BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
ea *****
DƯƠNG HỔNG DIỆP
TỔNG HỢP VÀ THẢM DÒ TẮC DỤNG
% %
SINH HỌC MỘT SỐ DÂN CHẤT CỦA
ISONIAZID
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DU3C s ĩ KHOÁ 2001-2005)
Người hướng dẫn : PGS. TS. NGUYỄN QUANG ĐẠT
ThS. VŨ TRẦN ANH
Nơi thực hiện : BỘ MÔN HOÁ HỮU c ơ
Thời gian thực hiện ; 28/3 - 27/5/2005
HÀ NỘI, THÁNG 5 - 2005
c Ä r r t / ư n /
vớỉ IÒH0 biết ơn õấu eắc tôi xin chân thành clm ơn:
PỔ5. T5. N^uyấn Quaii0 Đạt, Th5. Vữ Trl'n Anh âầ tận tình hưốn^ dẫn
tôi tron^ quá trình thực hiện luân văn này.
Tôi xin chân thành clm ơn T5. Đỗ Ngọc Thanh (Phồn^ thí nghiệm
trun0 tâm - Trường £)ại học Dược Hà Nội); T5. Cao Văn Thu (Bộ môn Vi sinh
học - Trường 9ại học Dược Hà Nội); Phòng ỡinh học thực nghiệm ('/iện hoá học
các hợp chất thiên nhiềti); Phòng khổi phổ (V'iên hoá học).
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô ^iáo, kỹ thuệt viên môn Hoá
hữu cơ - Trường Đạ\ học Dược Hà Nội âầ giúp ¿íố tôi tron^ ữ^uá trình thực hiện
luận vẩn tại Bộ môn.
Hà Nội, ngày 50 tháii^ 5 năm 2005
Sinh viên: Dương Hổri0 Diệp
MỤC LỤC
Đặt vấn đề 1
Phần 1: TỔNG QUAN
2

20
2.3 Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc 23
2.4 Thử tác dụng sinh học 28
2.4.1 Thử tác dụng kháng khuẩn 28
2.4.2 Thử tác dụng kháng tế bào ung thư

31
2.5 Bàn luận 34
2.5.1 Tổng hợp hoá học
34
2.5.2 Thử tác dụng sinh học
35
Phần 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 36
Tài liệu tham khảo.
Phu luc.
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DMF ; Dimethylformamid
DMKT : Dung môi khai triển
DMSO : Dimethylsulfoxyd
Hep - 2 : Tế bào ung thư gan người
IR
: Infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại)
MS
: Mass spectrometry (Phổ khối lượng)
PAS
: Acid paraamino salicylic
SKLM
: Sắc ký lớp mỏng
UV
: Ultraviolet spectroscopy (Phổ tử ngoại)

TỔNG QUAN
1.1. BỆNH LAO VÀ THUỐC ĐlỂU TRỊ.
Bệnh lao đang là vấn đề khẩn cấp của toàn cầu và là nỗi lo của nhiều
quốc gia . Trong những năm gần đây bệnh lao có chiều hướng gia tăng, nhất là
ở những nước đang phát triển, bệnh lao là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong
trong số những người trẻ tuổi và trưởng thành trên thế giới [6 ].
Trên thế giới hiện có khoảng 2 tỷ người nhiễm lao. Mỗi năm có khoảng 8
triệu người mắc mới và 2 triệu người chết vì lao. Tại Việt Nam, theo ước tính
chính thức của Chương trình chống lao quốc gia, khoảng 44% dân số Việt Nam
nhiễm lao, số bệnh nhân nhiễm lao mới các thể hàng năm là 145.000 người. Tình
hình lao kháng thuốc ngày càng diễn biến phức tạp. Theo tư liệu của Chương
trình chống lao quốc gia, sau 6 năm (1996-2002) tỷ lê kháng thuốc đơn lẻ
giảm nhưng tỷ lệ kháng đa thuốc lại tăng, làm cho nguy cơ lây lan loại vi
khuẩn kháng thuốc này trong cộng đồng là một vấn đề nan giải [6 J[8 ].
Các thuốc điều trị lao cho đến nay vẫn là biện pháp chính trong điều trị
và ngăn chặn bệnh lao [8].[13]Í18].
Điều trị lao bằng tmiốc ngày nay có 2 mục đích, nhằm vào 2 nhóm trực
khuẩn lao trong cơ thể; nhóm sinh sản nhanh, phát triển mạnh trong các tổn
thương viêm, nhóm phát triển chậm nằm trong các đại thực bào và chất bã đậu.
Ngày nay bệnh lao được điều trị bằng thuốc theo nguyên tắc [6 ]^ [8 ]:
- Phối hợp các loại thuốc để hạn chế khả năng kháng thuốc của VI khuẩn
- Điều trị theo 2 giai đoạn:
+ Giai đoạn tấn công: phải phối hợp ba thuốc trở lên và dùng hàng ngày
+ Giai đoạn duy trì: Phối hợp hai thuốc trở lên và có thể dùng ngắt quãng
2- 3 lần / tuần.
Các thuốc chống lao hiện nay được chia làm 2 loại:
-Thuốc chống lao thiết yếu (thuốc chống lao hạng 1) : isoniazid,
rifampicin, pyrazinamid, streptomycin và ethambutol.
-Thuốc chống lao hạng 2: thiacetazon, ethionamid, kanamycin,
capreomycin, PAS.

* Phần viết trong ngoặc là khoảng liều được phép điều chỉnh
Tại Việt Nam Chương trình chống lao quốc gia đề xuất phác đồ điều trị
và chỉ định như sau:
- Phác đồ điều trị bệnh nhân lao mới:
+ Công thức: 2 SHRZ/6 HE
Sử dụng loại thuốc streptomycin, isoniazid, rifampicin và pyrazinamid
hàng ngày trong 2 tháng đầu, 6 tháng tiếp theo dùng 2 loại thuốc isoniazid và
ethambutol hàng ngày.
+ Chỉ định: Tất cả các trường hợp bệnh nhân lao mới.
- Phác đồ điều trị lại:
+ Công thức: 2 SHRZE / 1HRZE / 5 H3 R3 E3
Sử dụng 5 loại thuốc Streptom ycin,isoniazid,rifampicin, pyrazinamid,
ethambutol liên tục trong 2 tháng đầu, tháng thứ 3 dùng 4 loại isoniazid,
rifampicin, pyrazinamid, ethambutol hàng ngày, 5 tháng tiếp theo dùng 3 lần 1
tuần với 3 loại isoniazid, rifampicin, ethambutol.
+ Chỉ định: cho tất cả các trường hợp điều trị thất bại hoặc tái phát của
công thức điều trị bệnh nhân lao mới.
- Phác đồ điều trị lao cho trẻ em:
+ Côngthức:2HRZ/4HR
Sử dụng 3 loại thuốc isoniazid, rifampicin, pyrazinamid hàng ngày trong
2 tháng đầu, 4 tháng tiếp theo với 2 loại isoniazid, rifampicin.
+ Chỉ định: tất cả các trường hợp lao trẻ em.
Trên đây là một vài nét tổng quát về bệnh lao và các phưoỉng pháp điều
trị bệnh lao. Trong số các thuốc điều tri lao, isoniazid là thuốc có tác dụng
mạnh , diệt được cả vi khuẩn trong và ngoài tế bào. Sau đây là một vài nét về
cấu tạo hoá học cũng như tác dụng sinh học của isoniazid.
1.2. ISONIAZID : CẤU TẠO HOÁ HỌC, KHẢ NĂNG PHẢN ÚNG VÀ TÁC DmG
SINH HỌC.
1.2.1. Cấu tạo hoá học, khả năng phản ứng của isoniazid.
Isoniazid là hydrazid của acid isonicotinic có công thức.

H,0
1.2.2.Tác dụng sinh học của ỉsonỉadd.
Isoniazid vừa có tác dụng kìm khuẩn, vừa có tác dụng diệt khuẩn. Nồng
độ ức chế tối thiểu đối với trực khuẩn lao từ 0,025- 0,05 I^g/ml. Thuốc ức chế
tổng hợp acid mycolic, thành phần chủ yếu tạo nên lófp vỏ phospholipid của vi
khuẩn lao. Khi vào cơ thể thuốc được hấp thu gần như hoàn toàn, thuốc có thể
khuyếch tán tốt tới tất cả các cơ quan và dịch cơ thể,, kể cả dịch não tuỷ.
Trong điều trị người ta thường phối hợp isoniazid với thuốc chữa lao khác để
làm tăng tác dụng, giảm liều các thuốc phối hợp và làm chậm sự kháng thuốc
của trực khuẩn lao.
1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA DẪN CHẤT HYDRAZON.
1.3.1. Tác dụng kháng khuẩn của dẫn chất hydrazon.
Đây là tác dụng quan trọng nhất của các dẫn chất hydrazon, đáng chú ý
nhất là dẫn chất hydrazon của 5- nitrofurfural có công thức chung:
Năm 194j| G. Domagk [17] đã tổ^ hợMược Tibion (Thiosemicarbazon
của aldehyd pai!ar acetylaminobenzS[sj^9 ^ dụng chống lao và đã áp dụng
vào thực tế lâm sàng với kết quả tốt với các tên biệt dược như TBI, Corteben,
Livazon.
o >— . s
H3C - C - H N - / '^ C H = N -N H -C -N H 2
Thông thường người ta hay phối hcfp Tibion với PAS ( acid pỉ^^amino
salicylic) để làm tăng tác dụng của PAS trong điều trị lao màng nhầy, lao da,
lao khoang miệng.
Năm 1948 MN. Soulina và E.Michina [17] đã tổng hợp được 1 dẫn chất
khác của Thiosemicarbazon có tác dụng chống lao lấy tên là Cutizon có công
thức như sau:
H3C-C— > -C H = N -N H -C -N H 2
H
Dãy có tác dụng chống lao mạnh thứ hai là dẫn chất isonicotinoyl
hydrazon với các dãn chất như:

0
N
Kết quả cho thấy hầu hết các chất đều có tác dụng trên vi khuẩn lao,
một số chất có tác dụng tốt với vi khuẩn lao kháng thuốc [16].
Năm 2000 các tác giả Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt, Lê Ngọc Vân
[9], đã nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng của một số dẫn chất
thiosemicarbazon và isonicotinoyl hydrazon của isatin và 5 -halogen0 5 atin .
Kết quả cho thấy tất cả các chất tổng hợp được đều có tác dụng mạnh trên
chủng Mycobacterium tuberculosis H37RV. Ngoài ra có 6 dẫn chất của
3-isonicotinoyl hydrazon của isatin và 5- halogencảsatin có tác dụng trên cả
chủng vi khuẩn lao đã kháng isoniazid.
Năm 2001 các tác giả Ngô Mai Anh, Vũ Trần Anh, PhạmvMinh Thuỷ
[5 ] đã nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng chống lao của một số dẫn chất
isonicotinoyl hydrazon của vaniùịn và các vanil\in thay thế.
0 =C-NH-N=CH
0
N
0 CH1
R = H
= NƠ2
= I
= C1
Kết quả cho thấy các chất tổng hợp được đều thể hiện tác dụng trên vi
khuẩn lao tuy ở mức độ khác nhau.
1.3.2.Tác dụng chống khối u của dẫn chất hydrazon [20].
Trong vài thập niên trở lại đây do sự gia tăng của bệnh ung thư người ta
chú ý đặc biệt vào việc nghiên cứu ra các loai thuốc mới để thanh toán căn
bệnh nan y này. Trong quá trình nghiên cứu bước đầu người ta phát hiện ra
một số dẫn chất có cấu trúc hydrazon có tác dụng kìm hãm sự phát triển của tế
bào ung thư, đặc biệt đáng chú ý là các dẫn chất của N,N-bis-2- cHloroethyl

Tên khoa học
Tên
thuốc
Tác
dụng
1
0=C-NH-N=CH—
f \ 0CH3
Isonicotinoylhydrazon
của 3 - metoxy - 4 -
hydroxybenzaldehyd
Ftivazií{/
Vaniziít^
Chống
lao
2
Ố
NH-N=CH^ị^]^^(XH3
HOOC 0CH3
Isonicotinoylhydrazon
của 3,4 dimetoxy-2-
carboxybenzaldehyd
Saluzit^
Chống
lao
3
HsC-C-HN^ ^CH=N-NH-C-NH2
Thiosemicarbazon của
^ f;h y d -p-acetỵl-
aminobenz^

Kháng
khuẩn
7
1 1 a- n
O2N 0 CH=N-N
l-(5-^itro-2’-
furfuryliden am ino)-
l,3,4-triazol
Furazonal
Kháng
khuẩn
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP DẪN CHẤT HYDRAZ0N.
Có ba phương pháp chính để tổng hợp dẫn chất hydrazon.
1.4.1.Ngưng tụ giữa hydrazỉn với các hợp chất carbonyl.
ZHN-NH2 + • ZH N -N =c:^^ + H2O
R2
Đây là phản ứng thuận nghịch nhưng nghiêng về chiều thuận. Cơ chế của
phản ứng được giải thích như sau: Trước hết là phản ứng cộng họíp ái nhân của
phân tử hydrazin vào nhóm carbonyl, tiếp theo là phản ứng loại nước tạo
hydrazon.
R, ® Rk®
> = 0 .
.OH
Rk® /
C -O H + HoN-NH-Z ■ _ A ©
r / r/ N -N H -Z
©
Ri\ -H2O Rk ® -H^ ,
V ■ C=N-NH-Z ■


l
1.4.3. Phản ứng phân cắt liên kết đôi bằng ỉon hydranỉum hoặc muối
dỉazonù
R2C=CR2 + HaN-NH'

^ R2CH2 + R2C=N-NH 2
PhHC=CHMe + ArN2''
©
PhHC-CHMe +H2O
N=NAr
0 H2
PhHC-CHMe
N=NAr
CHPh
ìĩ M
•N-NHAr
0=CHMe
PHẦN 2
THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
2.1.HÓA CHẨT, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM.
2.1.1 Hóa chất.
Các hóa chất sử dụng là loại thông thường p, PA có sẵn ở phòng thí
nghiệm của Bộ môn Hóa hữu cơ - trường Đại học Dược Hà Nội.
2.1.2 Phương tiện
Sắc ký lớp mỏng trên bản mỏng silicagel Kieselgel60F254 ( Merck).
Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy GallenKamp tại Bộ môn Hoá hữu cơ
trường Đại học Dược Hà Nội.
Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy PerkinElmer tại phòng thí nghiệm
trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội.
Phổ tử ngoại ( UV) ghi trên máy CarylEUV-Visible spectrophotomổí^

OH
Chất
( I )
(II)
(III)
(IV )
Ar
HO
H3CO'
O0N
Chất
(V )
(V I)
(V II)
Tất cả các phản ứng trên được tiến hành trong dung môi ethanol tuyệt
đối, xúc tác acid acetic đặc.
2.2.2 Tổng hợp ỉsonỉcotỉnoyl hydrazon của benzaldehyd(CỶt0I) :
* Sơ đồ phản ứng :
0 =C-NH-NH2
ọ
0 =CH
ò
-H^o
0 =C-NH-N=CH
ồ 6
ơ )
Ci3HiiN30;M = 225,25
* Dụng c ụ :
Bình cầu 3 cổ dung tích 100 ml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ
* Tiến hành :

* Tiến hành :
ƠIO vào bình cầu hỗn hợp phản ứng gồm 0,005 mol isoniazid (0,685g); 0,005
mol 4-clorobenzaldehyd (0,7g); 15ml ethanol tuyệt đối; vài giọt acid acetic đặc.
Khuấy, đun hồi lưu cách thủy hỗn hợp phản ứng, theo dõi thời gian phản
ứng bằng SKLM , hệ dung môi triển khai là CHCI3 : MeOH (9:1)
Xác định thời gian phản ứng tối ưu là 60 phút, chuyển hỗn họỊ) phản ứng
sang cốc thủy tinh, để lạnh cho sản phẩm kết tinh hoàn toàn, lọc hút trên phễu
Buchner thu được tủa, rửa tủa bằng nước cất, ethanol lạnh,sấy khô thu được tủa
thô.
Kết tinh lại bằng ethanol tuyệt đối, lọc lấy tủa, sấy khô thu được l,65g sản
phẩm kết tinh mầu trắng.
* Kết quả:
-Hiệu suất: 86,2%.
-Nhiệt độ nóng chảy: 205 - 206 °c.
- Độ tan: sản phẩm ít tan trong nước, aceton, tan trong eth anol nóng, DMF.
- Kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM, hệ dung môi triển khai là CHCI3 : MeOH
(9:1), sản phẩm có Rf= 0,55.
2.2.4.Tổng hợp isonicotinoylhydrazon của 3-nitrobenzaldehyd(CtíìỆIII).
* Sơ đồ phản ứng :
0 =C-NH-NH2 0 =CH
+
Ọ
□
-H, 0
0 =C-NH-N=CH
ỏ
NO,
Ọ
NOo
(III)

N
Q
(IV )
Ci3 HiiN3 0 2 ;M = 241,25
*Dụng cụ :
Bình cầu 3 cổ dung tích 100 ml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ có bếp
đun.
* Tiến hành :
Tiến hành tượng tự như 2.2.4 với 0,005 mol isoniazid ( 0,685g)
0,005mol sa licy l^ ^ íó ^ í 15ml ethanol tuyệt đối; vài giọt acid acetic đặc.
Thời gian phản ứng tối ưu là 60 phút, kết tinh lại bằng hỗn hợp dung môi theo
tỷ lệ DMF: H2O (l:l).Thu được 0,92g sản phẩm kết tinh mầu trắng xanh.
* Kết qu ả:
- Hiệu suất: 74,4%.
- Nhiệt độ nóng chảy: 234 - 235 °c.
- Độ tan : sản phẩm ít tan trong nước, aceton, ethanol, tan trong DMF.
- K iểm tra độ tinh khiết bằng SKLM, hệ dung m ôi triển khai là C H Ơ 3 : M eO H
(9:1), sản phẩm có Rf = 0,56.
2.2.6.Tổng hợp ỉsonicotinoyl hydrazon của vanỉlin (ỒẶ^V).
* Sơ đồ phản ứng :
0 =C-NH-NH2 0 =CH 0 =C-NH-N=CH
- H9O
0
N
o
Ị^OCH.
ỎH
0
N
OH

furfural (0,48g); 15ml ethanol tuyệt đối; vài giọt acid acetic đặc.
Thời gian phản ứng tối ưu là 60 phút, dung môi kết tinh lại DMF: HjOCl: 1)
Thu được 0,75g sản phẩm kết tinh mầu xám nhạt.
^ Kết quả:
- Hiêu suất: 70,4% .
- Nhiệt độ nóng chảy : 216 - 217°c
- Độ tan : sản phẩm ít tan trong nước, aceton, ethanol, tan trong DMF.
- Kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM, hệ dung môi triển khai là CHQ3: MeOH
(9:1), sản phẩm có Rf = 0,49.
2.2.8.Tổng hợp ỉsonicotỉnoylhydrazon cuahitrofurfural(ĩBÌỊéịA^II)
* Sơ đồ phản ứng :
I j| + H 2Ọ i f [
O2N o CH(0 C0 CH3)2 H2SO4 O2N o CHO
0 =C-NH-NH2 o=hc o NO2
ọ
+
0 =C -N H -N =C H o NO2
Ọ
(vn)
C11H8N4O4 ; M = 260,21
* Dụng cụ :
Bình cầu 3 cổ dung tích 100 ml, sinh hàn hồi lưu, nhiệt kế, máy khuấy từ
có bếp đun.
* Tiến hành:
Qio vào bình cầu 0,26ml acid sulfuric đặc; 0 ,0 1 mol-mtrofurfural-diacetat
(2,43g); l,5ml nước cất.
Khuấy, đun hồi lưu cách thủy ở 90 - 98° c trong 90 phút, để nguội thêm
lOml nước cất, làm lạnh đến 15° c. Hòa 0,01mol isoniazid (l,37g) vào 3ml
nước cất, sau đó cho vào hỗn hợp phản ứng trên đã được làm lạnh ở 15° c .
Khuấy, theo dõi thời gian phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi triển khai là