1

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì trình bày trong luận văn là của riêng tôi, dưới sự
hướng dẫn của GS. TS. Đỗ Ngọc Liên và không trùng lặp với bất kì một nghiên cứu
nào có trước.

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm
2009
Học viên
Hoàng Thị Hương Quỳnh
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2


HOÀNG THỊ HƯƠNG QUỲNH


1.3.1. Khái niệm và phân loại 16
1.3.2. Thực trạng đái tháo đường thế giới và Việt Nam 18
1.3.3. Tác hại và biến chứng 18
1.3.4. Phòng và điều trị bệnh đái tháo đường 19
1.3.5. Đái tháo đường với Y học cổ truyền 19
1.3.6. Chuyển hoá glucose và điều hoà glucose huyết 19
1.4 Cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) 20
1.4.1. Đặc điểm thực vật học 21
1.4.2. Thành phần hoá học 22
1.4.3. Sử dụng và hoạt tính sinh học 22
1.4.4. Các nghiên cứu về cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour) có tác dụng
giảm béo phì và hạ glucose huyết 23
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3
2.1 Đối tượng nghiên cứu 23
2.1.1. Mẫu thực vật 23
2.1.2. Mẫu động vật 23
2.1.3. Dụng cụ và hoá chất thí nghiệm 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu 24
2.2.1. Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu 24
2.2.2. Phương pháp khảo sát thành phần hoá học của cây Hồng Bì 24
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì đến
trọng lượng và một số chỉ số hoá sinh máu của chuột BPTN 28
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch
chiết từ vỏ quả Hồng Bì trên mô hình chuột ĐTĐ type 2 thực nghiệm 30
2.2.5. Một số kĩ thuật phân tích hoá sinh 31
2.2.5.1. Phương pháp định lượng glucose huyết 31
2.2.5.2. Định lượng insulin huyết thanh chuột 31
2.2.5.3. Phương pháp định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh 32

3.6.2. Ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme hexokinase và glucose-6-phosphatase 59
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

5
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

BPTN : Béo phì thực nghiệm
BMI : Chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index)
BuOH : Cao buthanol
CH
2
Cl
2
: Cao dichlomethan
ĐTĐ : Đái tháo đường
ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay
EtOAc : Cao ethylacetate
G6Pase : Glucose -6- phosphatase
HK : Hexokinase
HFD : Ăn thức ăn chứa chất béo cao
HDL-c : Lipoprotein có tỷ trọng cao (High Density Lipoprotein)
LDL-c : Lipoprotein có tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein)
LD
50
: Liều độc làm chết 50% số chuột
MeOH : Cao methanol
Met : Thuốc metformin
ND : Ăn thức ăn chuẩn, bình thường
PĐ : Phân đoạn
STZ : Streptozocin

Bảng 3.11. Kết quả nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột sau 21 ngày điều trị
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến nồng độ insulin huyết
thanh của chuột sau 21 ngày điều trị
Bảng 3.13. Hàm lượng glycogen gan chuột sau 21 ngày điều trị bằng các phân đoạn
dịch chiết
Bảng 3.14. Hoạt độ enzyme hexokinase và glucose-6-phosphatase của các lô chuột
thí nghiệm sau 21 ngày điều trị

7
DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 2.1. Cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) và cành mang quả
Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn acid gallic
Hình 3.1. Sơ đồ quy trình tách chiết các hợp chất tự nhiên trong vỏ quả Hồng Bì
Hình 3.2. Sắc kí đồ các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì
Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh
dưỡng khác nhau trong vòng 6 tuần.
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa các lô chuột thí nghiệm
Hình 3.5. Biểu đồ trọng lượng trung bình của các lô chuột trước và sau điều trị 21 ngày
Hình 3. 6. Tác động của các phân đoạn dịch chiết đến một số chỉ số trao đổi lipid ở
chuột béo phì thực nghiệm
Hình 3.7. Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột thí nghiệm trước và sau
khi tiêm 72 giờ
Hình 3.8. Kết quả nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột sau 21 ngày điều trị
Hình 3.9. Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến nồng độ insulin huyết thanh
của chuột sau 21 ngày điều trị
Hình 3.10. Hàm lượng glycogen gan (mg/g gan) sau điều tri của các lô chuột
Hình 3.11. Hoạt độ enzyme hexokinase và glucose-6-phosphatase của các lô chuột
thí nghiệm sau 21 ngày điều trị
Hình 3. 12. Tóm tắt cơ chế tác dụng của các phân đoạn dịch chiết đến khả năng hạ

9
Cuối cùng tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị em học viên cao học,
sinh viên, gia đình và người thân đã động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi hoàn thành luận
văn này.

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2009
Học viên
Hoàng Thị Hương Quỳnh 10
MỞ ĐẦU

chức an toàn thực phẩm và dược phẩm Mỹ phê chuẩn (Food and Drug
Aministration - FDA) như: Metformin, Orlistat, Sibutramin, Ephedrin, Fenfluramin
… .Song hầu hết các thuốc này đều có nguồn gốc hóa học và thường gây tác dụng
phụ. Trước tình hình đó ủy ban chuyên gia của WHO đã khuyến nghị nên sử
dụng các thuốc có nguồn gốc thảo dược sẵn có, giá thành rẻ và ít độc tính. Việc
nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học và tác dụng dược lý của các loài thảo
mộc trên thế giới nói chung, Việt Nam nói riêng đã và đang phát triển, mang
một tầm quan trọng đặc biệt.
Dựa trên cơ sở các nghiên cứu về tác dụng dược lý của các cây thuộc họ
Cam quýt (Rutaceae) [16], [32], chi Clausena [26], [27], [66] nói chung và một số
nghiên cứu trên đối tượng Clausena lansium [33], [50] nói riêng, chúng tôi quyết
định chọn đề tài : “Nghiên cứu tách chiết và đặc tính sinh dược học của một số
hợp chất tự nhiên từ cây Hồng Bì ( Clausena lansium Lour.)”.
2. Mục đích nghiên cứu
Luận văn tập trung nghiên cứu thành phần hóa học của cây Hồng Bì
(Clausena lansium Lour.) và tác động của nó tới trọng lượng và một số chỉ số hóa
sinh, nhằm tạo cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm
kiếm thuốc và giải thích tác dụng chữa bệnh của cây thuốc y học cổ truyền. Mục
tiêu chính của luận văn:
1. Tìm ra quy trình tách chiết và khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên từ
mẫu thực vật.
2. Đánh giá tác dụng sinh dược học của một số phân đoạn dịch chiết từ mẫu
thực vật trên mô hình chuột béo phì và ĐTĐ thực nghiệm.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Dựa trên mục tiêu nghiên cứu chúng tôi xác định các nhiệm vụ cụ thể của
luận văn như sau:
1. Đưa ra quy trình tách chiết các hợp chất từ cây Hồng Bì (Clausena
lansium Lour.)

12

hay ba nhóm hydroxyl (-OH) gắn trực tiếp vào vòng benzene. Dựa vào thành phần
và cấu trúc người ta chia hợp chất phenolic thành 3 nhóm nhỏ [39]:
 Nhóm hợp chất phenolic đơn giản: Trong phân tử chỉ có một vòng benzene
và một vài nhóm hydroxyl. Tùy thuộc vào số lượng nhóm OH mà chúng được
gọi là các monophenol (phenol), diphenol (pyrocatechin, hydroquynone…),
triphenol (pyrogalol, oxyhydroquynol…).
 Nhóm hợp chất phenolic phức tạp: Trong thành phần cấu trúc phân tử của
chúng ngoài vòng thơm benzene (C
6
) chúng còn có dị vòng, mạch nhánh. Đại
diện nhóm này có axid cyamic, axid ceramic.
 Nhóm hợp chất phenolic đa vòng: là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chất
phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc trùng hợp của các đơn phân.
Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng.
Nhóm này có flavonoid, tannin và coumarin.
Hợp chất phenolic được hình thành một cách dễ dàng trong tất cả các cơ
quan thực vật từ những sản phẩm đường phân và chu trình pentose phosphate qua

14
acid sikimic hay theo con đường acetate manolate qua acetyl – SCoA. Trong số các
chất polyphenol tự nhiên, flavonoid là nhóm chất quan trọng nhất vì chúng phổ biến
ở hầu hết các loài thực vật và mang nhiều hoạt tính sinh dược học có giá trị.
1.1.1.1. Flavonoid
Falvonoid là những sắc tố, phần lớn có màu vàng (flavus- nghĩa là màu
vàng). Tuy nhiên một số sắc tố khác như xanh, đỏ, tím,…hoặc không màu cũng xếp
vào nhóm flavonoid vì chúng có chung đặc điểm cấu tạo.
* Cấu tạo hóa học và phân loại
Về cấu tạo hóa học, khung cacbon của flavonoid là C
6
-C

với C
3
và nhóm cacbonyl ở C
4
mà có thể phân biệt flavonoid thành các
nhóm phụ sau: Flavon và flavonol, flavanol (đihidro flavon), chalcol, aurol,
leucoantoxianidin, catechin, isoflavonoid, rotenoid và neoflavonoid.
* Hoạt tính sinh học của flavonoid
Tác dụng chống oxy hóa (antioxidant)
Flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa dây truyền gây ra bởi
các gốc tự do hoạt động. Tuy nhiên hoạt tính này mạnh hay yếu còn phụ thuộc vào
đặc điểm của từng flavonoid cụ thể.
Gốc tự do sinh ra trong quá trình sinh lý bình thường của cơ thể hay do tác
động bên ngoài là nguyên nhân gây phá hủy ADN, protein, lipid làm phát sinh
nhiều bệnh tật nguy hiểm và sự lão hóa cho cơ thể. Flavonoid có bản chất
polyphenol nên dễ dàng biến đổi dưới tác động của các enzyme có trong tế bào

15
động thực vật. Đặc biệt flavonoid có nhóm hyđroxyl ở vị trí ortho dễ dàng bị oxy
hóa bởi xúc tác của enzyme polyphenoloxydase và peroxydase tạo semiquynol hoặc
quynol [32]. Đây là các gốc tự do bền vững chúng có thể nhận điện tử và trở thành
dạng hidroquynol. Bởi vậy các chất này có khả năng phản ứng với các gốc tự do
hoạt động và loại chúng ra khỏi cơ thể. Quá trình được tóm tắt qua sơ đồ sau:

O
2
+ Flavonoid (khử) Flavonoid (oxy hoá)
(Hiđroquynol)

(semiquynol hoặc quynol

Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật cho thấy khi chuột béo
phì được điều trị bằng dịch chiết giàu flavonoid từ lá Bằng lăng ( Lagerstroemia
specciosa L.) thì có trọng lượng giảm đáng kể (~ 10% ) [72]. Thí nghiệm tương tự
với flavonoid từ lá Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.) đối với chuột cống trắng
uống cholesterol cũng cho thấy có tác dụng làm giảm các chỉ số cholesterol,
triglycerid, LDL-c đồng thời tăng HDL-c [35]. Naringin (C
17
H
32
O
4
) và hesperidin
(C
28
H
34
O
15
) là những flavonoid có hàm lượng cao trên họ cam chanh (Rutaceae) đã
được nhiều nhà nghiên cứu chiết xuất và thử tác dụng trên mô hình chuột béo phì
cho kết quả tốt trong việc làm hạ các chỉ số lipid máu [36], [39].
Tác dụng hạ glucose huyết
O
O
O
H
OH
OH
OH
OH

minh là có tác dụng điều hòa glucose huyết như: Quercetin có trong Đỗ trọng
(Eucommia ulmoides Oliver.) [63], Hesperidin và Naringin có trong các cây thuộc
họ Rutaceae [44], Genistein và Daidzein có trong Đậu nành (Glycine max L.) [12],
Myricetin có trong cây Vông vang (Abelmoschus moschatus) [12]…
1.1.1.2.Tannin thực vật.
Tannin là các hợp chất phenolic có trọng lượng phân tử cao có chứa các
nhóm hydroxyl và các nhóm chức khác như có khả năng tạo phức với protein và các
phân tử lớn khác trong điều kiện môi trường đặc biệt. Tannin thường là các hợp
chất vô định hình, có màu trắng, màu vàng nhạt hoặc gần như không màu, có hoạt
tính quang học, vị chát, dễ bị oxy hóa khi đun nóng hay khi để ngoài ánh sáng.

17
Tác dụng sinh học của tannin là chất bảo vệ cây trồng trước sự tấn công của
vi sinh vật gây bệnh và côn trùng ăn lá [43], [58]. Trong y học, tannin được sử dụng
làm thuốc cầm máu, chữa đi ngoài, ngộ độc kim loại nặng, chữa trĩ, viêm miệng,
viêm xoang, điều trị cao huyết áp và đột quỵ [2].
OOH
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
OHProcyanidin Quebracho

rắn (cafein), không có oxy thường ở thể lỏng dễ bay hơi (nicotin). Alkaloid thường
không có màu, không mùi và vị đắng. Một số alkaloid có màu vàng như berberin,
palmitin. Các alkaloid ở dạng base thường không tan trong nước [39].
N
N
N
N
CH
3
CH
3
CH
3
O
O
C
affein

O
NH
H
OH
OH
Morphine

N
N
CH
3
Nicotin

. Trong thực vật terpen được tổng hợp thông qua con đường
trao đổi chất acetate/mevalonate hoặc con đường glyceraldehyde 3-
phosphate/pyruvate. Hầu hết các terpen đều thuộc nhóm hydrocarbon, tuy nhiên
chúng có thể bị khử hoặc bị oxy hóa để hình thành các hợp chất terpenoid khác
nhau như alcohol, ketone, acid và aldehyd. Vì vậy, một số tác giả sử dụng thuật ngữ
“terpenes” để chỉ chung một nhóm lớn các hợp chất bao gồm cả terpen và
terpenoid. Terpen là thành phần chính của các loại tinh dầu, được dùng trong công
nghệ hương mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm. Những terpen bậc cao thường là
các chất có hoạt tính sinh học.
1.2. Bệnh béo phì (Obesity)
1.2.1. Khái niệm và phân loại béo phì
Tổ chức y tế thế giới (WHO) định nghĩa béo phì (obesity) là tình trạng tích
lũy mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng hay toàn bộ cơ thể gây ảnh
hưởng tới sức khỏe.
Để nhận định tình trạng béo gầy WHO thường dùng chỉ số khối cơ thể (BMI-
Body Mass Index). Chỉ số khối cơ thể được tính theo công thức như sau:

Trong đó : W: Khối lượng (kg )
H:Chiều cao (m )

Bảng 1.1. Phân loại BMI của người trưởng thành Châu Âu và Châu Á [3]
Mức độ thể trọng

Người trưởng thành

Châu Âu
Người trưởng thành
Châu Á
Nhẹ cân
< 18.5

tình hình đó bộ y tế đã kí quyết định thành lập “Trung tâm phục hồi dinh dưỡng và
kiểm soát béo phì” trực thuộc Viện Dinh dưỡng, chính thức tuyên chiến với bệnh
béo phì.
1.2.3.Tác hại và nguy cơ của bệnh béo phì
Chứng thừa cân và bệnh béo phì gây nhiều tác hại cho cuộc sống con người
như mất thoải mái trong sinh hoạt, giảm hiệu suất lao động khối lượng cơ thể nặng
nề kém lanh lợi
Người béo phì có nguy cơ bệnh tật cao hơn so với người thường do nhiễm
độc mỡ máu, tiêu biểu như:
 Bệnh tim mạch: Do mỡ tạng làm tim khó co bóp và mỡ máu làm xơ
cứng mạch vành và các mạch máu khác gây nhồi máu cơ tim tăng huyết áp.

21
 Rối loạn lipid máu: Tình trạng này rất hay gặp ở người béo bụng và
có biểu hiện đặc trưng là tăng triglycerid và lipid có hại (LDL-c), giảm lipid
có lợi (HDL-c).
 Tiểu đường: béo phì toàn thân có nguy cơ mắc ĐTĐ type 2.
 Đột quỵ: Những người có BMI > 30 dễ bị tử vong do bệnh liên quan
đến mạch máu não.
 Ngoài ra béo phì còn làm gia tăng nguy cơ của nhiều bệnh khác: xấu
đi tình trạng rối loạn tiền mãn kinh ở phụ nữ, suy giảm chức năng hô hấp, rối
loạn hoạt động cơ xương, ung thư, sỏi mật và các vấn đề bệnh lý tâm thần
khác… [4], [13], [37].
1.2.4. Nguyên nhân và giải pháp phòng, điều trị béo phì
Nguyên nhân chính dẫn đến thừa cân béo phì là do khẩu phần và thói quen
dinh dưỡng không hợp lý, hoạt động thể lực kém dẫn đến năng lượng hấp thụ
vào cơ thể vượt quá mức cần thiết và tích lũy dưới dạng mỡ. Ngoài ra một số
bệnh lý nội tiết như: Hội chứng Cushing (do hormone cortisosteroid trong cơ
thể tăng quá cao), bệnh suy tuyến giáp trạng, bệnh trứng đa nang hoặc có chứa
gen béo phì di truyền.

 Triglycerid (0,8 – 2,3 mmol/l )
 HDL-c (0,90 – 1,50 mmol/l )
 LDL-c (0,5 – 3,4 mmol/l )
Tình trạng rối loạn và hoặc tăng nồng độ các thành phần lipid trong máu, hậu
quả là sự tạo thành các mảng xơ vữa gây tắc mạch làm tăng nguy cơ biến chứng tim
mạch và đột quỵ, tăng các biến chứng mạch máu khác, hậu quả nặng nề nhất là dẫn
đến tử vong hoặc tàn phế gọi là rối loạn chuyển hóa [3]. Ngày nay người ta đã xem
là có rối loạn lipid máu ngay từ khi tỉ lệ thành phần của lipid máu có sự thay đổi.
Khái niệm này chỉ rõ rối loạn lipid máu có thể xảy ra từ rất sớm, ngay cả khi chưa
có tăng các giá trị tuyệt đối nồng độ của các thành phần trong máu [3]. Rối loạn này
có thể tiên phát do di truyền hoặc thứ phát sau các bệnh khác như: béo phì, đái tháo
đường, nghiện rượu, suy giáp trạng. Fredrickson căn cứ vào kĩ thuật điện di và siêu
ly tâm với các thành phần huyết thanh đã phân loại chứng tăng lipid máu thành 5
type dựa trên những thay đổi thành phần lipoprotein. Cách phân loại này đã được

23
WHO chính thức sử dụng vào năm 1970 [23]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh
người mắc bệnh béo phì có nguy cơ cao mắc các bệnh rối loạn lipid máu dẫn đến xơ
vữa động mạch (liên quan chủ yếu đến các lipoprotein) hoặc hiện tượng “nhiễm độc
mỡ tế bào” [18], [23].
1.2.6. Mối quan hệ giữa béo phì và đái tháo đường
Béo phì và ĐTĐ là hai bệnh không truyền nhiễm nguy hiểm nhất của thế kỉ
21. Hai căn bệnh này có mối liên quan chặt chẽ với nhau thể hiện ở chỗ tỉ lệ người
béo phì luôn tăng tương đương với số bệnh nhân bị ĐTĐ. Một cuộc khảo sát của
Mỹ gần đây đã chỉ ra rằng có tới 58% số người bị ĐTĐ type 2 được quy cho là do
béo phì. Béo phì liên quan tới ĐTĐ type 2 thông qua sự đề kháng insulin. Nồng độ
acid béo tự do cứ tăng 100µM thì mức đề kháng insulin tăng khoảng 5-10% [3].
Thiếu insulin dẫn đến sự tăng trọng lượng cơ thể, tăng đường máu, cuối cùng dẫn
đến bệnh ĐTĐ type 2.
Có nhiều nhân tố ảnh hưởng tới mối quan hệ giữa béo phì và bệnh ĐTĐ type

(diabetes: nước chảy trong ống syphon) và tiếng Latinh (mellitus: ngọt) [77].
Khoảng 1550 năm trước công nguyên các thầy thuốc Hy lạp đã mô tả bệnh này với
các triệu chứng ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, nước tiểu có đường và sút cân
nhanh [3]. PGS. TS Tạ Văn Bình thì định nghĩa đái tháo đường (ĐTĐ) là một hội
chứng có đặc tính biểu hiện bằng tăng đường máu, do hậu quả của việc mất hoàn
toàn insulin hoặc là do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của
insulin. Bệnh ĐTĐ được xác định dựa vào những tiêu chí trong bảng 1.2 [3].

Bảng 1.2. Các tiêu chí để chuẩn đoán ĐTĐ theo WTO [3] Kết luận
Đường huyết
lúc đói
(mmol/l)
Đường huyết 2 giờ sau
khi làm nghiệm pháp
tăng đường huyết
(mmol/l)
Đường huyết
tại thời điểm
bất kì
(mmol/l)
Đái tháo đường > 7 > 11,1 >11,1
kèm triệu
chứng uống
nhiều, đái nhiều
và gầy sút.
Rối loạn dung
nạp đường

 Ngoài ra còn có ĐTĐ thai nghén và một số type ĐTĐ đặc biệt khác như thiếu
hụt chức năng tế bào β, thiếu hụt di truyền về tác động của insulin, bệnh tụy
ngoại tiết,