x10
-10
CTT002L
53,1
1,50x10
8
3,54x10
-10
CTT004L
87,1
2,00x10
7
4,36x10
-9
DTT001L
36,5
1,50x10
9
2,43x10

-10
KGT005L
73,4
1,70x10
9
4,32x10
-11
STT009L
28,9
8,67x10
8
3,33x10
-11
STT011L
32,4
1,33x10
8
2,43x10
-10
TGT013L
148,1
1,63x10
9
9,07x10
-11
TGT018L
25,5
8,50x10
7
3,00x10

-10
Tương tự, kết quả kiểm tra hàm lượng poly-P nội bào của 26
dòng vi khuẩn phân lập được trong chất thải chăn nuôi heo (Bảng
4.8) có khả năng tích lũy poly-P từ 1,58x10
-12
mg/tế bào (dòng
VLT013L) đến 2,3x10
-9
mg/tế bào (dòng CTH020L).
So sánh khả năng hấp thu phosphate với các dòng trong
nghiên cứu của Sidat et al., (1999) như Acinetobacter calcoaceticus
(1,84x10
-10
mg/tế bào), Bacillus cereus (3,19x10
-11
mg/tế bào) và A.
calcoaceticus ATCC (3,43x10
-11
mg/tế bào) cho thấy rằng 48 dòng vi
khuẩn phân lập và tuyển chọn được xem là các vi khuẩn có khả năng
tích lũy poly-P với hàm lượng cao và là các đại diện của PAB hiện
diện trong chất thải ao nuôi cá tra và chăn nuôi heo ở ĐBSCL. Trong
đó, dòng CTT004L, CTH008L, CTH020L và TGH001L cho thấy có
khả năng tích lũy poly-P nội bào cao (10
-9
mg/tế bào) nhưng khả
năng tăng sinh khối thấp (10
7
CFU/mL).


-10
BLH006L
149,1
6,80x10
8
2,19x10
-10
BTH008L
30,5
1,53x10
8
1,99x10
-10
BTH014L
28,7
8,5x10
7
3,38x10
-10
CMH002L
44,3
1,62x10
8
2,74x10
-10
CMH012L
148,1
9,35x10
9
1,58x10

-11
KGH007L
87,1
5,95x10
8
1,46x10
-10
KGH008L
35,4
8,50x10
9
4,16x10
-12
LAH002L
148,4
1,02x10
9
1,45x10
-10
LAH003L
92,3
1,11x10
8
8,35x10
-10
STH008L
30,2
6,80x10
8
4,44x10

-10
TVH003L
22,5
2,55x10
7
8,82x10
-10
VLH002L
25,8
7,65x10
9
3,37x10
-12
VLH013L
25,5
1,62x10
10
1,58x10
-12
Dòng tham khảo
PO
4
3-
hấp thu
(mg/L)
Mật số
(CFU/mL)
PO
4
3-

dụng cặp mồi tổng 27F và 1492R (Lane et al., 1991) để nhận diện vi
khuẩn. Các dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P cao được sử
dụng để nhận diện gen tích lũy poly-P. Phổ điện di sản phẩm PCR
được nhân lên từ gen 16S rRNA và gen pkk 1 của 48 dòng vi khuẩn
tích lũy poly-P được trình bày ở các Hình 4.12 và 4.14.

Hình 4.12: Phổ điện di (5) sản phẩm PCR
(a) của gen 16S rRNA (b) gen PPK1 trên
gel agarose 1,2 % của 5 dòng vi khuẩn
tích lũy poly-P [(3) TGT025L, (4)
BTT006L, (5) TGT013L, (6) AGH006L
và (7) VLH013L] có băng tương ứng ở vị
trí 1,500 bp và gen ppk 1 hai dòng (10)
TGT013L và (11) TGT025L có băng
tương ứng vị trí 105 bp so với thang
chuẩn DNA 100 bp ladder marker (1); (2,
9) đối chứng âm

Hình 4.14: Phổ điện di sản phẩm
PCR của gen PPK1 trên gel
agarose 1,2 % của 5 dòng vi
khuẩn tích lũy poly-P [(3)
STT011L, (4) BTT003L, (5)
CTH010L, (6) DTT021L và (7)
VLH002L) có băng tương ứng ở
vị trí 207 bp so với thanh chuẩn
DNA 100 bp ladder marker (L);
(1) đối chứng âm.
Sản phẩm PCR gen 16S rRNA của 48 dòng vi khuẩn tích lũy
poly-P, sau khi kiểm tra bằng kỹ thuật điện di được gửi giải trình tự

Bacilli
Bacillaceae
DTT021L
Bacillus megaterium (JQ229803)
99
1249
DTT001L
Bacillus megaterium (JQ229803)
99
1227
BTT003L
Bacillus megaterium (DQ365564)
97
923
AGT005L
Bacillus megaterium (FJ976535)
99
1274
STT009L
Bacillus megaterium (FJ976535)
98
1304
VLT003L
Bacillus aryabhattai (HQ908708)
98
1344
STT011L
Bacillus aryabhattai (JN084155)
99
1248

1226
VLT002L
Arthrobacter protophormiae (AB210984)
98
1366
Mycobacteriaceae
TGT018L
Mycobacterium phocaicum (EF551407)
98
1053
Gordoniaceae
HGT018L
Gordonia polyisoprenivorans (DQ154925)
98
1155
Gamma-proteobacteria
Moraxellaceae
TGT013L
Acinetobacter radioresistens (GU145275)
99
1277
CTT004L
Acinetobacter sp. (AJ633641)
98
1268
Xanthomonadaceae
KGT005L
Stenotrophomonas maltophilia (AJ295671)
99
784

Bacillus aryabhattai (HQ908708)
99
1017
DTH004L
Bacillus aryabhattai (JN084155)
99
1254
STH008L
Bacillus aryabhattai (JN084155)
99
1273
KGH007L
Bacillus aryabhattai (JN128236)
99
1315
VLH002L
Bacillus barbaricus (JN700207)
99
845
TGH003L
Bacillus cereus (JN676164)
99
1250
TVH003L
Bacillus cereus (JX544748)
99
1119
BTH014L
Bacillus megaterium (GU257960)
99

1363
CTH008L
Rhodococcus sp. (HM004214)
99
1384
CTH015L
Rhodococcus sp. (GU357742)
98
1151
LAH002L
Rhodococcus pyridinivorans (JQ229777)
98
1243
Corynebacteriaceae
AGH006L
Corynebacterium sp. (JX290304)
98
1069
Gamma-proteobacteria
Moraxellaceae
CMH012L
Acinetobacter sp. (AJ633641)
98
1269
Alpha-proteobacteria
Hyphomicrobiaceae
BTH008L
Xanthobacter flavus (AB680656)
99
1130

yếu thuộc hai dạng là IIA và IIC; khả năng tích lũy poly-P nội bào
với hàm lượng từ 10
-9
đến 10
-12
mg/tế bào. Thành phần giống loài rất
đa dạng thuộc nhiều lớp vi khuẩn khác nhau như Bacilli,
Actinobacteria, Gramma-proteobacteria, Beta-proteobacteria, Alpha-
proteobacteria. Bên cạnh đó, thành phần và số lượng loài vi khuẩn
tích lũy poly-P cao có sự khác nhau giữa địa điểm thu mẫu là chất
thải trại chăn nuôi heo và ao nuôi cá tra.
4.2.3 Phân tích sự đa dạng di truyền PAB
Đánh giá sự đa dạng di truyền thông qua phân tích các chỉ số
đa dạng nucleotide và chỉ số đa dạng loài Shannon. Việc sử dụng các
trình tự gen 16S rRNA để nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và là
dấu hiệu (marker) di truyền được sử dụng rộng rãi nhất (Janda và
Abbott, 2007). Phân tích tính đa hình và sự đa dạng nucleotide trên
vùng gen 16S rRNA bằng phần mềm DNASP 5.10 (Rozas et al.,
2003) kết hợp với chương trình BioEdit (Hall, 1999) kết quả được
trình bày trong Bảng 4.11.
Bảng 4.11: Đa dạng nucleotide vùng gen 16S rRNA 48 dòng vi khuẩn
Chỉ số
Giá trị
Số trình tự 16S rRNA
48
Đoạn nucleotide phân tích
1-988
Số vị trí nucleotide bắt cặp
716
Số vị trí đa hình nucleotide và tỉ lệ (%) so với chiều dài DNA

của 48 dòng vi khuẩn của 48 dòng vi khuẩn
Sự biến thiên dấu SNP dẫn đến sự biến đổi chỉ số đa dạng Pi
(Hình 2.23). Bảng 4.11 cho thấy trung bình sự khác biệt nucleotide,
k=116,60 với chỉ số đa dạng trung bình Pi=0,16 và có sự biến động
lớn từ vị trí 100 đến 816 (Hình 4.23). Đoạn có đa dạng nucleotide
cao nhất Pi=0,3 nằm trong khoảng từ 112 đến 236 và đoạn có đa
dạng nucleotide thấp nhất Pi=0,07 nằm trong khoảng 277 đến 377.
Kết quả kiểm định Tajima’s D có chỉ số D= - 0,41. Điều này
cho thấy cấu trúc quần thể vi khuẩn tích lũy poly-P trong chất thải
chăn nuôi heo và ao nuôi cá tra ở khu vực ĐBSCL có sự phong phú
về loài nhưng mức độ tương đồng của gen ở một số loài thì cao và
tần số xuất hiện các đột biến nucleotide mới giữa các gen trong quần
thể thấp.
Dựa trên kiểu nhóm dấu SNPs để xác định các dạng haplotype
bằng phần mềm DNASP 5.10 (Rozas et al., 2003). Kết quả phân tích
có tổng cộng 25 haplotype khác nhau được tạo ra từ 48 trình tự
nucleotide. Phân tích sự đa dạng của 25 dạng haplotype được tạo ra
từ 48 trình tự DNA cho thấy chúng có sự đa dạng cao (Hd=0,9, Bảng
816
100
Vị trí
đa hình cao
(a)
816
100
Vị trí
đa dạng cao
(b)
115,48
Số vị trí nucleotide khác biệt (số SNPs)
106,16
80,71
Pi (π)
0,18
0,16
Theta ()
0,14
0,11
Tajima’s D
- 0,59
- 0,02
So sánh tính đa hình và sự đa dạng nucleotide của gen 16S
rRNA giữa 2 nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập ở hai địa điểm
lấy mẫu, kết quả trình bày trong Bảng 4.12.
Ao nuôi cá tra
Trại chăn nuôi heo
22 trình tự gen 16S rRNA có số
vị trí đa hình/chiều dài trình tự
gen là 387/766 (chiếm 50,5%).

Hình 4.27: Sự biến thiên chỉ số 
trong vùng có vị trí từ 100 đến 866
Hình 4.27 cho thấy trị số trung
bình =0,14 và có sự biến thiên
tương đối cao ở đoạn trình tự từ
vị trí 100 đến 866. Đoạn
nucleotide từ 119 đến 229 có
26 trình tự gen 16S rRNA có số

Đoạn có đa dạng nucleotide cao
nhất Pi=0,32 nằm trong khoảng
từ 119 đến 229 và đoạn có đa
dạng nucleotide thấp nhất
Pi=0,08 nằm trong khoảng 270
đến 369.

Hình 4.29: Sự biến thiên chỉ số Pi
trong vùng có vị trí từ 100 đế 866
Kết quả phân tích có tổng cộng
16 haplotype khác nhau được tạo
ra từ 22 trình tự nucleotide. Phân
tích sự đa dạng của 16 dạng
haplotype cho thấy chúng có sự
đa hình và đa dạng cao
[Hd=0,91. Điều này cho thấy
quần thể vi khuẩn tích lũy poly-P
phân lập từ chất thải ao nuôi cá
tra có sự đa dạng haplotype (đa
dạng gen) cao.
đa hình cao nhất =0,28 và đoạn
271 đến 371 có tính đa hình thấp
nhất =0,072.
Trung bình sự khác biệt k=115,48
với chỉ số Pi=0,16 và có sự biến
động lớn trong chuổi trình tự từ vị
trí 100 đến 829 (Hình 4.30). Đoạn
có đa dạng nucleotide cao nhất
Pi=0,28 nằm trong khoảng từ 108
đến 230 và đoạn có đa dạng

So sánh tính đa dạng loài giữa hai quần thể vi khuẩn tích lũy
poly-P được phân lập từ hai địa điểm thu mẫu là chất thải chăn nuôi
heo và ao nuôi cá tra (Bảng 4.13) cho thấy tổng số dòng vi khuẩn
phân lập có khả năng tích lũy poly-P cao thì khác nhau ở hai địa
điểm lấy mẫu nhưng chỉ số đa dạng (H
′
) giống nhau.
Bảng 4.13: Chỉ số H
′
và J
′
của 2 quần thể vi khuẩn tích lũy poly-P trong
nước ao nuôi cá tra và chất thải trại chăn nuôi heo
Địa điểm thu mẫu
Tổng số dòng vi khuẩn
H
′

J
′

Ao nuôi cá tra
22
1,07
0,933
Chất thải trại nuôi heo
26
1,07
0,928
Chỉ số đa dạng loài (H

sóng 600nm. Thông qua sự xác định mật số tế bào [CFU/mL-Hoben
và Somasegaran (1982)], phương trình tuyến tính giữa chỉ số OD.600
nm và mật số vi khuẩn (CFU) được thiết lập, làm cơ sở để tính toán
mật số vi khuẩn dựa trên chỉ số OD.600 nm [Hình 4.3 (f)]. 21

Bảng 4.14: Hiệu suất loại bỏ phosphate trong môi trường của 6 dòng vi
khuẩn
Tên dòng
Hàm lượng PO
4
3-

ban đầu mg/L
Hàm lượng PO
4
3-
còn
lại 36 giờ (mg/L)
Hiệu suất bỏ (%)
TGT025L
19,8
4,6
76,6
VLH013L
19,1
8,2
57,3

Ghi chú: (a) dòng TGT025L, (b) dòng AGH006L, (c) dòng TGT013L, (d)
dòng BTT006L, (e) dòng VLH013L và (f) trương quan giữa chỉ số OD.600
nm và mật số vi khuẩn dòng TGT025L
(f) 22

Trong 10 giờ đầu 3 dòng TGT013L, TGT025L và AGH006L
tăng sinh nhanh nhất (OD.600 nm>0,4; tương đương mật số>10
6
CFU/mL) và khác biệt (P<0,01) với 2 dòng BTT006L và VLH013L
(OD.60nm>0,2; tương đương mật số>10
4
CFU/mL). Sự tăng nhanh
sinh khối của 3 dòng TGT013L, TGT025L và AGH006L kéo theo
hàm lượng phosphate còn lại trong môi trường thấp (hàm lượng
PO
4
3-
<14 mg/L) và có sự khác biệt (P<0,001) với 2 dòng BTT006L
và VLH013L (hàm lượng PO
4
3-
>15 mg/L) [Hình 4.33 (a), (b), (c),
(d), (e)]. Sau 10 giờ TGT013L, TGT025L dòng đều có xu hướng tiếp
tục tăng sinh và đạt mật số tối đa [OD.600 nm>0,6; tương đương mật
số >10
8
CFU/mL) sau 25 giờ nuôi cấy.

có xu hướng giảm mạnh
theo thời gian giữa các nghiệm thức và có sự khác biệt (P<0,01) so
với đối chứng. Sau 36 giờ hàm lượng PO
4
3-
còn lại giữa các nghiệm
thức DC, TGT025L, TGT013L và TGT013L+TGT025L lần lượt là
11,6; 4,3; 3,7 và 2,1 mg/L và có sự khác biệt lớn giữa các nghiệm
thức (P<0,001) với hiệu suất loại bỏ lần lượt là 45,6; 75,6; 80,0 và
88,7%. Sự tương tác giữa 2 dòng vi khuẩn TGT013L và TGT025L
mang lại kết quả tốt hơn khi bổ sung từng dòng riêng rẽ. Tổ hợp 2 dòng
vi khuẩn này được sử dụng để xử lý nước ao nuôi cá tra qui mô 500 lít.
Theo dõi sự biến đổi hàm lượng PO
4
3-
theo thời gian giữa 2
nghiệm thức DC và thí nghiệm (TGT025L+TGT013L) trong nước ao
nuôi cá tra ở qui mô 500 lít. Kết quả Hình 4.37 cho thấy hàm lượng
PO
4
3-
có xu hướng biến đổi khác nhau giữa 2 nghiệm thức DC và thí
nghiệm. Ở nghiệm thức đối chứng có sự tăng nhẹ hàm lượng PO
4
3-
sau
24 giờ đầu, sau đó giảm nhẹ và duy trì hàm lượng ở khoảng 4,6 mg/L.
Ngược lại, ở nghiệm thức thí nghiệm hàm lượng PO
4
3-