Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HOÁ HỌC
***************

Nguyễn duy công

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA CÂY CỎ NGỌT
(Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hoá Hữu Cơ

Hà Nội 2009

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
1


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Lời cảm ơn
Trước hết, em xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy

kết quả trong khoá luận này là trung thực. Các kết quả không trùng với các
kết quả đã được công bố.

Sinh viên

Nguyễn Duy Công

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
3


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Mục lục
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các hình vẽ và bảng biểu
Trang
Mở đầu.................................................................................................

1

Chương 1: Tổng quan..................................................................


1.2. Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây cỏ ngọt..............

7

1.2.1. Giới thiệu chung.....................................................................

7

1.2.2. Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học.............................

8

1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật................................................

11

1.3.1. Chọn dung môi chiết..............................................................

12

1.3.2. Quá trình chiết........................................................................

14

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
4




19

1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy, NMR).................................................................................

19

Chương 2: đối tượng và phương pháp nghiên cứu...

23

2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất..................................................

23

2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)..........................................................

23

2.1.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế......................................................

23

2.1.3. Sắc ký cột (CC)......................................................................

23

2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất......................


2.4. Hoá chất............................................................................................

25

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
5


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

2.5. Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất........................................

25

Chương 3: Kết quả và thảo luận........................................

27

3.1. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất.........................

27

3.1.1. Hợp chất 1: Stevioside............................................................

27


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Danh mục các chữ viết tắt
[]D

Độ quay cực Specific Optical Rotation

13

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

1

1

C NMR

H NMR
H-1H COSY

2D-NMR

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy
1

H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

HR-FAB-MS

High Resolution Fast Atom Bombardment Mass
Spectrometry

IR

Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

Me

Nhóm metyl

MS

Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY

Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
7


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

TLC

Hình 3.2.1.2: Phổ 1H-NMR dãn rộng của hợp chất 1

29

Hình 3.2.1.3: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1

29

Hình 3.2.1.4: Phổ 13C-NMR của hợp chất 1

30

Hình 3.2.1.5: Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của hợp chất 1

31

Hình 3.2.1.6: Phổ HSQC của hợp chất 1

35

Hình 3.2.1.7: Phổ HMBC của hợp chất 1

36

Hình 3.2.1.8: Các tương tác HMBC chính của hợp chất 1

37

Hình 3.2.1.9: Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất 1


32

Bảng 2: Kết quả phổ NMR của hợp chất 2

40

Bảng 3: Hai hợp chất phân lập được từ lá cây cỏ ngọt.

43

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
9


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Mở đầu
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, độ ẩm cao
trên 80%, lượng mưa lớn, nhiệt độ trung bình khoảng 15 đến 270C. Đó là điều
kiện rất thích hợp cho thực vật phát triển. Do vậy hệ thực vật Việt Nam vô
cùng phong phú, đa dạng với khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài
được nhân dân ta dùng làm thảo dược [7] . Điều này thực sự có ý nghĩa to lớn
cho sự phát triển của ngành y tế, ngành hoá học và một số ngành khác. Hệ
thực vật phong phú trên được coi như là tiền đề cho sự phát triển ngành hóa
học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta.
Từ ngàn xưa, ông cha ta đã sử dụng nhiều phương thuốc dân gian từ cây

Do đó tôi đã chọn đề tài cho khoá luận tốt nghiệp là:
“Nghiên cứu thành phần hoá học của cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana
(Bertoni) Hemsley)”.
Luận văn này tập trung nghiên cứu thành phần hoá học từ lá cây cỏ
ngọt bao gồm những nội dung chính là:
1. Sử dụng các phương pháp chiết và sắc ký để phân lập được các
stevioside sạch từ cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley).
2. Sử dụng các phương pháp hoá lý kết hợp để xác định cấu trúc hoá học
của các hợp chất đã phân lập được.

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
11


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan
1.1. Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây cỏ ngọt.
1.1.1. Thực vật học.[7]
Tên khoa học: Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley.
Hä: Cóc (Asteraceae).

Hình 1.1: Cây cỏ ngọt và hoa của cây cỏ ngọt.
Cây thảo nhỏ, sống nhiều năm, cao 0,5 – 0,6 m và có khi cao tới 1 m.
Thân cứng mọc thẳng, có rãnh dọc và nhiều lông mịn, ít phân nhánh.
Lá mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn dài

cỏ ngọt có tác dụng làm đường huyết giảm rõ rệt ở thỏ, chuột cống trắng và
bệnh nhân mắc bệnh đái tháo đường.
1.1.4.2. Tác dụng giãn mạch: Steviosid có tác dụng làm giãn tĩnh
mạch toàn thân rõ rệt.
1.1.4.3. Tác dụng trên thận và huyết áp: thành phần steviosid trong lá
cây cỏ ngọt có tác dụng làm tăng lưu lượng huyết tương qua thận (RPF), tăng
tốc độ lọc cầu thận (GFR), hạ huyết áp, tăng bài niệu và tăng thải trừ natri.
1.1.4.4. Tác dụng tránh thai: Nghiên cứu của PLANAS (năm 1968)
đã thông báo , cho chuột cống trắng cái và đực uống nước có 5% cao cỏ ngọt
thấy có tác dụng ngừa thai. Nhưng trong những năm 70, bốn nhóm thực
nghiệm độc lập, không xác nhận tác dụng này.

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
13


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

1.1.4.5. Tác dụng kháng khuẩn: Cao lá cỏ ngọt có tác dụng đối với
Pseudomonas aeruginosa và Proteus vulgaris. Chưa thấy tài liệu công bố về
tác dụng trên các vi khuẩn Streptococcus inutans, Lactobacillus plantarum và
Lactobacillus casei là những vi khuẩn có liên quan đến quá trình sún răng ở
trẻ em, vì hiện nay có dùng steviosid thay thế đường trong chế biến bánh kẹo.
1.1.4.6. Liều dùng an toàn ở người: Nồng độ steviosid trong một số
nước giải khát ở Nhật Bản là 0,005 – 0,007%. Nếu một ngày uống 1 lit thì
lượng steviosid đưa vào cơ thể là 0,05 – 0,07g tương ứng với khoảng 1g lá cỏ

- Độ thanh thải steviosid cao hơn độ thanh thải inulin, chứng tỏ
steviosid còn bị thải trừ qua niêm mạc của ống thận.
- Ngoài ra, steviosid cong gây bài niệu tăng thải natri niệu và làm tăng
độ thanh thải của paraaminohippuric.
c. Tiêm dưới da cho chuột cống trắng với liều 1,5g/kg, kết quả thấy:
- Những thay đổi giống thí nghiệm trên là tăng nồng độ urê và
creatinin trong huyết thanh, thấy glucose trong nước tiểu.
- Ngoài ra về tổ chức bệnh học, thấy có biến đổi hình thái ở tế bào
niêm mạc ống lượn gần. Những tổn thương này là do hoạt động của 2 enzym
phosphatase kiềm và gama-glutamyl-transpeptidase tăng lên. Những enzym
này khu trú chủ yếu ở điểm bàn chải của tế bào ống lượn gần.
1.1.4.10. Khả năng gây đột biến:
a. Nhiều thí nghiệm nghiên cứu khả năng gây đột biến trên các chủng
Salmonella typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1538 và TM 677,
hoặc trên chủng Escherichia coli WP2 đều xác định cao cỏ ngọt, steviosid và
steviol là aglycon của steviosid không gây đột biến.
b. Có nghiên cứu cho biết một số chất chuyển hoá của steviosid lại có
thể gây đột biến. Mặc dù steviosid không bị chuyển hoá trong cơ thể và thải
trừ nguyên vẹn qua nước tiểu. Song người ta lo ngại một số tạp khuẩn vùng
màng tràng có thể phân giải được steviosid.
1.1.5. Tính vị, công năng. [7]

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
15


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


16


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Cây cỏ ngọt từ lâu đã được sử dụng như là một chất tạo ngọt tự nhiên
không chứa calo.Các nghiên cứu về thành phần hoá học của cây cỏ ngọt đã
được tiến hành từ lâu và đã xác định thành phần chính tạo ra vị ngọt là các
đitecpen glycosit trong đó chủ yếu là stevioside và các dẫn xuất kauran
ditecpen tương tự. Hàm lượng stevioside trong cỏ ngọt là 3 – 20% tuỳ theo
giống và các điều kiện trồng trọt, thu hoạch.
Hợp chất stevioside có độ ngọt gấp 300 lần so với đường sucrose và tập
trung chủ yếu ở phần lá cây. Nghiên cứu về hàm lượng các chất stevioside
trong cỏ ngọt đầu tiên được công bố năm 1955: stevioside (5-10% trọng
lượng khô), rebaudioside A (2-4%), rebaudioside C (1-2%) và dulcoside A
(0,4-0,7%) [26]. Sau đó một nhóm nghiên cứu Nhật Bản đã phân lập và xác
định cấu trúc của stevioside, rebaudioside A, rehbaudioside B và
steviobioside bằng các phương pháp phổ [13]. Về sau các hợp chất này cũng
được phân lập bởi các nhóm nghiên cứu khác trên thế giới [12, 16, 21].
1.2.2. Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học.
1.2.2.1. Một số hợp chất khung kauran ditecpen

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
17




K31C- Khoa Hoá học
18


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

HO

O

CH2OH

OH

OH

OH
R

OH
OH

Sterebin D: R = H
Sterebin C: R = OH
Sterebin B: R = acetoxy

Sterebin G


K31C- Khoa Hoá học
19


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Các labdan diterpen gồm: jihanol, austroinulin, acetylaustroinulin.
1.2.2.3. Hoạt tính sinh học.
Các hợp chất đitecpen này được biết đến có nhiều hoạt tính sinh học rất
hấp dẫn. Về độc tính khi được dùng làm chất tạo ngọt, stevioside có độ độc
rất thấp khi nghiên cứu trên chuột thí nghiệm với liều lượng LD50 khoảng 10
g/kg thể trọng [25].
Dịch chiết cũng như các chất tách được từ cỏ ngọt có tác dụng mạnh
trong việc điều khiển quá trình chuyển hoá glucozơ và insulin trong cơ thể.
Theo Chen và cộng sự, stevioside với liều 0,5 mg/kg làm giảm lượng đường
glucozơ trong máu đồng thời hạn chế sự kháng insulin ở chuột bị tiểu đường
[4]. Tác giả Ferreira cũng chỉ ra rằng dịch chiết nước cỏ ngọt (20 mg/kg/ngày)
cũng có tác dụng làm ức chế quá trình chuyển hoá glucozơ trong gan trên
chuột thí nghiệm [8]. Trước đó vào năm 1986, Curi đã thử nghiệm tác dụng
của dịch chiết nước cỏ ngọt trên một nhóm người tình nguyện. Kết quả cho
thấy với dịch chiết 5 g lá dùng liên tục trong 3 ngày, hàm lượng đường
glucozơ trong huyết tương giảm rõ rệt [5]. Các nghiên cứu này mở ra khả
năng ứng dụng cỏ ngọt trong việc chữa trị bệnh tiểu đường và các bệnh liên
quan đến sự chuyển hoá glucozơ. Ngoài ra, cùng với tác dụng giảm đường
huyết, stevioside còn có tác dụng hạ huyết áp trên lô chuột bị tiểu đường [11].
Tác dụng chống ung thư và chống viêm của cỏ ngọt cũng được nghiên
cứu chi tiết trên mô hình chuột thí nghiệm gây u bằng 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA). Các hợp chất tách được từ cây này

giả đó nhận dạng được sự có mặt của quercetin-3-O-arabinoside, quercitrin,
apigenin, apigenin-4-O-glucoside, luteolin, and kaempferol-3-O-rhamnoside.
Dịch chiết methanol và etyl axetat cho thấy có khả năng diệt các gốc tự do
bằng phương pháp thử DPPH và lipid peroxidation. Nghiên cứu này chứng tỏ
cây cỏ ngọt còn là một dược liệu thiên nhiên chống oxy hoá hiệu quả [9].
1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật.
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất
có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân
cực trung bình...) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
1.3.1. Chọn dung môi chiết.

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
21


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Thông thường các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực
khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm.
Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn
thận.
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ
cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với
chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy.
Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước
khi sử dụng. Nếu chúng có lẫn các chất khác thì có thể ảnh hưởng đến hiệu


Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
22


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Methanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của
chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol
hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân
cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị
hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có nhứng đặc tính
tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
methanol trong suốt quá trình chiết [10]. Thí dụ trechlonolide A thu được từ
Trechonaetes aciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân
huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense
được chiết trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit
dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những hợp chất

trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sực và thời
gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để
điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi
có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây,
máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng
bình thuỷ tinh.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng
24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ
thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những
chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách
khác nhau.

Nguyễn Duy Công

K31C- Khoa Hoá học
24


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Như vậy tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các
lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
1.4. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ.
Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp