ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HPLC 1200 ĐỂ PHÂN
TÍCH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG MỘT SỐ LOẠI NÔNG SẢN
THỰC PHẨM

Mã số: ĐH 2012-TN 10-05

Chủ nhiệm đề tài: TS. NGUYỄN THỊ HẢI

THÁI NGUYÊN, NĂM 2013


2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC
NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HPLC 1200 ĐỂ PHÂN
TÍCH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG MỘT SỐ LOẠI NÔNG SẢN
THỰC PHẨM
Mã số: ĐH 2012-TN 10-05
Chủ nhiệm đề tài: TS. NGUYỄN THỊ HẢI
Người tham gia thực hiện:
1.

Chủ nhiệm đề tài: TS. NGUYỄN THỊ HẢI
Người tham gia thực hiện:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

TS. Nguyễn Thị Thúy Mỵ
ThS. Nguyễn Thế Cường
Vũ Thị Ánh
Dương Thị Khuyên
Nguyễn Thị Duyên
Đỗ Bích Duệ

Xác nhận của cơ quan chủ trì đề tài
(ký, họ tên, đóng dấu)

THÁI NGUYÊN, NĂM 2013


2.2.2. Hàm lượng aflatoxin trong các mẫu lạc........................................................... 27
2.2.3. Hàm lượng aflatoxin trong các mẫu khô đỗ tương .......................................... 29
2.2.4. Hàm lượng aflatoxin trong các mẫu cám gạo .................................................. 31
2.2.5. Hàm lượng aflatoxin trong các mẫu gạo.......................................................... 32
Phần 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 34
5.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 34
5.2. KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 36


Bảng 2.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp

24

Bảng 2.2. Hệ số thu hồi của quy trình thử nghiệm

25

Bảng 2.3. Bảng so sánh kết quả thử nghiệm tham chiếu liên phòng

26

Bảng 2.4. Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô

27

Bảng 2.5. Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc

29

Bảng 2.6. Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin trong mẫu khô đỗ tương

31

Bảng 2.7. Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin trong mẫu cám gạo

32

Bảng 2.8. Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin trong mẫu gạo

A.paraciticus Aspergillus paraciticus
ADN

Acid Deoxyribo nucleic

AFB1

aflatoxin B1

AFB2

aflatoxin B2

AFG1

aflatoxin G1

AFG1

aflatoxin G1

ARN

Acid ribonucleic

AOAC

Association of Official Analytical Chemists

CS


rADTZ

recombinant aflatoxin detoxifizym enzyme

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TX

Thị xã

UV

tia tử ngoại

VCK

Vật chất khô

WHO

Tổ chức Y tế thế giới


1

Phần 1: MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu
sử dụng thiết bị sắc ký lóng HPLC 1200 để phân tích hàm lượng aflatoxin trong một
số loại nông sản thực phẩm” với mong muốn khai thác thêm ứng dụng của thiết
bị HPLC 1200 tại Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên và góp phần
vào công tác kiểm soát chất lượng sinh an toàn thực phẩm.
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Nghiên cứu ứng dụng thiết bị HPLC 1200 để định lượng aflatoxin trong
nông sản thực phẩm góp phần vào công tác kiểm soát chất lượng và vệ sinh an toàn
thực phẩm.
1.3. TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN
1.3.1. Lịch sử phát hiện Aflatoxin
Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thương rất nặng nề,
lúc đầu hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là “bệnh gà tây X”
(Turkey X disease). Sau đó, các loại gia cầm khác như vịt, gà lôi cũng bị nhiễm
bệnh và tử vong rất nhiều. Qua điều tra, người ta xác định được bệnh có liên
quan đến một loại độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra. Đến năm 1961 người ta
đã tìm ra bản chất hoá học của độc chất này là Aflatoxin do vi nấm Aspergillus
flavus và Aspergillus parasiticus. Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1,
AFB2, AFG1, AFG2. Giữa 4 loại trên thì AFB1 chiếm nhiều nhất trong nông sản
và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất (Nabil Saad,
2004) [32].
Năm 1961, các công trình nghiên cứu đã công nhận Aflatoxin được tạo ra
bởi nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây ra khối u ở gan của động
vật (Chaver Sanchehez, 1994) [27]. Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu
về độc tố Aflatoxin. Các nhà khoa học cũng đã xác định được công thức phân tử
và công thức cấu tạo của Aflatoxin.
1.3.2. Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa của các Aflatoxin
Aflatoxin gồm 4 loại là (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2), có công thức phân
tử là:


điều kiện bảo quản không tốt, sản phẩm bị sâu mọt hoặc các loài gậm nhấm đục
khoét cũng là điều kiện thuận lợi làm cho sản phẩm bị nhiễm aflatoxin. Các sản
phẩm thường có nguy cơ bị nhiễm aflatoxin cao nhất là ngô, đậu tương và hạt
bông (Nguyễn Xuân Mai, 2005) [17].
Theo Stoloff (1989) [34] ở Ai Cập có 32% số ngũ cốc và 6% số loại bột cá
đem kiểm nghiệm bị nhiễm aflatoxin từ 1-50 ppb; 8% số ngũ cốc và 16% số loại
bột cá bị nhiễm từ 201-2.000 ppb.
Ở Indonesia, người ta cũng đã điều tra phát hiện Aflatoxin ở đậu từ 404100 ppb và tỉ lệ đậu nhiễm nấm từ 60-80%, ở ngô là 5,3-291,11 ppb (Cotty,
Bayman, 1993) [28].
Theo Gayatri (2000) [29], trong 3.320 mẫu nguyên liệu có nguồn gốc động,
thực vật ở Pakistan được kiểm nghiệm đều có chứa AFB1 với hàm lượng thấp
nhất là 13 ppb và cao nhất là 78 ppb. Hầu hết các mẫu cám gạo, cám lúa mì, bột
bắp, bột cá, bột hướng dương, bột đậu nành và bột hạt bông đều có hàm lượng
AFB1 cao hơn mức khuyến cáo (20 ppb) của tổ chức FDA (Food and Drug
Administration, Hoa Kỳ).
Aflatoxin cũng có thể hiện diện trong các loại thực phẩm chế biến, đặc biệt là
các sản phẩm từ bắp. Tuy nhiên, các nhà sản xuất cũng có những phương pháp
thích hợp nhằm hạn chế tối đa loại độc tố này. Những sản phẩm từ sữa như sữa
bột, phô mai, sữa chua đôi khi cũng phát hiện có aflatoxin.
1.3.3.2. Điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của Aflatoxin
Theo Đậu Ngọc Hào (2003) [12], hầu hết các chủng A.parasiticus đều sinh
độc tố, sự sản sinh các aflatoxin do A.flavus phụ thuộc vào từng chủng, mặt khác
nó còn phụ thuộc vào điều kiện xung quanh. Sự sinh sản của aflatoxin là kết quả


5

tác động qua lại giữa genotip của chúng và các điều kiện phát triển của nó. Sự sản
sinh aflatoxin trên các chủng A.flavus thì chỉ có 73% có khả năng sinh độc tố
aflatoxin, trong đó có 23% sản sinh aflatoxin ở mức độ cao nhất, aflatoxin B1 được

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI........................................................................ 1
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI ................................................................................... 2
1.3.1. Lịch sử phát hiện Aflatoxin ............................................................................... 2
1.3.2. Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa của các Aflatoxin ........................ 2
1.3.3. Sự hiện diện và phát triển của Aflatoxin trong tự nhiên..................................... 4
1.3.4. Ảnh hưởng của aflatoxin đối với con người và động vật ................................... 5
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH AFLATOXIN ............................................. 8
1.4.1. Phương pháp vật lý hoá học .............................................................................. 8
1.4.1. Phương pháp hoá sinh học ................................................................................ 9
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ NHIỄM
AFLATOXIN Ở CÁC LOẠI NÔNG SẢN ............................................................... 10
1.5.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài................................................................. 10
1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................................... 12
1.6. CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 14
1.6.1. Cách tiếp cận..................................................................................................... 14
1.6.2. Đối tượng, địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 14
1.6.3. Nội dung nghiên cứu....................................................................................... 15
1.6.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 15
Phần 2: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................................... 20
2.1. THẨM ĐỊNH QUY TRÍNH PHÂN TÍCH AFLATOXIN ................................... 20
2.1.1. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp ................... 20
2.1.2. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn................................................... 21
2.1.3. Xác định độ lặp của phương pháp ................................................................... 22
Kết luận: Phương pháp có độ lặp đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn đánh giá của AOAC. . 23
2.1.4. Đánh giá độ đúng của phương pháp ................................................................ 23
2.2. ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐỂ PHÂN TÍCH HOÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG
MỘT SỐ NÔNG SẢN THỰC PHẨM ......................................................................... 25
2.2.1. Hàm lượng aflatoxin trong các mẫu ngô ......................................................... 25




8

- Giai đoạn 2: Đình chỉ sự tổng hợp ADN. Khi aflatoxin phản ứng với ADN
sẽ tạo ra các nhóm chức quinon và amin, từ đó phân tử có thể xen vào vòng xoắn
kép của ADN ở chỗ mà bình thường vòng xoắn mang guanin, dẫn đến việc ADN
không còn khả năng nhân đôi.
- Giai đoạn 3: Tiêu giảm sự tổng hợp ARN và ADN dẫn đến ức chế hoạt
động của ARN của chất tế bào, ARN của nhân cũng bị rối loạn.
- Giai đoạn 4: Biến đổi hình thái hạt nhận. Các aflatoxin gây ức chế các hoạt
tính enzym, dẫn đến sự rối loạn mô hạt nhân.
- Giai đoạn 5: Tiêu giảm sự tổng hợp protein. Đây là hậu quả cuối cùng và
cũng là nguy hiểm nhất gây ra ung thư biểu mô tế bào gan.
Như vậy, aflatoxin là chất gây ung thư rất mạnh, dẫn đến hình thành các
khối u với sự sai khác của tế bảo ở gan là chủ yếu sau đó đến thận và lách. Trong
một khối u có sự góp mặt đủ loại tế bào. Bên cạnh đó độc tố aflatoxin có ý nghĩa
lớn với việc nghiên cứu các đặc tính của tế bào ung thư. Đó là do giai đoạn xâm
nhập của quá trình ung thư là ngắn và cần một liều lượng nhỏ đã bắt đầu ung thư.
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH AFLATOXIN
1.4.1. Phương pháp vật lý hoá học
Phương pháp này dựa trên nguyên lý các aflatoxin dễ dàng tách khỏi mẫu
phân tích bằng các dung môi hữu cơ phân cực mạnh như cloroform, methanol,
ethanol, benzen,…
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC): Phương pháp này được sử dụng rộng
rãi để xác định hàm lượng aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960. Dung môi
sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là Chloroforin:methnol và
Chloroform:aceton. Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng
hòa tan aflatoxin. Phương pháp này có thế xác định được lượng từ 3-4.10-4µg
nhưng thiếu sự chính xác vì sai số rất cao (30-122%).
- Phương pháp sắc khí lớp mỏng hiệu suất cao (HPTLC): Phương pháp này

định aflatoxin và kháng thể đơn và đa dòng.


10

- Phương pháp ELISA trực tiếp: Dựa trên nguyên lý kháng thể đặc hiệu được
phủ trên các đĩa chuẩn độ. Phương pháp này chiếm thời gian và sai số lớn trong
cùng một mẫu phân tích do sự xâm nhập của các chất ngoại lai có trong mẫu tách.
- Phương pháp ELISA gián tiếp: Phương pháp này trải qua nhiều bước và cần
một kháng thể thứ cấp vì vậy khả năng sai số cao và chiếm nhiều thời gian.
- Phương pháp kháng thể đơn dòng: Trong phân tích ELISA. Đây là một
phương pháp phức tạp, khó thực hiện.
- Phương pháp sử dụng kit ELISA thương phẩm: Các kit ELISA được sử
dụng đơn giản, nhanh chóng và thích hợp ở lượng aflatoxin 20 ppb. Tuy nhiên hạn
chế của phương pháp này là giá bán kít còn cao chỉ phù hợp cho kiểm tra sản phẩm
xuất nhập khẩu và các chương trình giám sát aflatoxin.
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ NHIỄM
AFLATOXIN Ở CÁC LOẠI NÔNG SẢN
1.5.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Mycotoxin đã được phát hiện ra rất sớm ngay từ đầu thập niên 60. Từ khi phát
hiện ra Aflatoxin thì khoảng 15 năm sau, người ta đã phát hiện thêm 7 loại
mycotoxin khác có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe và năng suất của gia súc gia cầm.
Ngày nay con số này mỗi ngày một tăng thêm lên đến trên 300 loại độc tố
mycotoxin. Sự nhiễm độc tố nấm trong nông sản đã trở thành vấn đề toàn cầu.
Aflatoxin thường xuất hiện trong các sản phẩm nông nghiệp trên cánh đồng
trước khi thu hoạch hoặc sau khi thu hoạch nếu sản phẩm không được phơi khô
ngay hay ẩm độ trong sản phẩm cao tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển. Trong
điều kiện bảo quản không tốt, sản phẩm bị sâu bọ hoặc các loài gậm nhấm đục
khoét cũng là điều kiện thuận lợi làm cho sản phẩm bị nhiễm aflatoxin. Đôi khi
sữa, trứng, thịt cũng bị phát hiện có aflatoxin do động vật đã ăn những loại thức


ML(ppb)

Đối với ngô và các loại hạt dùng cho vật nuôi chưa trưởng
20

thành và các vật nuôi cho sữa hoặc dùng cho các mục đích
khác không được công bố; đối với thức ăn chăn nuôi ngoại
trừ ngô và bột từ hạt bông.

100

200

300

Đối với ngô và các loại hạt dùng cho giống vật nuôi (bò, lợn)
hoặc gia cầm đã trưởng thành.
Đối với ngô và các loại hạt dùng cho lợn thịt từ 100 pound
trở lên.
Đối với ngô và các loại hạt dùng cho bò giai đoạn cuối (ví dụ
vỗ béo) và đối với bột hạt bông dùng cho bò, lợn và gia cầm.
(Nguồn: Hendricks, 2002), [30]

1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Theo tác giả Nguyễn Thùy Châu và cs (2011) [3], ở Việt Nam nhiều nơi ép
dầu phộng bằng phương pháp thủ công, độ ẩm còn cao, sau đó xếp thành trồng.
Giữa các lớp bánh dầu có độ ẩm cao là môi trường thích hợp cho nấm phát triển.
Nếu kho trữ thức ăn lâu ngày không làm vệ sinh, diệt nấm thì trong không khí sẽ
có rất nhiều bào tử nấm tấn công nhanh các nguyên liệu này sinh ra nhiều độc tố


25

Hàm lượng AF
trung bình (ppb)
205

Gạo và tấm gạo

2

22

25

Đậu nành hạt

1

50

50

Cám gạo

3

29

55


5000

Bột khoai mì lát

1

40

40

Thức ăn hỗn hợp

28

105

500

Tên thực phẩm

n

Hàm lượng AF
tối đa (ppb)
600

(Nguyễn Thùy Châu,1996) [5]
Theo Đậu Ngọc Hào (1992) [15], riêng ở các trại gà giống, độc tố nấm còn
gây ra chết phôi hàng loạt, làm giảm tỷ lệ ấp nở. Theo kết quả kiểm tra 29 mẫu

Không

≤ 10

Nhóm vịt còn lại

≤ 10

≤ 20

Heo con theo mẹ 1 – 20 ngày

≤ 10

≤ 30

Nhóm heo còn lại

≤ 100

≤ 200

Vịt con từ 1 - 28 ngày tuổi

(Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2001) [1]
1.6. CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.6.1. Cách tiếp cận
- Sử dụng phương pháp nghiên cứu trực tiếp để xây dựng quy trình sử dụng
thiết bị sắc ký lỏng HPLC. Ứng dụng quy trình này để xác định hàm lượng
aflatoxin trong nông sản thực phẩm.

1.6.4.2. Nguyên lý của phương pháp
Mẫu được chiết bằng Cloroform. Dịch chiết được làm sạch bằng cột chiết pha
rắn SPE - Silicagel hoặc cột nhồi Silicagel. Dịch rửa giải được cô quay đến cạn và
được hoà cặn bằng dung môi pha động. Aflatoxin được tách bởi hệ thống sắc ký
lỏng hiệu năng cao sử dụng cột pha đảo C18 và định lượng bằng detecter UV và
RF.
1.6.4.3. Thiết bị, vật tư và hóa chất
- Thiết bị - vật tư: Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV và RF, cột
sắc ký pha đảo C18, 150mm x 4,6 mm x 5um, máy rung siêu âm, máy lắc, bơm
chân không và bộ lọc hút manifod, cột chiết pha rắn SPE silica (500mg, 3ml).
- Hoá chất: Các loại hóa chất dùng cho máy HPLC như: Methanol,
Acetonitril, Cloroform, Diclomethal, …


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

Trang

Bảng 1.1. Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của FDA

12

Bảng 1.2: Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của Bộ Y tế VN

13

Bảng 1.3: Hàm lượng AF trong một số nguyên liệu làm thức ăn gia súc ở
VN
Bảng 1.4: Quy định hàm lượng tối đa AFB 1 và AF tổng số


29

Bảng 2.6. Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin trong mẫu khô đỗ tương

31

Bảng 2.7. Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin trong mẫu cám gạo

32

Bảng 2.8. Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin trong mẫu gạo

34

DANH MỤC CÁC HÌNH
Tên hình

Trang

Hình 2.1. Sắc đồ aflatoxin ở điểm xác định LOD

21

Hình 2.2. Sắc đồ aflatoxin mẫu chuẩn

23

Hình 2.3. Đường chuẩn các aflatoxin


1.6.4.3.3. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn (linearity and Calibration curve)


18

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó
có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích.
Cách xác định:
- Đo dung dịch chuẩn độ có nồng độ thay đổi (tối thiểu 6 nồng độ khác nhau).
- Vẽ đường cong phụ thuộc giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích.
- Xác định khoảng tuyến tính.
- Xây dựng đường chuẩn (trên mẫu trắng hoặc mẫu thực).
- Giới hạn chấp nhận của đường chuẩn: 0,99 ≤ R2 ≤ 1, Trong đó R là hệ số
tương quan hồi quy
1.6.4.3.4. Độ lặp của phương pháp
Cách xác định: Mẫu phân tích có thể là mẫu chuẩn, hoặc mẫu trắng có thêm
chuẩn, tốt nhất là làm trên mẫu thử hay mẫu thử thêm chuẩn. Tiến hành thí nghiệm
lặp ít nhất 6 lần.Tính độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số
biến thiên CV theo công thức:

(

)

RSD% = CV% =

SD
X 100
X



2

10

10-1

10%

1,8

3

1

10-2

1%

2,7

4

0,1

10-3

0,1 %

3,7


8

0,00001

10-7

100ppb

15

9

0,000001

10-8

10ppb

21

10

0,0000001

10-9

1ppb

30


Tiêu chí đánh giá: Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC)
Bảng 1.6. Tiêu chí đánh giá độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau
TT

Hàm lượng
[%]

Tỷ lệ chất

Đơn vị

Độ thu hồi
(%)

1.

100

1

100%

98-102

2.

10

10-1


-4

100 ppm

90-107

-5

10 ppm

80-110

6.

0,001

10

7.

0,0001

10-6

1 ppm

80-110

8.