ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

Nguyễn Thị Hồng Thắm

NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ TẠO THIẾT BỊ
VI LƯU CHO KỸ THUẬT PCR

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY
Ngành: Vật lý kỹ thuật

HÀ NỘI - 2011


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

Nguyễn Thị Hồng Thắm

NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ TẠO THIẾT BỊ
VI LƯU CHO KỸ THUẬT PCR

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY
Ngành: Vật lý kỹ thuật

Cán bộ hướng dẫn: TS. Trần Đăng Khoa
Cán bộ đồng hướng dẫn: TS. Nguyễn Thăng Long

HÀ NỘI - 2011



thập thông tin về kỹ thuật PCR và công nghệ vi lưu cũng như những ứng dụng của
công nghệ này trong lĩnh vực y sinh để chế tạo hệ vi lưu PCR dùng cho nhân DNA. Sử
dụng phần mềm COMSOL để mô phỏng kênh dẫn vi lưu, mô phỏng quá trình truyền
nhiệt trong vật liệu và tính toán thiết kế hệ thống vi lưu. Dựa trên cơ sở thông tin mô
phỏng có được chế tạo hệ thống vi lưu bằng máy VersaLASER đặt tại phòng thí
nghiệm, Trường ĐH Công Nghệ. Tìm hiểu về quá trình gia nhiệt cho buồng phản ứng
PCR theo cơ chế Peltier.


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan bài khóa luận của tôi không sao chép các tài liệu hay công trình
của người nào khác. Tất cả những lý thuyết và tài liệu đều được trích dẫn rõ ràng ở
trang tài liệu tham khảo của khóa luận này.


Mục lục


Mở đầu
Công nghệ vi lưu ứng dụng trong rất nhiều ngành: Kỹ thuật, Vật lý, Hóa học,
Công nghệ vi chế tạo và Công nghệ sinh học. Công nghệ này đang từng bước trở thành
công nghệ mũi nhọn cho phép chế tạo những vi hệ thống sử dụng những vi thể tích
chất lỏng, (còn được biết đến với cái tên “phòng thí nghiệm siêu nhỏ tích hợp trên một
con chip” lab-on-chip). Hệ thống vi lưu bao gồm hệ phức hợp như bơm, khoang chứa,
khoang trộn, các van đóng mở có khả năng được điều khiển ... Hệ thống này có thể
được sử dụng cho một loạt ứng dụng như dẫn thuốc, in ấn và đặc biệt là ứng dụng
trong lĩnh vực sinh học phân tử như phân tích enzyme, phân tích DNA và proteomic.
Trong công nghệ sinh học đã có rất nhiều các kỹ thuật phân tích DNA như PCR,
RT-PCR là các kỹ thuật nhân gene; ngoài ra còn có các kỹ thuật lai gene như Southern
Blot, lai protein như Wertern Blot… Tất cả các kỹ thuật này nếu thực hiện sẽ cần rất

(nanosensor); (iii) Các máy nano như các phân tử protein có khả năng tự lắp ráp[2].
Trên cơ sở công nghệ nano và công nghệ sinh học, các nguyên tử hay phân tử có
thể được thiết kế và ghép lại với nhau để tạo ra một số loại linh kiện, cấu trúc nano
như chip sinh học có phạm vi ứng dụng rộng rãi trong khoa học sự sống, đặc biệt trong
y – dược. Có nhiều cách định nghĩa công nghệ sinh học nano (nanobiotechnology/
nano – biotechnology/ nanobiotech). Thuật ngữ này có thể được sử dụng để mô tả
những vấn đề chung của công nghệ nano và sinh học. Công nghệ nano sinh học cũng
có thể được xem là những ứng dụng công nghệ nano vào lĩnh vực nghiên cứu sinh học,
tìm kiếm dược phẩm và dẫn chuyển thuốc hướng đích, các vật liệu nano mới, các thiết
bị chẩn đoán, trị liệu giúp loại bỏ các thể ngoại lai khỏi cơ thể, sửa chữa tế bào và
mô…[1].
Trong tự nhiên luôn luôn tồn tại các quá trình vật thể cấu trúc ở mức độ nano. Rất
nhiều hệ thống sinh học như các virut, phức hợp protein và màng… có cấu trúc nano
và công nghệ sinh học nano chính là sự sinh trưởng của các tế bào và mô đa chức năng
ở thực vật và động vật từ một tế bào sinh vật.

2


1.1.2. Phạm vi ứng dụng của công nghệ nano sinh học

Hình 1. Phạm vi ứng dụng của công nghệ nano sinh học [14]

Trên thế giới, các bài báo khoa học về công nghệ nano xuất hiện từ giữa thập kỷ
90. Từ đó đến nay, số lượng hồ sơ đăng ký bảo hộ sáng chế trong lĩnh vực công nghệ
nano tăng rất mạnh (từ 500 hồ sơ/ năm 1998 lên 1300 hồ sơ/ năm 2000) chứng tỏ tính
hấp dẫn và giá trị ứng dụng to lớn của ngành khoa học mới mẻ này. Phạm vi ứng dụng
của công nghệ sinh học nano rất rộng, từ lĩnh vực y học, dược phẩm, sinh học, tới các
ngành công nghiệp thực phẩm và nông nghiệp.
Trong lĩnh vực sinh học, công nghệ sinh học nano được ứng dụng để nghiên cứu

thể phân hủy sinh học, trong các kỹ thuật siêu lọc.v.v… (Hình 1).

1.2. Lab on a chip, chip sinh học
1.2.1. Lab-on-chip
Đây là thuật ngữ chỉ nhiều phép phân tích xử lý mẫu DNA, tiến hành song song
và được thực hiện trên cùng một chip. Về cơ bản: chip DNA là các sensor DNA thu
nhỏ, có thể phân tích đồng thời nhiều thông số (massive parallel analysis) tức thời và
song song (Hình 2).

4


Hình 2. Mô hình một biochip [6]

1.2.2. Chip DNA / Microarray
Một thiết bị siêu nhỏ, chứa các đoạn DNA hoặc các vật liệu sinh học khác
(protein, tế bào) cho phép thực hiện song song hàng chục nghìn phản ứng phân tử trên
cùng một miếng vật liệu có diện tích khoảng 1cm.
Cấu trúc
Thiết bị thu nhỏ gồm một bề mặt chất rắn (đế) có cấu trúc & thành phần hóa học
xác định, trên đó được gắn các mẫu dò DNA (probe) là các sợi đơn (single strand)
bằng các liên kết hoá học (cộng hóa trị) hoặc vật lý (hấp phụ, đơn phân tự lắp ráp Self Asembly Monolayer - SAM). Đây là phần thụ thể sinh học của chip DNA (còn
được gọi là DNA probe arrays).

5


Các mẫu dò DNA
Gene hoặc một trình tự xác định ngắn và với số lượng từ hàng trăm đến hàng
nghìn tùy thuộc vào mục đích sử dụng của chip và là thông số quyết định độ phức tạp




Tăng độ chính xác



Dễ dàng lặp lại

Tại sao chip có thể thực hiện đồng thời hàng loạt phản ứng trong một thí nghiệm
dưới những điều kiện gần như nhau?
Câu trả lời là mỗi loại mẫu dò được định vị ở một vị trí cố định trên đế của chip
& các phân tử DNA hay RNA đưa lên bề mặt array đã đánh dấu (ví dụ, bằng
huỳnh quang) có thể được phát hiện trên máy quét. Khi chip được quét thì máy
tính sẽ chuyển số liệu thô sang kết quả có thể đọc được.

6


Nhận dạng DNA đích
•

Phương pháp quang học:
– Huỳnh quang
– Phương pháp SPR (Surface Plasmon Resonance)

•

Phương pháp nhận biết điện hóa
– Sử dụng tính chất hoạt động điện hóa (oxi hóa - khử) nội tại của các

ứng dụng trực tiếp trong các ngành y - dược để tìm kiếm dược phẩm, xác định độ an
toàn của thực phẩm & môi trường, trong quân sự để phát hiện vũ khí sinh học…
Hướng ứng dụng về kiểu gen: Kỹ thuật MicroArray có thể cho biết, nguyên nhân
lây nhiễm chính xác của bệnh nhân có triệu chứng giống cúm (như đau đầu, sốt cao và
khó thở). Bề mặt của MicroArray có thể được gắn các DNA đại diện cho các gen chỉ
xuất hiện trong những tác nhân gây bệnh chọn lọc và phòng thí nghiệm y học có thể
tách chiết và đánh dấu DNA từ mẫu mô lây nhiễm (ví dụ, từ dịch mũi của bệnh nhân).
Sự kết hợp giữa DNA của bệnh nhân với một số trình tự gen trên chip có thể cho biết
đâu là tác nhân gây bệnh. Tương tự, hiện nay nhiều chip đang được thiết kế nhằm xác
định các loại vi khuẩn than đặc biệt dùng trong khủng bố sinh học hay các mầm bệnh
khác xâm nhập vào cộng đồng.
Nghiên cứu sự biểu hiện gene: trên cơ sở xác định lượng mRNA có trong mẫu
mô. Các chip xác định trực tiếp lượng protein mặc dù rất phức tạp cũng đang được
nghiên cứu thiết kế. Các nhà sinh học tế bào thường sử dụng loại array này để thu thập
các thông tin về những protein chiếm ưu thế sau khi mô chịu tác động bởi những điều
kiện khác nhau.

1.3. Hệ thống vi lưu
Hệ thống vi lưu là một lĩnh vực mới thú vị của khoa học và kỹ thuật cho phép
phân tích kiểm soát trên quy mô rất nhỏ và thiết bị nhỏ gọn, tiết kiệm chi phí, hiệu quả
và mạnh hơn hệ thống thông thường khác.
Vi lưu đã xuất hiện vào đầu những năm 1980 và được sử dụng trong việc phát
triển DNA chip, phòng thí nghiệm trên một công nghệ vi mạch (lab-on-chip), công
nghệ vi nhiệt.v.v…

8


Hình 3. Hình ảnh thiết bị của hệ thống vi lưu


thức, đặc điểm của chất lỏng khi nó chảy trong những kênh dẫn siêu nhỏ. Sự phát triển
của công nghệ vi lưu đang góp phần tạo ra những phương pháp thí nghiệm mới trong
ngành sinh học cơ bản, ngành khoa học vật liệu và hóa lý.
Các hệ thống vi lưu gồm rất nhiều loại khác nhau tương ứng với nhiều ứng dụng
khác nhau như: những ứng dụng trong ngành công nghiệp in phun, trong pin nhiên liệu
lỏng, nghiên cứu hóa sinh, tổng hợp hóa chất, tách chiết DNA ra khỏi tế bào, phân tích
di truyền, phân tích PCR, bào chế thuốc.v.v…
Mọi hệ thống vi lưu đều được cấu thành từ những thành phần cơ bản như: máy
bơm, van, bộ trộn, bộ lọc, bộ chia… Trong ngành vi điện tử, kích thước của linh kiện
không làm ảnh hưởng đến tính năng của linh kiện, nhưng trong công nghệ vi lưu dòng
chảy trong thể tích nhỏ khác khá nhiều so với dòng chảy trong thể tích lớn hơn, điều
này có thể quan sát thấy trong thực tế đời sống. Cụ thể hơn nữa khi các thiết bị vi lỏng
điều khiển các dòng chảy trong những thể tích chỉ cỡ microlit hoặc nhỏ hơn đến cỡ
picolit thì sự khác biệt trên lại trở nên cực kỳ rõ ràng. Những thiết bị phần cứng của
các thiết bị vi lưu đòi hỏi phương pháp thiết kế và chế tạo rất khác so với những thiết
bị siêu nhỏ khác. Khi kích thước của một thiết bị hay một hệ thống vi lưu được làm
nhỏ hơn thì cách thức hoạt động của chất lỏng đột ngột thay đổi. Những hiệu ứng
không đáng kể trong quy mô lớn cũng trở nên vượt trội hơn, rõ rệt hơn trong quy mô
rất nhỏ. Đó chính là hiện tượng mao dẫn sẽ xuất hiện khi chất lỏng chảy trong những
ống có tiết diệt nhỏ hơn 1mm, nhưng hiện tượng này lại không xuất hiện khi chất lỏng
chảy trong những ống có thiết diện rất lớn [8].
Trong thời kỳ khủng hoảng về nhiên liệu của thế giới thì việc nghiên cứu và phát
triển ngành công nghệ vi lưu đang trở nên có ý nghĩa hơn. Các hệ thống vi lưu thường
có kích thước rất nhỏ, việc chế tạo ra chúng sử dụng ít nhiên liệu hơn, rẻ hơn và rất dễ
dàng chế tạo hàng loạt. Thêm nữa là các kênh dẫn trong thiết bị vi lưu chỉ có thể tích
vài nanolit, các mẫu thử cũng trở nên rất nhỏ, lượng thuốc thử sử dụng cũng rất ít, do
đó mà việc phân tích các kết quả thí nghiệm cũng trở nên dễ dàng hơn, tiết kiệm
nguyên liệu hơn.
Đến đây chúng ta có thể thấy được sự tương đồng giữa ngành công nghệ vi điện
tử và công nghệ vi lưu, đó là cố gắng tích hợp nhiều thiết bị, nhiều chức năng chỉ trên

Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy
từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên
110 °C. DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao) và
khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi
DNA. Từ đó, không cần phải thêm DNA-polymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình sao
chép DNA có thể đơn giản và tự động hơn.
Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ
Thermus aquaticus và được gọi là Taq. Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực
nghiệm PCR (5/2004). Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá

11


trình sao chép DNA, dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai
exonuclease 3’-5’. Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có cơ
chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột biến
xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể
cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA [13].
1.4.2. Sự ra đời của kỹ thuật PCR
Những phát minh cơ bản mà nếu không có chúng thì sẽ không có phát minh ra
PCR:
1) Năm 1953, Watson, Crick & Wilkens công bố công trình mô tả cấu trúc
xoắn kép và đưa ra ý tưởng sao chép của phân tử DNA (giải thưởng Nobel
1962)
- DNA gồm 4 bases, liên kết với nhau bởi các phân tử đường deoxyribose và các
gốc phosphate.

Hình 4. Thành phần cơ bản để tạo nên phân tử DNA là các mononucletide

- Hai sợi của phân tử DNA chạy ngược chiều nhau

- Năm 1984, ông đã tiến hành thí nghiệm đầu tiên thành công cùng với Klenow
Fragment
- Năm 1988, Saiki sử dụng DNA - polymerase chịu nhiệt trong phản ứng PCR
- Cùng năm 1988, Perkin Elmer- hãng đầu tiên sản xuất máy chu kỳ nhiệt tự động
(Thermocycle)
- Năm 1989, Lawyer và cs Taq tái tổ hợp trong E. coli
- Năm 1990's, thập kỷ đưa PCR vào nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi (chẩn đoán,
lập bản đồ di truyền, xác định trình tự DNA, tạo đột biến DNA in vitro...).

13


1.5. Hệ vi lưu PCR
Việc thu nhỏ kích thước của sinh học và hóa học trong phân tích của các thiết bị
công nghệ vi-điện-cơ-hệ thống (MEMS) đã đặt ra một ảnh hưởng quan trọng trên các
lĩnh vực như chẩn đoán y tế, phát hiện vi sinh vật và sinh học phân tích khác. Trong số
rất nhiều các thiết bị thu nhỏ phân tích, các chuỗi phản ứng polymerase vi mạch (PCR)
/ microdevices được nghiên cứu rộng rãi, và do đó sự tiến bộ lớn đã được thực hiện
trên các khía cạnh của vi gia trên chip (chế tạo, liên kết và đóng dấu), lựa chọn vật liệu
bề mặt, hóa học bề mặt và kiến trúc của buồng phản ứng, xử lý mẫu chất lỏng cần
thiết, kiểm soát của ba hoặc thermocycling nhiệt độ hai bước, phát hiện các sản phẩm
khuếch đại acid nucleic, tích hợp với các đơn vị phân tích chức năng chẳng hạn như
chuẩn bị mẫu, điện mao dẫn (CE), lai tạo DNA microarray, vv…

Hình 5. Sơ đồ minh họa các thiết bị vi lưu trên chip cho hệ thống phân tích DNA [12]

Trong đó bao gồm: (A) – phân loại, sàng lọc, phân tích các tế bài hoạt động
chống lại chất kích thích; (B) – ly giải tế bào; (C) – PCR và thu hồi DNA của kháng
thể đặc hiệu từ một ngăn riêng biệt.
Công nghệ vi lưu sẽ đại diện cho một công nghệ trung tâm trong nhiều hệ thống

 Âm Module
 CAD Import Module

Module

Chemical Engineering

 Khoa học Trái đất Module
 Heat Transfer Module
 Thư viện vật liệu
 MEMS Module
 RF Module
 Cấu trúc cơ Module Hình 6. Các module có sẵn trong COMSOL Multiphysics

15


Chương 2. Các phương pháp thực nghiệm

2.1. Thực hiện phản ứng PCR
2.1.1. Các thành phần tham gia phản ứng
- Sợi khuôn (DNA hoặc cDNA)
- Các mồi (oligonucleotide primers)
- DNA polymerase chịu nhiệt (Taq)
- dNTP's
- Dung dịch đệm
- Ion Mg++
2.1.2. Các bước của phản ứng PCR
- Biến tính DNA: 94-95oC, 30-60 giây
- Bắt cặp của mồi vào sợi khuôn: 40-72oC, 30-60 giây

p = pt

(2.2)

Do vậy đo áp suất chất lưu thực chất là xác định lực tác dụng lên một diện tích
thành bình. Đối với chất lưu không chuyển động chứa trong một ống hở đặt thẳng
đứng, áp suất tĩnh tại một điểm M cách bề mặt tự do một khoảng (h) xác định theo
công thức sau:
(2.3)
Trong đó:
P0 - áp suất khí quyển.
- khối lượng riêng chất lưu.
g - gia tốc trọng trường.
Để đo áp suất tĩnh có thể tiến hành bằng các phương pháp sau:
- Đo áp suất chất lưu lấy qua một lỗ được khoan trên thành bình nhờ
cảm biến thích hợp.
-

Đo trực tiếp biến dạng của thành bình do áp suất gây nên.

17


Trong cách đo thứ nhất, phải sử dụng một cảm biến đặt sát thành bình. Trong
trường hợp này, áp suất cần đo được cân bằng với áp suất thủy tĩnh do cột chất lỏng
mẫu tạo nên hoặc tác động lên một vật trung gian có phần tử nhạy cảm với lực do áp
suất gây ra. Khi sử dụng vật trung gian để đo áp suất, cảm biến thường được trang bị
thêm bộ phận chuyển đổi điện. Để sai số đo nhỏ, thể tích chết của kênh dẫn và cảm
biến phải không đáng kể so với thể tích tổng cộng của chất lưu cần đo áp suất.
Trong cách đo thứ hai, người ta gắn lên thành bình các cảm biến đo ứng suất để

(2.6)
Trong đó ∆ V, ∆ m là thể tích và khối lượng chất lưu chảy qua ống trong khoảng
thời gian khảo sát.

18


Lưu lượng tức thời xác định theo công thức:
(2.7)
Để đo lưu lượng người ta dùng các lưu lượng kế. Tùy thuộc vào tính chất chất
lưu, yêu cầu công nghệ, người ta sử dụng các lưu lượng kế khác nhau. Nguyên lý hoạt
động của các lưu lượng kế dựa trên cơ sở:
- Đếm trực tiếp thể tích chất lưu chảy qua công tơ trong một khoảng
thời gian xác định ∆ t.
-

Đo vận tốc chất lưu chảy qua công tơ khi lưu lượng là hàm của vận

tốc.
- Đo độ giảm áp qua tiết diện thu hẹp trên dòng chảy, lưu lượng là hàm
phụ thuộc độ giảm áp.
Tín hiệu đo biến đổi trực tiếp thành tín hiệu điện hoặc nhờ bộ chuyển đổi điện
thích hợp.

Phương trình Navier Stoke
Phương trình Navier-Stokes, được đặt tên theo Claude-Louis Navier và George
Gabriel Stokes, miêu tả dòng chảy của các chất lỏng và khí (gọi chung là chất lưu).
Những phương trình này thiết lập trên cơ sở biến thiên động lượng trong những thể
tích vô cùng nhỏ của chất lưu đơn thuần chỉ là tổng của các lực nhớt tiêu tán (tương tự
như ma sát), biến đổi áp suất, trọng lực, và các lực khác tác động lên chất lưu - một