Chương 2
Các phương pháp chuyển gen
Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát minh để đưa gen
vào tế bào và mô động vật và thực vật. Kỹ thuật đơn giản nhất là
chuyển DNA trần bằng vi tiêm (microinjection), xung điện
(electroporation), súng bắn gen. Các phương pháp phức tạp và hiệu
quả hơn bao gồm sử dụng các phức hợp lipid-DNA (liposome),
vector virus, tế bào gốc phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn
Agrobacterium, chuyển gen bằng súng bắn gen... Tuỳ thuộc vào đối
tượng chuyển gen mà người ta lựa chọn phương pháp chuyển gen
phù hợp.
I. DEAE-dextran
DEAE-dextran là một polycation. Ðây là tác nhân hóa học
đầu tiên được sử dụng để chuyển DNA vào tế bào động vật nuôi cấy.
Trong phương pháp này, DNA ngoại lai được cho vào một
trường nuôi cấy với sự có mặt của DEAE-dextran. DEAE-dextran sẽ
kết hợp với DNA tích điện âm (Hình 2.1). Sự dư thừa điện tích
dương trong phức hợp DNA-polycation do sự đóng góp của
polycation, cho phép phức hợp này đi đến kết hợp chặt chẽ hơn với
màng tế bào tích điện âm. Sự xâm nhập của phức hợp có thể đạt
được nhờ sự nhập bào (endocytosis).
Hình 2.1: Sự kết hợp giữa DEAE-dextran và DNA
57
Phương pháp này được sử dụng thành công trong việc chuyển
DNA vào các tế bào biểu hiện nhất thời, có nghĩa là thời gian biểu
hiện ngắn chỉ vài ngày trong quá trình nghiên cứu. Tuy nhiên,
phương pháp này nói chung là không hữu ích đối với các nghiên cứu
cần sự chuyển nhiễm ổn định dựa vào sự hợp nhất của DNA ngoại
lai vào nhiễm sắc thể, hiệu quả biến nạp thấp, chỉ được sử dụng cho
một số loại tế bào và cho kết quả tốt đối với tế bào ex vivo.
Vào thập niên 1980, liposome nhân tạo đã được sử dụng để
đưa DNA vào tế bào. Lipid với toàn bộ lưới tích điện dương ở pH
sinh lý là thành phần lipid tổng hợp phổ biến nhất của liposome
được phát triển cho chuyển gen (Hình 2.3). Thường thì lipid cation
được trộn với một lipid trung tính như L-dioleoyl phosphatidyl-
ethanolamine (DOPE) (Hình 2.4). Phần cation của phân tử lipid kết
hợp với DNA tích điện âm và kết quả là chứa đầy DNA trong phức
hợp liposome-DNA (Hình 2.5). Ðối với các tế bào nuôi cấy, toàn bộ
lưới tích điện dương của phức hợp liposome-DNA nói chung là gây
ra hiệu quả chuyển gen cao hơn bởi vì nó cho phép phức hợp này kết
hợp với màng tế bào tích điện âm bền hơn. Nhờ cơ chế nhập bào,
các phức hợp xuất hiện trong endosome và sau đó đi vào nhân (Hình
2.6). Chưa rõ DNA được phóng thích từ endosome và đi qua màng
nhân như thế nào. DOPE được xem là một lipid kích thích sự dung
hợp và vai trò của nó là phóng thích các phức hợp này từ endosome
cũng như làm cho sự dung hợp của màng tế bào phía ngoài với phức
hợp liposome-DNA xảy ra dễ dàng. Trong phương pháp này, các đại
phân tử trước hết được đưa vào trong các túi phospholipid. Các loại
túi khác nhau đã được mô tả, nhưng túi một lớp mỏng là thích hợp
nhất cho chuyển gen vì chúng có tỉ lệ khoảng trống chứa nước ở bên
trong tương đối cao đối với mỗi đơn vị lipid và bởi vì chúng có tỉ lệ
59
phân phối cao hơn. Sự dung hợp của liposome với màng plasma là
một sự kiện hiếm. Hiệu quả biến nạp của phương pháp này thấp hơn
so với phương pháp vi tiêm vào tiền nhân. Các nổ lực nghiên cứu
đang được tiến hành để tìm ra các điều kiện thí nghiệm mà có thể
làm tăng sự phóng thích các phân tử đã kết nang từ con đường ẩm
bào.
Hình 2.3: Cấu trúc tổng quát của lipid cation tổng hợp
Hình 2.4: Cấu trúc của DOPE (L-diolecyl phosphatidylethanolamine)
nhìn thấy ở chuột nhắt chuyển gen đã được mô tả (Palmiter, 1982).
Ðây là kết quả biểu hiện của gen hormon sinh trưởng chuột cống ở
chuột nhắt. Từ đó đến nay đã có rất nhiều các công trình về chuyển
gen, trong đó phần lớn là các nghiên cứu hiệu quả của gen vi tiêm
với sự sinh trưởng của động vật có vú và bệnh học.
Nguyên tắc của phương pháp vi tiêm là một lượng nhỏ DNA
được tiêm trực tiếp vào nhân tế bào phôi trần hoặc tế bào nguyên
vẹn một cách cơ học dưới kính hiển vi. Phương pháp này cho phép
đưa gen vào đúng vị trí mong muốn ở từng tế bào với hiệu quả tương
đối cao.Tuy nhiên do đòi hỏi phải tinh vi, tỉ mỉ và cực kỳ chính xác
nên hạn chế số lượng tế bào vi tiêm và ngoài ra còn có thể làm tổn
thương đến tế bào phôi do tác nhân cơ học gây ra khi tiến hành vi
tiêm.
Ðể biến nạp gen vào tế bào bằng phương pháp vi tiêm trước hết
phải chế tạo kim tiêm và kim giữ. Kim được tạo ra từ những ống
thuỷ tinh dẻo capillar đường kính 0,1-1,5 mm có sợi bằng wolfram
mảnh ở trong nhờ hệ thống thiết bị làm kim. Hệ thống này gồm có
máy kéo kim tự động (pipette puller), máy mài kim và máy gia cố
kim.
62
Hình 2.7: Vi tiêm gen ngoại lai vào tiền nhân của trứng thụ tinh
Ðể tạo kim tiêm trước hết phải tạo ra đầu kim nhọn nhờ máy
kéo kim. Sau đó sử dụng máy gia cố để cắt đầu nhọn của ống
capillar sau khi kéo tạo ra mũi kim tiêm có đường kính thích hợp.
Ðường kính bên trong mũi kim tiêm tuỳ thuộc vào loại tế bào
chuyển gen. Ðối với trứng tiền nhân động vật có vú có đường kính
khoảng 70 µm thì đường kính của kim tiêm khoảng 0,75 µm là thích
hợp, đối với phôi cá một tế bào đường kính của kim tiêm là khoảng
3-4 µm. Cuối cùng đưa kim lên máy mài để làm sắc nhọn và trơn
láng đầu kim (Hình 2.8).
đặc hiệu. Các vi khuẩn sống sót được sinh trưởng trong môi trường
dinh dưỡng thích hợp và plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển sẽ
được sao chép mỗi khi tế bào vi khuẩn phân chia. Sau đó, hàng triệu
bản sao của plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển được tách chiết từ
các tế bào vi khuẩn này và các đoạn gen chuyển được tách ra từ
plasmid tái tổ hợp nhờ sử dụng enzym hạn chế. Ðể
Hình 2.9: Máy vi thao tác Olympus (Hãng Narishige)
1. Kính hiển vi soi ngược 2. Máy vi điều chỉnh
tinh sạch, gen chuyển được điện di trên gel agarose. Hoà tan gen
chuyển trong dung dịch đệm đặc trưng (như dung dịch Tris-EDTA;
dung dịch TE...) và tính nồng độ dung dịch gen chuyển nhờ quang
phổ kế. Nồng độ dung dịch DNA sử dụng cho vi tiêm thường là 1-5
µg/ml. Trước khi chuyển vào phôi, gen chuyển được kiểm tra sự
biểu hiện trong các tế bào nuôi cấy bằng sự chuyển nhiễm
(transfection).
Vi tiêm được tiến hành qua các bước: nạp gen vào kim tiêm
bằng phương pháp capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gen
khoảng 10-12 giờ) hoặc bơm trực tiếp dung dịch gen vào, lắp kim
tiêm và kim giữ vào máy vi thao tác, chuyển trứng tiền nhân vào đĩa
65
petri có chứa môi trường được đặt dưới kính hiển vi, giữ trứng tiền
nhân vào đầu kim giữ bằng lực hút của syringe, điều chỉnh kính hiển
vi để xác định đĩa phôi và điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim
tiêm vào vị trí của trứng tiền nhân, đẩy gen vào trứng tiền nhân bằng
cách vặn nhẹ syringe. Khi thấy trứng tiền nhân hơi phồng to và trở
nên sáng hơn thì dừng lại và kéo nhanh kim tiêm ra. Trứng tiền nhân
sau khi tiêm được di chuyển xa đến cuối đĩa petri trước khi tiêm
trứng tiền nhân tiếp theo. Mỗi một nhóm trứng tiền nhân đã hoàn
thành được chuyển sang một đĩa môi trường khác để ấp và đánh giá
bằng mắt trong một vài tiếng. Sau đó tất cả các trứng tiền nhân được
V. Phương pháp chuyển gen nhờ vector virus
Vào năm 1974, lần đầu tiên các nhà khoa học phát hiện thấy
rằng, sau khi tiêm DNA của retrovirus SV40 vào khoang phôi
(blastocoel) của túi phôi chuột, DNA này có thể được tìm thấy sau
đó trong các tế bào của chuột trưởng thành (Jaenisch,1974; Jaenisch
và Mintz,1974). DNA provirus Mo-Mulv sử dụng trong các thí
nghiệm như thế này đã tích hợp vào genome và truyền lại cho thế hệ
67
sau, do đó đã tạo nên các dòng chuột ổn định (Stuhlmann, Jahner và
Jaenisch,1981). Từ đó, việc sử dụng virus làm vector cho các DNA
ngoại lai đã được phát triển.
Phương pháp này tuy thao tác hơi phức tạp nhưng có ưu điểm
là hiệu quả chuyển gen cao. Hơn nữa gen cấu trúc gắn vào vector
virus sẽ sử dụng promoter của virus, các promoter này thường có
hoạt tính cao do đó gen cấu trúc này sẽ được biểu hiện mạnh trong tế
bào chủ.
Về nguyên tắc, bất kỳ loại virus nào cũng có thể được sử dụng
làm vector để chuyển vật liệu di truyền vào trong tế bào. Nhiều
nhóm trong số đó, các papovavirus, adenovirus, retrovirus...được sử
dụng vào những mục đích chuyên biệt. Ðể sử dụng làm vector, các
phần khác nhau của genome virus được thay thế bằng gen cấu trúc
quan tâm. Virus có thể được sử dụng để lây nhiễm vào tế bào giai
đoạn sớm của phôi trước khi được chuyển ghép vào con mẹ. Gen
chuyển với vector retrovirus xâm nhập một cách hiệu quả vào hệ gen
của vật chủ nhưng virus sử dụng phải là virus an toàn, không gây
bệnh.
Các cơ thể chuyển gen sinh ra từ phương pháp này là ở dạng
khảm, có nghĩa là không phải tất cả các tế bào của cơ thể đều mang
retrovirus. Gen chuyển chỉ có thể di truyền được nếu retrovirus hợp
nhất vào một số tế bào sinh dục. Ðối với phương pháp này tỉ lệ sống
được tiến hành thông qua sự thao tác với phôi dâu và túi phôi. Phôi ở
các giai đoạn này có thể thu nhận mà không cần phẫu thuật (đặc biệt
là đối với bò), do vậy công việc chuyển gen được tiến hành rất dễ
dàng.
Phương pháp này có ý nghĩa đặc biệt đối với sự nghiên cứu
kiểm tra di truyền của các quá trình phát triển. Sự thuận lợi của nó là
cho phép tạo ra một cách chính xác các đột biến gen xác định bằng
tái tổ hợp đồng dạng.
Trong tương lai phương pháp sử dụng tế bào gốc phôi sẽ được
sử dụng rộng rãi để tạo động vật chuyển gen.
Có ba cách tạo động vật chuyển gen từ các tế bào gốc phôi
mang gen chuyển:
- Thứ nhất, phương pháp được dùng trước mắt là bơm một số
tế bào gốc phôi (khoảng 5-10 tế bào) vào trong xoang phôi
nang của tế bào động vật.
- Thứ hai, xen một số tế bào gốc phôi vào giữa bào thai thời
kỳ 8 tế bào.
- Thứ ba, nuôi cấy chung tế bào gốc phôi với phôi qua đêm.
70
Copyright: Tài liệu đại học ©