TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN DƯƠNG THANH QUY

KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA
VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH TRÊN
CÁ TRA (Pangasianondon hypophthalmus)
Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Cán bộ hướng dẫn
PGs. Ts. Từ Thanh Dung
2014

1

KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN Edwardsiella
ictaluri GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypopthalmus) Ở ĐỒNG
BẰNG SÔNG CỬU LONG
Dương Thanh Quy
1
và Từ Thanh Dung
2
(1) Lớp nuôi trồng thủy sản k37, khoa thủy sản, trường Đại học Cần Thơ
(2) Bộ môn Bệnh học thủy sản, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ
Email:
ABTRAST
This study was carried out to assess phylogenetic diversity of Edwarsiella ictaluri
isolates collected from striped catfish intensively farmed in the Mekong Delta,
Vietnam. A total of 14 bacterial isolates were isolated and identified from diseased
catfish by using PCR technique based on the upstream region of fimbrial gene
cluster. The results determined that they were E. ictaluri positive with specific DNA
band for the upstream region of fimbrial gene appeared at 470 bp. Ten isolates were
chosen to sequence, the nucleotide blast result showed that these strains had high
homology/identity (96-100%) compared with reference strains of Edwardsiella
ictaluri on Genbank (NCBI). These strains were used for analyzing phylogenetic

2

trường, tạo điều kiện cho dịch bệnh phát triển và gây thiệt hại nghiêm trọng cho
người nuôi. Trong đó bệnh gây thiệt hại lớn nhất cho nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL là
bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) gây ra (Crumlish et
al., 2002). Ngoài ra, vi khuẩn gây bệnh này còn được xác nhận ở Mỹ (Hawke et al.,
1986), Thái Lan (Kasornchndra et al., 1987), Indonesia (Yuasa et al., 2003) và Thổ
Nhĩ Kì (Keskin et al., 2004).
Vi khuẩn E. ictaluri có thể coi là tác nhân đặc thù gây bệnh chủ yếu trên cá da trơn
nuôi công nghiệp ở nhiều nước trên thế giới. Vi khuẩn E. ictaluri là vi khuẩn Gram
âm, hình que, không sinh bào tử, yếm khí tùy tiện, phản ứng Oxidase âm tính,
Catalase dương tính (Plum, 1999; CrumLish et al., 2002; Từ Thanh Dung và ctv,
2004). Bệnh do vi khuẩn này gây ra đã và đang gây thiệt hại lớn cho người nuôi cá
tra ở ĐBSCL. Bên cạnh đó, thuốc kháng sinh là biện pháp chữa bệnh phổ biến, gây
ra hiện tượng kháng thuốc vi khuẩn này và vi khuẩn môi trường xung quanh (Từ
Thanh Dung, 2010), tình trạng sử dụng kháng sinh tràn lan, không kiểm soát ngày
càng làm cho tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp và gây khó khăn cho ngành
xuất khẩu cá tra. Năm 20l0, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thiện Nam và ctv,
hầu hết vi khuẩn E. ictaluri kháng với streptomycin, chloramphenocol (95%),
florfenicol, enrofloxacin (77,5%), doxycycline (67,5%) và 97,5% chủng vi khuẩn
biểu hiện sự đa kháng thuốc (kháng từ 3 loại kháng sinh). Hơn nữa, theo kết quả
kháng sinh đồ của Phạm Thanh Hương (2010), cho thấy vi khuẩn E. ictaluri cũng
kháng với các loại kháng sinh streptomycin (84,1%), enrofloxacin (74,5%); kháng
hoàn toàn với flumequin, trimethoprim + sunfamethoxazol; nghiên cứu cũng phát
hiện có 96% chủng vi khuẩn E.ictalluri biểu hiện sự đa kháng.
Trước tình hình đó, để giảm thiệt hại của bệnh do vi khuẩn này gây ra thì việc sử
dụng vắc-xin để phòng ngừa bệnh là điều cần thiết. Để thực hiện được điều đó, trước
hết cần phải khảo sát sự đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn gây bệnh nguy
hiểm này. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của vi khuẩn
E. ictaluri. Nghiên cứu của Sakai et al (2009), áp dụng biện pháp khuếch đại chiều

cho đến khi sử dụng. Các đặc điểm hình thái và sinh hóa cơ bản của vi khuẩn được
kiểm tra như màu sắc khuẩn lạc, tính di động, nhuộm Gram, phản ứng
Oxidase/Catalase và phản ứng O/F theo cẩm nang của Cowan và Steel (Barrow và
Feltham, 1993) và tài liệu hướng dẫn của Buller (2004).
2.2 Tiến hành phản ứng Polymerase chain reaction (PCR) xác định E. ictaluri
Ly trích DNA
Các chủng vi khuẩn sau khi được nuôi tăng sinh trong môi trường BHIB được ly
trích DNA dựa theo tài liệu của Moore et al (2004). Các bước thực hiện gồm: hút 2
ml dung dịch nuôi cấy cho vào tube 2,2 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút,
loại bỏ phần dung dịch phía trên. Cho vào tube 300 µl Lysis buffer (Tris [pH 8.0] 1
M, EDTA [pH 8.0], NaCl 5 M, SDS 10%, H
2
O), cho viên bi sắt vào tube và lắc đều
bằng máy lắc, hút thêm 700 µl Lysis bufer cho vào tube, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10
phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, lấy 700 µl dung dịch phía trên chuyển
sang tube mới. Cho 700 µl Ethanol 95% vào dung dịch, ly tâm 13000 vòng/phút, bỏ
phần dung dịch phía trên (chỉ lấy kết tủa). Rửa kết tủa bằng 500 µl Ethanol 70%, ly
tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Bỏ phần dung dịch phía trên, sấy khô trong chân
không trong 10 phút. Hòa tan kết tủa trong 100 µl TE 0,1X (Tris pH8 1 M, EDTA
0,5 M, H
2
0). Trữ mẫu ở -20
o
C trong quá trình sử dụng.
Tiến hành phản ứng PCR
Sau khi ly trích, tiến hành thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA nằm trong
vùng “upstream” của gen bám dính có kích thước 470 bp, phản ứng PCR được thực
hiện dựa theo qui trình của Sakai et al., (2009(b)) với cặp mồi có trình tự:
Edi_F: 5’-
CAGATGAGCGGATTTCACAG-3’ ;Edi_R5’-GCGCAATTAACATAGAGCC-3’.

Kết quả của các mẫu sau giải trình tự được xếp hàng (alignment) bằng phần mềm
ClustalW (DNA Data Bank of Japan; http: Clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html). Cây
phả hệ (Phylogenetic tree) được xây dựng bằng phần mềm Mega 6 (Tamura et
al.,2013) bằng thuật toán Neighbor-joining với giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại.
III. KẾT QUẢ
3.1 Phân lập vi khuẩn
Đề tài đã thu được 25 mẫu cá tra từ 6 ao có dấu hiệu bệnh gan thận mủ với các dấu
hiệu bên ngoài như xuất huyết, mắt hơi lồi, xuất hiện nhiều đốm trắng đục có kích
cỡ 1-3 mm trên gan, thận và tỳ tạng và đã phân lập được 14 chủng vi khuẩn. Nguồn
gốc của các chủng vi khuẩn phân lập được trình bày ở Bảng 1.
Bảng 1. Các chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bệnh gan thận mủ ở
ĐBSCL
Stt

Đ
ịa ph
ương

S
ố mẫu

thu thập
Các ch
ủng phân lập

Th
ời gian

1


*
, 21ED4
*
, 29ED4

2014

4

Đ
ồng Tháp

5

11ED4
*
, 12ED4
*
, 31ED4, 3
4ED4

2014

5

Ti
ền Giang

4



Ghi chú: kí hiệu đầu tiên là số thứ tự chủng phân lập, kí hiệu tiếp theo là tên vi khuẩn và năm phân
lập, kí hiệu tiếp theo tên viết tắt của tỉnh; * là các chủng được chọn giải trình tự khảo sát sự đa dạng
di truyền.
3.2 Kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa
Vi khuẩn E. ictaluri được phân trên môi trường TSA trong 48h và ủ ở 28
o
C trong tủ
ấm. Kết quả cho thấy khuẩn lạc có màu trắng đục, nhỏ, không nhân và rìa có dạng
không đồng nhất (Hình 1A). Kết quả kiểm tra tính di động của vi khuẩn trên kính
hiển vi với vật kính 100X cho thấy, vi khuẩn có khả năng di động. Kết quả nhuộm
Gram cho thấy tất, cả các chủng vi khuẩn đều không bắt màu tím xanh của thuốc
nhuộm Crystal Violet mà bắt màu đỏ của Fushin. Qua đó cho thấy các chủngvi
khuẩn phân lập được đều là Gram âm (Hình 1B). 5


(F), ống còn lại tạo điều kiện hiếu khí để kiểm tra khả năng oxi hóa (O), kết quả cho
thấy tất cả các chủng vi khuẩn đều làm đổi màu 2 ống nghiệm chứa môi trường O/F
từ màu xanh sang màu vàng.
3.3 Kết quả xác định vi khuẩn E. ictaluri dựa vào vùng “upstream” của gen
bám dính bằng PCR
Vi khuẩn phân lập được định danh bằng kỹ thuật PCR khuếch đại vùng “upstream”
của gen bám dính với cặp mồi đặc hiệu Edi_F và Edi_R. Kết quả sau phản ứng PCR
của 14 chủng vi khuẩn phân lập đều xuất hiện band ADN 470 bp (Hình 2). Kết quả
này cho thấy 14 chủng vi khuẩn phân lập được định danh bằng kỹ thuật PCR đều là
vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ.
A

B6 Hình 2. Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR dựa trên vùng “upstream”của gen bám
dính của vi khuẩn E. ictaluri (Chú giải : 1_17ED4(CT); 2_21ED4(AG);
3_20ED4(AG); 4_51ED4(TV); 5_3ED4(TV); 6_2ED4(TV).
Kết quả giải trình tự của 10 chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập nhận được từ công
ty Macrogen, Hàn Quốc. Sử dụng chương trình BLASTN để so sánh mức độ đồng
hình của trình tự các chủng vi khuẩn phân lập với trình tự của các chủng vi khuẩn
trên ngân hàng gen trên trang NCBI BLAST. Kết quả thu được cho thấy 100% các
chủng vi khuẩn phân lập đều thuộc loài Edwardsiella ictaluri. Trình tự “upstream”
của gen bám dính của các chủng vi khuẩn phân lập có tỉ lệ tương đồng cao với với
trình tự vùng “upstream” của gen bám dính của các chủng trên ngân hàng dữ liệu
NCBI là 96-99%. (Bảng 2).


ố
nucleotide
Vi khu
ẩn t
ương đ
ồng tr
ên ngân

hàng dữ liệu
S
ố truy cập

T
ỉ lệ
tương
đồng
1

17ED4(CT)

444

Edwardsiella ictaluri

strain JF0278

AB469966.1

99%


51ED4((TV)

473

Edwardsiella ictaluri

strain JCM1680

AB469968.1

99%

5

3ED4(TV)

449

Edwardsiella ictaluri

strain JF0278

AB469966.1

98%

6

2ED4(TV)


51
8

Edwardsiella ictaluri

strain JCM1680

AB469968.1

96%

9

12ED4(DT)

472

Edwardsiella ictaluri

strain JF0278

AB469966.1

96%

10

11ED4(DT)

446


Nhánh B
22
chia thành 2 nhánh nhỏ là B
221
gồm 1 chủng là 3ED4(TV) và B
222
gồm 6
chủng còn lại phân bố ở 5 tỉnh. Trong nhánh B
222
, chủng 51ED4(TV) và
42ED4(VL) lần lượt tạo thành 2 nhóm riêng với 4 chủng còn lại gồm 11ED4(DT),
17ED4(CT), 20ED4(AG), 21ED4(AG) và 4 chủng này có mối quan hệ gần nhất với
các chủng trên ngân hàng dữ liệu NCBI. Các chủng phân lập có mức tương đồng
thấp (96%) với các chủng trên ngân hàng dữ liệu NCBI 13ED4(TG), 2ED4(TV),
12ED(DT) có mối quan hệ xa với các chủng trên ngân hàng dữ liệu NCBI so với các
chủng còn lại có mức tương đồng (98-99%) thể hiện trên cây phả hệ.
Chủng 12ED4(DT) tuy được phân lập từ tỉnh nước ngọt quanh năm nhưng lại có
quan hệ gần với các chủng phân lập từ các tỉnh có những tháng nước lợ như Trà
Vinh, Tiền Giang và có quan hệ xa với các chủng phân lập từ Vĩnh Long, Cần Thơ,
An Giang và Đồng Tháp (11ED4(DT)). Hình 5. Mối quan hệ tiến hóa (cây phả hệ) của các chủngvi khuẩn
E. ictaluri được phân lập tại 6 tỉnh ĐBSCL và các chủng được so sánh trên ngân
hàng gen (B
i
). (Phương pháp Neighbor- joining, số lần giản đồ thiết lập: 1000 lần)

2

3

4

5

6

7

8

9

10

CT17ED4

1

TV51ED4

4

98,4

98,4

98,9
TV3ED4

5

98,9VL42ED4

7

97,9

96,8

97,3

97,3

96,8

97,9
TG13ED4

8

9

98,4

98,4

97,9

99,5

DT11ED4

10

97,3

97,9

97,9

98,9

98,4

96,8

96,2

97,3

Được và ctv (2013) dựa trên việc khuếch đại vùng gen 16S rRNA có kích thước
1200 bp cho thấy có sự khác biệt di truyền của 65 dòng vi khuẩn acid lactic từ các
vùng sinh thái nước ngọt, mặn, lợ ở ĐBSCL. Điều này khẳng định, các vùng sinh
thái khác nhau có ảnh hưởng tới quan hệ các dòng vi khuẩn acid lactic. Ngoài ra,
dựa trên việc vùng gen 16S rDNA, kết quả nghiên cứu Nguyễn Thị Pha và Nguyễn
Hữu Hiệp (2012) cho thấy sự khác biệt di truyền của các dòng vi khuẩn có khả năng
cố định đạm tại các huyện có vùng đất phù sa và các huyện có vùng đất nhiễm phèn
của tỉnh Đồng Tháp.

10

Trong nghiên cứu này, vi khuẩn E. ictaluri được khảo sát sự đa dạng di truyền dựa
trên vùng “upstream” của gen bám dính. Nghiên cứu của Sakai et al. (2009) cũng
dựa trên trình tự vùng gen “upstream” của gen bám dính để đánh giá sự đa dạng
dạng di truyền của các chủng vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh có thời gian phân lập
khác nhau khác nhau, kết quả cho thấy không có sự khác biệt giữa các chủng vi
khuẩn E. ictaluri. Nghiên cứu đa dạng di truyền gần đây của Bartie et al., (2012)
dựa trên kỹ thuật phân tích macrorestriction của 59 chủng vi khuẩn E. ictaluri phân
lập từ Mỹ, Việt Nam và Indonesia cho thấy có sự khác biệt di truyền giữa các chủng
vi khuẩn này với các chủng vi khuẩn phân lập từ Mỹ xếp vào một cụm trên cây phả
hệ, trong khi các chủng vi khuẩn phân lập từ Việt Nam và Indonesia chia thành một
cụm lớn và một cụm nhỏ, các chủng phân lập từ Indonesia được xếp vào cùng nhóm
với Việt Nam. Các dòng phân lập từ Việt Nam và Indonesia có mức tương đồng cao
64%, các dòng phân lập từ Mỹ có mức tương đồng thấp hơn so với 2 nhóm này.
Điều này chứng tỏ có sự khác biệt về di truyền theo vị trí và khoảng cách địa lý.
Kết quả của nghiên cứu này, mười chủng phân lập được chọn giải trình tự trong
nghiên cứu này có sự khác biệt di truyền không cao do các tỉnh nuôi ĐBSCL có vị
trí địa lý và đặc điểm tự nhiên khá giống nhau. Hơn nữa, nguồn giống mà các hộ
nuôi chọn mua từ các cơ sở ngoài tỉnh nên cá giống có thể mang mầm bệnh phân bố
từ tỉnh này sang tỉnh khác. Vùng sinh thái tỉnh Tiền Giang và Trà Vinh có vị trí tiếp

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Barrow, G.I., and R.K.A. Feltham., 1993. Cowan and Steel’s manual for
Identification of Medical bacteria. Cambridge University Press.
Bartie, K. L., Austin, F. W., Diab. A., Dickson, C., Dung, T. T., Giacomini.
M., and Crumlish, M., 2012. Intraspecific diversity of Edwardsiella
ictaluri isolates from diseased freshwater catfish, Pangasianodon
hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam.
Journal of Fish Diseases (2012), 35. 671-682.
Buller, B.N., 2004. Bacteria from Fish and Other Aquatic Animal-A Practical
Identification Manual. CABI Publishing. 353 pp.
Crumlish, M., Dung, T. T., Turnbull., J. F, Ngoc, N. T. N., and Ferguson (2002).
Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish,
Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta,
Vietnam. Journal of Fish Diseasees 2002, 25, 733-736.
Đặng Thị Hoàng Oanh và Đặng Thụy Mai Thy (2009). Nghiên cứu công trình PCR
chuẩn đoán vi khuẩn Edwarsiella ictaluri trên thận cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus). Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc năm 2009: 289-
292.
Dung, T.T., 2010. Edwardsiella ictaluri in Pangasianodon catfish: antimicrobial
resistance and the early interactions with its host. Department of Pathology,
Bacteriology and Avian Diseases Faculty of Veterinary Medicine, Ghent
University, Belgium. 136.
Frerichs, G. N., and S. D. Millar., 1993. Manual for the isolation and identification
of fish bacterial pathogent. Istitute of Aquaculture, University of Stirling,
Scotland. 60pp.
Hawke J.P., 1979. A bacterium associated with disease of pond cultured channel
catfish. Journal of the Fisheries Research Board of Canada. 36:150–1512.
Kasornchndra, J., W.A. Rogers and J.A. Plumb., 1987. Edwardsiella ictaluri from
walking catfish, Clarias batrachus L., in Thailand. Journal of Fish disease:
10: 137-138.

Trần Ngọc Được và ctv, 2013. Khảo sát tính đa dạng sinh học vi khuẩn acid lactic
phân lập tử cơm mẻ ở ba vùng sinh thái của Đông bằng Sông Cửu Long. Tạp
chí khoa học, Đại học Cần Thơ. Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công
nghệ sinh học 25(2013), 58-66.
Trần Thị Thanh Huyền, Nguyễn Thị Trung, Trương Nam Hải, 2011. Phát hiện vi
khuẩn Edwarsiella Ictaluri gây bệnh trên cá tra Việt Nam bằng Kỹ thuật
PCR. Tạp chí Công nghệ sinh học 9(1), 61-65.
Từ Thanh Dung, Crumlish, M., Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và
Đặng Thụy Mai Thy, 2004. Xác định vi khuẩn trắng gan trên cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus). Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ.
2004,137–142.
Weisburg, W. G., Barns. S. M., Pelletier D. A., and Lane D. J., Bacteriol J., 1991.
16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic study. 73: 697.
Yuasa, K., Kholidin E.B., Panigoro N., and Haiti. K., 2003. First isolation of
Edwardsiella ictaluri from cultured striped catfish Pangasius hypophthalmus
in Indonesia. Fish Pathology, 38, 181-183.