CHƯƠNG 2:
CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC HÓA THỰC VẬT
Sau khi chiết xuất mẫu cây bằng dung môi, lọc, thu hồi dung môi bằng cô quay chân
không ở nhiệt độ dưới 50
o
C sẽ thu được cao trích. Với cao trích toàn phần này, người ta
thường tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa học để có kết quả định tính trước khi
dùng các kỹ thuật sắc ký để cô lập những hợp chất tinh khiết.
I. KHẢO SÁT HOÁ THỰC VẬT
Trong cây thường chứa những hợp chất tự nhiên như: steroid, alcaloid, flavonoid,
saponin, tanin, glycoside…Phương pháp phân tích sàng lọc cổ điển là phương pháp Stas-
Otto. Nguyên tắc của phương pháp này là phân chia các hợp chất dựa vào độ hòa tan của
chúng trong các dung môi có độ phân cực khác nhau: đối với các cây thuốc, nước ta
thường sử dụng phương pháp phân tích của trường Đại học Dược khoa Rumani vì tính
đơn giản, rẻ tiền và nhanh chóng. Tuy nhiên từ các kết quả phân tích sơ bộ này, người ta
phải phối kiểm lại bằng các phương pháp phân tích khác để có kết luận chính xác hơn .
Đôi khi người ta cũng tìm hiểu một số đặc điểm cao trích trước cũng như độ hòa tan
trong dung môi, sự phân chia trong hai hệ dung môi không hòa tan vào nhau, đặc tính
acid-baz, điện tích….
Tiến trình phân tích sơ bộ hoá thực vật được trình bày tổng quát ở sơ đồ dưới đây.
FLAVONOID
ACID BÉO
ANTHRAGLYCOSID
TINH DẦU
PHYTOSTEROL
CAROTENOID
ALCALOID
SAPONIN
ANTHOCYANIN
ĐƯỜNG
ALCALOID

2
SO
4
đđ
TT Mayer, Bouchardat
Dragendorff , Liebermann
KOH, HCl
TT Fehling A, B
TT Mayer, Bouchardat
Na
2
CO
3
Na Acetat + FeCl
3

3%
Mg/HCl đđ
KOH 10%
Liebermann
Cồn cao độ
FeCl
3

TT Fehling A, B
TT Mayer, Bouchardat
Tạo bọt
Dịch cồn
Lớp ether
Dịch ether

- Ống 3: nhỏ một giọt lên giấy lọc khô, hơ khô, nếu trên giấy lọc có vết mờ thì sơ bộ
nhận định có ACID BÉO.
b. Phân tích dung dịch ether
Lớp dung dịch ether được rửa 3 lần với nước cất (20ml x 3 lần), sau đó lắc 3 lần với
dung dịch H
2
SO
4
2% (5ml x 3 lần)
Các dịch acid được góp lại để làm phản ứng định tính alcaloid với:
- Thuốc thử Mayer: Tủa vàng nhạt.
- Thuốc thử Dragendorff: Tủa Cam
- Thuốc thử Bouchardat: Tủa nâu
Dịch ether chia làm 3 phần cho vào 3 chén sứ, bốc hơi đến cạn
- Chén 1: nếu có mùi thơm thì có TINH DẦU
- Chén 2: nhỏ vài giọt H
2
SO
4
đđ, nếu có màu xanh thì có CAROTENOID
- Chén 3: Hóa cắn với 10 giọt anhydrid acetic cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ vài
giọt H
2
SO
4
đđ theo thành ống nghiệm. Nếu chổ giáp giới có màu vàng lục hay lục
đỏ thì sơ bộ nhận định có hợp chất PHYTOSTEROL.
I.2. Xác định các chất tan trong dịch cồn
Bã nguyên liệu sau khi chiết bằng ether đem chiết nóng với cồn 90
o

3
, nếu có sủi bọt thì có acid hữu cơ.
 Phần thứ 3: Dịch cồn được bóc hơi cách thủy trong chen sứ đến cạn, hòa cắn với
4-5 ml H
2
SO
4
2%, lọc. Chia dịch lọc ra làm 3 phần để làm phản ứng định tính
alcaloid.
- Ống 1: + thuốc thử Mayer.
- Ống 2: + thuốc thử Dragendorff.
- Ống 3: + thuốc thử Bouchardat.
 Phần thứ 4: Bốc hơi dịch cồn trong chén sứ cho đến cạn, hòa cắn với 3ml nước cất
đun nóng. Lọc, cho thêm vào nước lọc 4-5 giọt thuốc thử Fehling A và 4-5 giọt
thuốc thử Fehling B, đun cách thủy, nếu có tủa gạch thì có ĐƯỜNG KHỬ.
 Phần thứ 5: Dịch cồn được pha loãng với một thể tích nước cất, chia làm 2 ống
nghiệm:
- Ống 1: acid hóa (màu đỏ)
- Ống 2: Kiềm hóa (màu lục)
Thì có ANTHOCYNANOSID
 Phần thứ 6: Chia dịch cồn làm 2 phần, bóc hơi cách thủy trong chén sứ
- Chén 1: hòa với 5 ml nước cất, lắc mạnh nếu có bọt thì có SAPONIN.
- Chén 2: hòa vào chén 0,5 ml CHCl
3
và 0,5 ml anhydric acetic, cho vào ống nghiệm,
nhỏ từ từ H
2
SO
4
đđ.

Bảng 2: Tóm tắt sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên có trong cao trích (trường
hợp thí dụ)
Cao trích bởi các dung môi
Thuốc thử Phản ứng màu
Hợp chất
thiên nhiên
Ether
ethyl
Ethanol
90%
Acid 1%
+ + - KOH 10% Màu đỏ nhạt Antraglycoside
+ - - Nhỏ lên giấy lọc Có vết ố màu Acid béo
- + - Mg/HCl dung dịch Có vòng màu đỏ Flavonoid
+ - - Liebermann Có màu lục đỏ Phytosterol
+ - - H
2
SO
4
đđ Không màu Carotenoid
- + + Mayer, Bouchardat,
Hager, Dragendorff
Có tủa màu Alcaloid
- - Lắc mạnh dung
dịch
Không có bọt Saponin
++ + FeCl 5% Màu lục đen Tanin
- +++ - Fehling Tủa màu đỏ gạch Đường khử
II. TINH CHẾ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VẬT LÝ VÀ HÓA HỌC
KỸ THUẬT KẾT TINH

của MeOH với một dung môi khác. Việc chọn dung môi kết hợp với MeOH tùy
thuộc vào tính hoà tan của chất cần kết tinh .
I.2. Cách xác định độ hoà tan của một chất đối với dung môi
Cân một lượng chính xác chất tan trong ống nghiệm, dùng ống hút có chia vạch
0,1 ml nhỏ dung môi muốn hòa tan chất kết tinh, nhỏ từ từ vào cho đến khi hợp chất tan
hoàn toàn. Sau mỗi lần cho dung môi vào, cần lắc mạnh ống nghiệm để hoà tan chất.
Tỷ lệ giữa lượng chất rắn với thể tích dung môi đủ để hòa tan hoàn toàn là độ
hòa tan của dung môi ấy với chất rắn ở nhiệt độ thường.
Cách xác định độ hòa tan ở nhiệt độ sôi cũng tiến hành tương tự, và được thực
hiện trong nồi đun cách thủy.
Căn cứ vào độ hòa tan đã được xác định để tính lượng dung môi cần thiết cho
sự kết tinh.
Thí dụ: hợp chất có độ hoà tan:
5mg trong 1ml dung môi B ở nhiệt độ thường
45 mg trong 1 ml ở nhiệt độ sôi
Dung môi này hoà tan chất ở nhiệt độ sôi gấp 9 lần ở nhiệt độ thường nên có
thể dùng làm dung môi kết tinh.
Nếu có 500 mg chất thì lượng dung môi cần dùng là :
1mlx 500/45 ≈ 11 ml
Như vậy có thể dùng khoảng 12 ml dung môi để kết tinh 500 mg hợp chất trên.
Căn cứ vào độ tan ở nhiệt độ thường (5mg/ml), người ta có thể ước tính lượng
hợp chất còn lại trong dung dịch sau khi kết tinh.
I.3. Cách hòa tan nóng
Để kết tinh một lượng nhỏ chất rắn (10-20mg), nên sử dụng bình cầu nhỏ hoặc
ống nghiệm nhỏ.
- Trường hợp dùng một dung môi: Cho chất rắn vào bình, đổ một lượng dung
môi đã tính trước vào bình, đun cách thủy đến sôi đồng thời lắc đều. Khi dung dịch
trở nên trong suốt, lấy bình ra để nguội và cho vào tủ lạnh để yên kết tinh.
- Trường hợp dùng hỗn hợp 2 dung môi : thí dụ A là dung môi tan, B là dung môi
không tan hoặc ít tan. Trong bình cầu có chứa bột chất kết tinh, cho một lượng nhỏ

sắc ký cột hấp phụ.
- 1937, P. KARRER (Thụy sĩ) về hóa học Carotenoid, đặc biệt là vitamin A và
vitamin B.
- 1938, R. KURN (Đức) hóa học Carotenoid và Vitamin
- 1939, L.RIZICKA (Thụy sĩ) hóa học Polymetylen và Terpenoid
- 1940, MARTIN và SYNGE (Anh) bắt đầu nghiên cứu về sắc ký phân bố trên lớp
silicagel và về sau phát triển sang sắc ký giấy. Hai ông được giải thưởng Nobel
năm 1952 về sắc ký phân bố.
- 1948, TISLIUS (Thụy điển) được giải thưởng Nobel về kỹ thuật điện di và sắc ký
hấp phụ.
Phương pháp sắc ký ra đời đã cung cấp cho hóa học một công cụ tách chiết hiệu quả
và nhanh chóng, mở ra một giai đoạn phát triển rực rỡ của ngành hóa học, đặc biệt là
hóa học các hợp chất thiên nhiên.
Một đặc điểm của phương pháp sắc ký là tính đa dạng, cho phép ta ứng dụng nó ở bất
cứ mọi hoàn cảnh, mọi điều kiện… Trong hoàn cảnh chưa được trang bị những máy
chuyên dùng hiện đại như máy sắc ký khí, máy sắc ký lỏng cao áp… chúng ta vẫn có
thể thực hiện việc phân tích sắc ký bằng áp dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, sắc ký
giấy hay sắc ký cột hấp phụ cổ điển với những dụng cụ phương tiện đơn giản mà bất
cứ ở một cơ sở nghiên cứu nào cũng có thể sắm được.
Ngay cả ở những nước tiên tiến, bên cạnh những máy hiện đại, sắc ký lớp mỏng, sắc
ký cột vẫn là công cụ đắc lực trong công tác nghiên cứu hằng ngày.
Có nhiều phương pháp để phân loại sắc ký:
- Nếu dựa theo trạng thái liên hợp của pha động thì có sắc ký lỏng và sắc ký khí.
- Nếu dựa theo cơ chế của quá trình tách:
+ Sắc ký hấp phụ
+ Sắc ký phân bố
+ Sắc ký gel
+ Sắc ký trao đổi ion
III.1. Sắc ký hấp phụ
Hấp phụ là sự tích tụ một hợp chất ở trạng thái khí hoặc lỏng lên bề mặt một chất rắn.

Tal C
Đường, tinh bột
Inulin
Bột Celluloz
Trong thực tế, người ta hay dùng rộng rãi oxyd nhôm và silicagel để tách hỗn hợp
phân cực hoặc không phân cực.
Đối với dung môi phải thỏa mãn các điều kiện sau:
- Hòa tan tương đối tốt tất cả các cấu tử trong hỗn hợp cần phân tích.
- Bị hấp phụ ít nhất đối với pha tĩnh
- Không phản ứng hóa học đối với các chất cần phân tích cũng như chất hấp phụ
- Phải tinh khiết
Đối với chất phân tích (chất bị hấp phụ), cấu trúc hóa học có ảnh hưởng trực tiếp lên
độ hấp phụ của chúng.
Các hợp chất hydrocarbon bão hòa có độ hấp phụ rất kém, nếu thêm một nối đôi hay
một nhóm chức thì ái lực hấp phụ của chúng sẽ tăng lên.
Trong thực nghiệm, người ta đã xây dựng được một dãy các nhóm chức có độ hấp phụ
giảm dần như sau:
- Đối với hydrocarbon nhân thơm:
-COOH > -CONH
2
> -OH > -NHCOCH
3
> -NH
3
> -OCOCH
3
> -(CH
3
)
2

Cột
Lớp phẳng
Sắc ký khí
Sắc ký cột
Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký giấy
Sắc ký phân bố (sự cạnh tranh giữa
pha tĩnh lỏng và pha động)
Khí
Lỏng
Cột
Cột
Sắc ký lỏng-khí
Sắc ký lỏng-lỏng
Sắc ký trao đổi ion (sự cạnh tranh
giữa pha tĩnh là resin trao đổi ion và
pha động lỏng)
Lỏng Cột Sắc ký trao đổi ion
Sắc ký rây phân tử (sự cạnh tranh
giữa một khung polymer và pha
động lỏng)
Lỏng Cột Sắc ký lọc gel