TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC

LÊ THỊ LINH TRANG

NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG ĐIỀU CHẾ
CHITOSAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP
BẰNG HIDRO PEROXIT (H2O2) VÀ KHẢO SÁT
KHẢ NĂNG HẤP PHỤ ION KIM LOẠI NẶNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hóa Công nghệ môi trƣờng

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin cảm ơn thầy giáo ThS. Lê Cao Khải, cùng toàn thể
các thầy cô giáo trong khoa Hóa Học - Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2,
đã tạo điều kiện cho em được tiếp thu những kiến thức chuyên môn về hóa
học hữu cơ và công nghệ môi trường.
Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Trần Thị Ý Nhi - Viện
Hóa Học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình
hướng dẫn và truyền đạt cho em các phương pháp nghiên cứu khoa học và
những kinh nghiệm học thuật quý báu trong quá trình thực hiện khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, các anh chị tại Viện
Hóa Học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình
giảng dạy, chỉ bảo và dìu dắt em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Hà Nội, tháng 05 năm 2016
Sinh viên



DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Cấu tạo của xenlulozo, chitin, chitosan .......................................... 4
Sơ đồ 1.2: Sơ đồ điều chế chitosan................................................................. 10
Sơ đồ 1.3: Quá trình sản xuất chitin/chitosan truyền thống ........................... 10
Sơ đồ 1.4: Công thức cấu tạo của chitin/chitosan .......................................... 11
Sơ đồ 1.5: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin ........................................................ 11
Sơ đồ 1.6: Sơ đồ cơ chế phản ứng thủy phân axit liên kết glucozit của chitosan.......... 16
Sơ đồ 1.7: Cơ chế thủy phân liên kết N-axetyl (phản ứng SN2)..................... 17
Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp ................... 30
Sơ đồ 3.1: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin ........................................................ 34


BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN
Ac: CH3CO
CTS: Chitosan
DDA: Độ đề axetyl hóa
DA: Độ axetyl hóa
DMAc: N,N-đimetyl axetamit
DP: Độ polymer hóa trung bình
GlcN: D-glucosamin
GlcNAc: N-axetyl-D-glucosamin
IR: Hồng ngoại
LAB: Lactic axit bacterial

M n : Khối lượng phân tử trung bình
Me: CH3
NMR: Nuclear Magnetic Resonance - Cộng hưởng từ hạt nhân
LWC: Chitosan khối lượng phân tử thấp


5.1.1. Hấp phụ ion kim loại nặng [35]............................................................ 23
5.1.2. Hấp phụ thuốc nhuộm hoạt tính [12,21,34] ......................................... 23
5.2. Ứng dụng trong y dược [16,29] ............................................................... 24
5.3. Ứng dụng trong nông nghiệp ................................................................... 24
5.3.1. Chất kích thích sinh trưởng [11,34] ..................................................... 24
5.3.2. Chất bảo quản nông sản [17,25,32,36] ................................................ 25
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ................................................................... 26
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ....................... 26
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất............................................................................ 26
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu ................................................................. 26
2.2. Thực nghiệm: .......................................................................................... 27
2.2.1. Điều chế Chitin/chitosan: ...................................................................... 27
2.2.1.1. Điều chế chitin: .................................................................................. 27
2.2.1.2. Điều chế chitosan: .............................................................................. 28
2.2.1.3. Xác định độ axetyl hóa /deaxetyl hóa: ............................................... 29
2.2.1.4. Xác định khối lượng phân tử trung bình số của chitosan .................. 29
2.2.2. Điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp (LWC) .............................. 30
2.2.2.1. Quy trình điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp ....................... 30
2.2.2.2. Khảo sát phản ứng với điều kiện thí nghiệm khác nhau .................... 30
2.2.2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến khối lượng phân tử

 

trung bình M n của chitosan khối lượng phân tử thấp (LWC) ..................... 30
2.2.2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khối lượng phân tử
trung bình ( M n ) của chitosan trọng lượng phân tử thấp (LWC)................... 31
2.2.2.2.3. Khảo sát tính tan trong nước của chitosan trọng lượng phân tử thấp (LWC)
......................................................................................................................... 31
2.2.3. Thăm dò khả năng hấp phụ ion kim loại nặng của chitosan khối lượng


một polysaccarit với hàm lượng đứng hàng thứ hai trong tự nhiên sau
xenlulozơ, là thành phần chính của vỏ các loài động vật giáp xác như: vỏ tôm,
mai cua, mai mực… Chitin/chitosan là một polyme có nhiều tính chất đặc
biệt: Tính hòa hợp sinh học, phân hủy sinh học, tính kháng khuẩn, kháng
nấm, chống độc… Do đó được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực y học, dược
phẩm, nông nghiệp, mỹ phẩm, công nghệ môi trường…
Ở Việt Nam, giáp xác là nguồn nguyên liệu dồi dào chiếm 1/3 tổng sản
lượng nguyên liệu thủy hải sản. Trong công nghiệp chế biến thủy hải sản xuất
khẩu chiếm đến 70% - 80% công suất chế biến. Hằng năm, các nhà máy chế
biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn khoảng 70.000 tấn/năm,
chính lượng phế thải này đã gây ra hiện tượng ô nhiễm môi trường nghiêm
trọng, gây ảnh hưởng lớn đến cuộc sống và sức khỏe của người dân. Vấn đề ô
nhiễm môi trường đang là vấn đề được quan tâm và có tính toàn cầu. Sự bùng
nổ dân số cùng với tốc độ đô thị hóa, công nghiệp hóa nhanh chóng đó tạo ra
một sức ép lớn tới môi trường sống ở Việt Nam, đặc biệt là với việc nguồn
nước sinh hoạt ngày càng trở nên thiếu hụt và ô nhiễm. Một trong số những
tác nhân gây ô nhiễm nguồn nước chính là ion kim loại nặng. Ở nồng độ thấp,
các nguyên tố như Fe (II, III), Cu (II), Mn (II, VII)… là những nguyên tố vi
lượng rất cần thiết cho cơ thể. Nhưng khi ở nồng độ cao, chúng tích lũy theo
chuỗi thức ăn gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người. Một số
nguyên tố như: Cr (VI), Cd (II), As (III,V)… còn được biết đến như tác nhân
gây ung thư. Đã có nhiều loại vật liệu được sử dụng để loại bỏ ion kim loại ra
khỏi nguồn nước như: silicagel, zeolit, ligin, tảo biển, rong biển, chitosan, vật
liệu clay, bã mía, than hoạt tính, chất dẻo tổng hợp… Tuy nhiên, trong số vật
Lê Thị Linh Trang

1

Lớp: K38A - SP Hóa học


1. Giới thiệu chung [1,2,4,15,21]
Trong số các polysaccarit, chitin là nguồn tài nguyên sinh học tự nhiên
phong phú chỉ sau xenlulozơ. Chitin có cấu trúc phân tử tương tự như
xenlulozơ, mạch phân tử của chitin gồm các mắt xích N-axetyl-D-glucosamin
nối với nhau bằng liên kết (14) glycosit hay 2-axetamido-2-deoxy- -Dglucozơ. Chitosan là sản phẩm deaxetyl hoá của chitin có tên gọi là 2-amido2-deoxy - -D-glucozơ. Trong thực tế chitin, chitosan cùng tồn tại trong một
phân tử polymer, gồm các mắt xích (14)-N-axetyl-D-glucosamin và mắt
xích (14) - D - glucosamin. Khi tỷ lệ (14)-D-glucosamin nhiều hơn thì
được gọi là chitosan, ngược lại là chitin. Vì trong mắt xích: (14)-Dglucosamin có nhóm amino (-NH2) nên chitosan dễ tan trong một số dung
dịch axit loãng như axit axetic 1%, axit focmic, trong khi đó chitin hầu như
không tan trong các dung môi hữu cơ. Tính tan của chitin - chitosan trong dung
dịch axit axetic loãng tăng theo chiều tăng của tần suất xuất hiện nhóm amin
trong mắt xích phân tử. Người ta sử dụng đặc điểm này để phân biệt chitin hay
chitosan. Nếu tan trong axit axetic loãng thì gọi là chitosan, nếu không tan thì gọi
là chitin. Ngoài ra có thể phân biệt bằng giá trị độ axetyl hoá (DA), hay độ
deaxetyl hoá (DDA), DA=(1-DDA), nếu DA>50% được gọi là chitin, nếu
DA

HO
O

OH

OH

OH

OH

O

O

OH

O

O
HO

HO
O

OH

OH


O
HO
O

O

NHCOCH3
O
O

O

HO
O
NHCOCH3

OH

OH

Chitin
OH
O
HO

OH

NH2
HO
O

O

NH2

OH

O
O
OH

Chitosan
Sơ đồ 1.1: Cấu tạo của xenlulozo, chitin, chitosan
1.1. Cấu trúc tinh thể [1,2,4,31]
Chitin là một loại polisaccarit mạch thẳng với khối lượng phân tử lớn
được tạo bới mắt xích N-axetyl-D-glucozamin theo liên kết β(1→4)glucozit
như kiểu liên kết các mắt xích D-glucozo ở xenlulozo. Bằng phương pháp
nhiễu xạ tia X đã phát hiện chitin có 3 kiểu đa hình là: α, β, γ-chitin được mô
tả theo hình sau:

Chitin

Chitin

Chitin

- α-chitin: cấu trúc tinh thể mạng ghép đôi song song (một mạng lên
một mạng xuống liền nhau), α-chitin thường được tách từ vỏ cua.
- β-chitin: các mạch ghép trong tinh thể theo cách ghép song song cùng
chiều, β-chitin chủ yếu có trong mai mực nang sừng.
- γ-chitin: có mạch ghép trong tinh thể theo 2 cách, cứ 2 mạch song

theo độ lớn phân tử (SEC -Size Exclusion Chromatography) trong dung môi
DMAc/LiCl. Kết hợp các phương pháp SEC, tán xạ ánh sáng và đo độ nhớt
thì có thể xác định được chính xác khối lượng phân tử trung bình và độ phân
bố của khối lượng phân tử. Từ các số liệu thu được từ phương pháp GPC đã
khẳng định các mẫu chitin tách từ mai cua, vỏ tôm và mai mực ống có độ
polyme hóa (degree of polymeizaion - DP) nằm trong khoảng 2000 - 4000.
Chitosan tan được trong dung dịch axit loãng và khối lượng phân tử có thể

Lê Thị Linh Trang

5

Lớp: K38A - SP Hóa học


xác định theo phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép nối với cột loại trừ theo
độ lớn phân tử (SE-HPLC-size exlusion high performance liquid
chromatography). GPC-HPLC, GPC, phương pháp đo độ nhớt… cũng có thể
chuyển hóa chitosan thành chitin qua phản ứng N-axetyl hóa và khối lượng
phân tử được tính theo phương pháp GPC trong hệ dung môi DMAc/LiCl.
Trong đó phương pháp đơn giản nhất để xác định khối lượng phân tử polyme
là xác định theo phương pháp gián tiếp qua phép đo độ nhớt. Phép đo độ nhớt
không phải là phương pháp tuyệt đối để xác định khối lượng phân tử mà chỉ
là phương pháp tương đối dựa trên cơ sở độ nhớt của dung dịch polyme tăng
tỉ lệ với số lượng các phân tử thêm vào.
Phương pháp đo áp suất thẩm thấu là phương pháp dựa trên định luật
Vant-Hoff. Theo định luật này, sự phụ thuộc giữa áp suất thẩm thấu P, thể
tích V và nhiệt độ tuyệt đối T và số gam phân tử của vật chất trong dung dịch
pha loãng được biểu diễn bằng phương trình trùng với dạng phương trình của
dạng khí lí tưởng:


OH

O

O
O

OH
NH2

OH

O
NHCOCH3

DDA

DA

Trong đó, DDA = 100-DA. Đối với chitin thì DA > DDA, đối với
chitosan thì DA < DDA. Khi DA = DDA thì có chitin tan trong nước.
Tính chất của chitin cũng như chitosan phụ thuộc rất nhiều vào độ
đeaxetyl hóa (DDA) - một thông số quan trọng nhất để chỉ ra là chitin hay
chitosan. Vì vậy, việc tìm ra phương pháp xác định DDA (hay DA) một cách
chính xác và đơn giản là vấn đề rất quan trọng và cần thiết. Có rất nhiều
phương pháp đã được áp dụng để xác định DDA của chitin/chitosan như:
phân tích nguyên tố, các phương pháp phổ như phổ hồng ngoại (IR), phổ tử
ngoại (UV), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NRM): 1H-NRM,
15

bọ, tảo, nấm… Thành tế bào một số loại nấm chứa cả chitin cũng như
chitosan và được coi là nguồn chitosan tự nhiên. Chitosan được điều chế bằng
cách thực hiện phản ứng deaxetyl hóa chitin trong môi trường kiềm.
2.1. Tách chitin từ vỏ phế thải thủy hải sản [1,4,19,20]
Nguyên tắc chung để điều chế chitin là loại bỏ muối khoáng (chủ yếu là
canxicacbonat), protein và các chất màu khỏi phế liệu thủy, hải sản. Hai
phương pháp chủ yếu được áp dụng để tách chitin/chitosan là phương pháp
hóa học và phương pháp lên men vi sinh vật.
Theo phương pháp hóa học: Quá trình điều chế chitin được thực hiện
theo các bước: tách khoáng - tách protein - khử màu. Muối khoáng thường
được tách ra bằng cách xử lý nguyên liệu với dung dịch axit HCl, protein bị
thủy phân trong môi trường kiềm, chất màu được loại bỏ bằng dung môi hoặc
tác nhân oxi hóa. Trong quá trình xử lý, một số nhóm axetamit trong các mạch
đại phân tử chitin bị thay thế bởi nhóm amino do phản ứng deaxetyl hóa.
Điều chế chitin theo phương pháp hóa học có một số mặt hạn chế như
phải sử dụng một lượng lớn kiềm, axit, nước rửa do đó chi phí lớn và gây ô
nhiễm môi trường. Việc sử dụng axit và kiềm nóng dẫn đến việc cắt giảm
mạch chitin tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau.

Lê Thị Linh Trang

8

Lớp: K38A - SP Hóa học


Theo phương pháp xử lý vi sinh vật: Protein được tách khỏi vỏ các
loài giáp xác bằng cách xử lý với enzim hay vi sinh vật theo nguyên tắc: vi
khuẩn sinh ra lactic (LAB: lactic acid bacterial) tự có trong phủ tạng của vỏ
phế thải (vỏ tôm, cua, mai mực…) với một lượng rất nhỏ cùng với nguồn


OH
O

dd NaOH, to

O

OH

NHCOCH3

OH
O

OH

O
O

OH

NH2

n

O
NHCOCH3

x

Lê Thị Linh Trang

10

Lớp: K38A - SP Hóa học


3. Tính chất hóa học [1,2,5]
Công thức tổng quát của chitin là: (C8H13NO5)n
OH

OH

O

O
O

OH
NHAc

O

OH
NH2

n

m


O
NH2

n

Chitin

m

Chitosan

M = (203)n

M = (161)m

Sơ đồ 1.5: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin

Lê Thị Linh Trang

11

Lớp: K38A - SP Hóa học


Phản ứng trên thường được thực hiện với NaOH 40% ở 120oC trong
1→3h. Hiệu suất đeaxetyl hóa chỉ đạt 70%. Điều này có nghĩa là sản phẩm
phản ứng là chuỗi polyme vẫn có cả mắt xích N-axetyl-D-glucozamin đan xen
với β (1→4) glucozamin.
Để đánh giá mức độ đeaxetyl hóa của chitin người ta đưa ra khái niệm
độ đeaxetyl hóa (DDA) được tính theo công thức sau:

Quá trình depolyme hóa là quá trình phả hủy các liên kết glucozit trong
mạch đại phân tử dưới các tác nhân cắt mạch như: enzym, hóa chất chiếu
xạ…Các tác nhân cắt mạch phá hủy liên kết glucozit, chuyển hóa chitosan
thành oligome có khả năng tan trong nước cao hơn so với chitosan đại phân tử.
Có nhiều phương pháp cắt mạch chitosan như: cắt mạch bằng enzym,
cắt mạch bằng chiếu xạ, cắt mạch bằng phản ứng hóa học… Trong đó cắt
mạch bằng phản ứng hóa học là phương pháp đơn giản và được sử dụng rộng
rãi nhất.
3.4.1. Phương pháp chiếu xạ
Quy trình chiếu xạ để thủy phân chitosan:
Chitosan bột, đóng gói bằng polyetylen, được chiếu xạ với nguồn tia γ
Co60(coban), tốc độ chiếu 1,4 kGy.h-1, liều chiếu xạ từ 10-500 kGy. Chitosan
sau khi chiếu xạ được làm trương nở trong nước (100g chitosan/1 lít H2O)
trong 30 phút. Sau đó cho thêm axit axetic 1N, khuấy trong 4 giờ cho tan
hoàn toàn. Tiến hành trung hòa bằng 0,5M natribicacbonat, pH của dung dịch
là 6. Dùng H2O2 để khử màu của sản phẩm và các sản phẩm khác trong quá
trình chiếu xạ. Tiến hành phân tách: Kết tủa bằng dung dịch etanol, sau đó lọc
thu được hai dạng sản phẩm, phần kết tủa, phần nước lọc. Phần kết tủa được
rửa bằng MeOH và làm khô. Phần nước trong được cô đặc lại, kết tủa và đem
lọc thu hồi sản phẩm. Tiến hành đo độ nhớt (η) đồng thời xác định khối lượng
phân tử trung bình (

M

w

) của sản phẩm. Cơ chế của quá trình chiếu xạ:

R  H  R  C4  C6   H 
R  H  H   R  C1  C6   H 2

lượng hấp thụ được; D và Mno là khối lượng phân tử trung bình số của
chitosan ban đầu. Kết quả thu được cho thấy chitosan 8B (DDA=99%) thì
nhạy cảm hơn phương trình chiếu xạ so với 10B (DDA=90%).
Ưu điểm của phương pháp là không có dư lượng hóa chất nên có độ
tinh khiết cao. Nhược điểm là yêu cầu có thiết bị đặc biệt, hiệu quả cắt mạch
kém hơn so với phương pháp hóa học. Phương pháp chiếu xạ phù hợp cho sự
phân hủy các loại polyme khác nhau.
3.4.2. Phương pháp thủy phân bằng enzym
Có tới hơn 30 loại enzymcó thể sử dụng được để phân hủy chitin/chitosan:
chitosanaza, aminaza, hemicellulaza, cellulaza, papain, lysozyme, pepsin…
Trong dó pepsin, papain, pectinaza, có tác nhân lytic tốt hơn các loại enzym
khác và hiệu quả cắt mạch polyme cao nhất là sử dụng pectinaza. Phương
pháp thủy phân bằng enzym cho phép thu được sản phẩm có dư ít lượng hóa
chất, nên rất phù hợp với mục đích sử dụng trong y học. Tuy nhiên vấn đề mở
rộng quy trình sản xuất còn có nhiều khó khăn. Trong số các loại enzym được
sử dụng loại hemicellulaza có giá thành rẻ hơn cả.
Quá trình thủy phân bằng enzym: Chitosan được hòa tan trong dung
dịch axit axetic 1% ÷ 2% khuấy sau 3 giờ, điều chỉnh pH= 5,5. Để qua đêm,

Lê Thị Linh Trang

14

Lớp: K38A - SP Hóa học


sau đó đặt vào bể ổn nhiệt (50oC với hemixenlluloza) hay tủ ấm (37oC với
pectinaza). Cho dung dịch enzym vào, lượng enzym được tính theo lượng chất
tan (chitosan). Dừng phản ứng cắt mạch sau 3÷30 giờ (tùy từng loại enzym)
bằng cách đun sôi dung dịch phản ứng trong 10 phút để tách bỏ enzym. Tiến



Ưu điểm của phương pháp là: Phản ứng cắt mạch xảy ra mạnh nhanh,
nhưng các bước tách sản phẩm và dư lượng hoá chất thường khó triệt để.
Sự thủy phân của liên kết glucozit (depolyme hóa) và liên kết N-axetyl
của chitosan được nghiên cứu trong HCl đặc, HCl loãng. Các kết quả nghiên
cứu cho thấy, tốc độ thủy phân của kiên kết glucozit tương đương với tốc độ
đề N-axetyl hóa trong axit loãng. Trong khi đó thì liên kết glycozit được thủy
phân nhanh hơn 10 lần so với liên kết N-axetyl trong HCl đặc. Điều này có
thể giải thích bằng cách giả sử rằng, quá trình thủy phân của liên kết N-axetyl
là phản ứng SN2, trong khi thủy phân của liên kết glucozit là phản ứng SN1,
với bước làm giảm vận tốc là sự hình thành cacbocation.
H
H+

O

O
O

O

O

O
O

O

H

Sơ đồ 1.6: Sơ đồ cơ chế phản ứng thủy phân axit liên kết glucozit của chitosan
Cơ chế được chấp nhận của quá trình thủy phân liên kết glucozit (phản ứng SN1)

Lê Thị Linh Trang

16

Lớp: K38A - SP Hóa học