Chương 3
Các phương pháp xác định sự hiện diện
và biểu hiện của gen ngoại lai
I. Southern blot
Southern blot là một trong những phương pháp trung tâm của
Sinh học phân tử. Nó còn có tên gọi khác là Southern blotting,
phương pháp lai Southern hay phương pháp lai DNA .
Nguyên tắc của Southern blot là màng lai nitrocellulose có khả
năng tiếp nhận DNA đã được biết từ lâu và đã được sử dụng trong
các nghiên cứu lai axit nucleic khác nhau vào những thập niên 1950
và 1960. Vào thời kỳ này DNA cố định không được phân đoạn, chỉ
đơn giản bao gồm DNA tổng số được gắn trên màng lai
nitrocellulose. Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel vào đầu
thập niên 1970 đã cho phép các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn
chế có thể được phân tách dựa trên cơ sở kích thước của chúng. Từ
đó bước phát triển tiếp theo của phương pháp là chuyển các đoạn
DNA phân tách từ gel lên màng lai nitrocellulose. Phương pháp này
được E. M. Southern mô tả tại Ðại học Edingburgh vào năm 1975.
Phương pháp Southern blot đơn giản và hiệu quả. Mặc dù đã được
cải tiến nhưng phương pháp đang được sử dụng ở nhiều phòng thí
nghiệm sinh học phân tử sai khác không đáng kể so với phương
pháp ban đầu.
Southern blot bao gồm các bước cơ bản sau:
- Cắt DNA bằng enzyme hạn chế thích hợp.
- Ðiện di sản phẩm cắt trên gel agarose.
- Làm biến tính DNA (thông thường khi nó còn ở trên gel):
ví dụ có thể nhúng nó vào trong dung dịch NaOH 0.5M,
DNA sợi kép sẽ được tách thành DNA sợi đơn. Chỉ DNA
sợi đơn mới có thể chuyển lên màng lai.
94
- Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai. Thông thường

một phức hợp. Ví dụ, Southern blot có thể được sử dụng để phát
hiện một gen đặc biệt ở trong một genome nguyên vẹn.
II. Northern blot
Sau khi E. M. Southern mô tả phương pháp Southern blot vào
năm 1975, người ta đã dùng một phương pháp tương tự để xác định
các đoạn RNA đặc biệt gọi là Northern blot. Phương pháp này còn
được gọi là Northern blotting, phương pháp lai Northern hay phương
pháp lai RNA.
Northern blot bao gồm các bước cơ bản sau:
95
- RNA (RNA tổng số hoặc chỉ mRNA) được phân tách bằng
điện di trên gel agarose.
Hçnh 3.1: Så âäö mä taí phæång phaïp Southern blot
- RNA sau khi đã phân tách được chuyển lên màng lai (các
phân tử RNA giữ nguyên vị trí như ở trên gel).
96
- RNA cố định trên màng được lai với mẫu dò DNA sợi đơn
(hoặc RNA) có đánh dấu phóng xạ hoặc được gắn với một
enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase)
tạo thành phân tử lai RNA-DNA (hoặc RNA-RNA) sợi kép.
Hình 3.2: Sơ đồ mô tả phương pháp Northern blot
- Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự
ghi nếu nó được đánh dấu phóng xạ. Trong trường hợp mẫu
dò được gắn với enzyme thì đem ủ với một cơ chất không
97
màu. Enzyme liên kết với nó sẽ biến đổi thành một sản
phẩm màu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà sẽ
được phát hiện bằng phim X quang một cách trực tiếp.
Phương pháp Northern blot cho phép phát hiện sự có mặt, xác
định kích thước, trọng lượng phân tử, khối lượng mRNA ở trong các

hay nói cách khác là ở bất kỳ nơi nào có mặt protein quan
tâm.
- Ðặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện
các điểm sáng phát ra do enzyme.
Hình 3.3: Sơ đồ mô tả phương pháp Western blot
IV. ELISA (Enzymee-Linked Immunosorbent Assay)
99