ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Lý do chọn đề tài
Các dạng oxy hoạt động, bao gồm các gốc tự do và các phân tử chứa oxy, có
hoạt tính oxy hóa cao như OH ., HOO., O2-,…có năng lượng cao và kém bền nên dễ
dàng tấn công các đại phân tử như lipit, ADN, protein,… sinh ra nhiều loại bệnh
như ung thư, tim mạch, tiểu đường, béo phì,… và tăng nhanh sự lão hoá. Vì vậy, để
bảo vệ sức khỏe, cần phải bổ sung các chất kháng oxy hóa để kiểm soát hàm lượng
ổn định của các gốc tự do trong cơ thể. Tác dụng kháng oxy hoá mang lại nhiều lợi
ích tốt cho cơ thể như bảo vệ sự toàn vẹn của tế bào, ngăn ngừa một số tai biến, làm
chậm quá trình lão hoá cơ thể, bảo vệ chức năng gan, hạn chế các tác nhân gây
viêm... Như vậy, việc tìm kiếm các dược liệu, định hướng nghiên cứu các hoạt chất
có khả năng kháng oxy hoá là cần thiết trong nỗ lực tìm kiếm thuốc mới phục vụ
công tác phòng và chữa bệnh cho nhân dân.
Việt Nam có nhiều dân tộc sinh sống với nhiều ngôn ngữ khác nhau. Mỗi dân
tộc có một nhóm các cây thuốc chăm sóc sức khỏe và chữa bệnh đặc thù của dân
tộc mình. Tộc người Pako và Vân Kiều là những cư dân có mặt sớm nhất ở vùng
Trường Sơn trải dài từ Quảng Nam đến Quảng Bình, nhiều nhất là ở địa bàn miền
núi Quảng Trị. Tri thức bản địa về sử dụng cây thuốc có vai trò quan trọng trong
đời sống của người dân nơi đây. Trong đó, cây Mán đỉa (Archidendron clypearia
(Jack) I.Niels) là cây thuốc đã được sử dụng trong y học dân tộc cổ truyền của
Trung Quốc và trong các bài thuốc kinh nghiệm chữa bệnh của các đồng bào dân
tộc Pako, miền Trung Việt Nam [5]. Một số công trình đã công bố cho thấy, thành
phần hóa học chủ yếu của Archidendron clypearia là các hợp chất flavonoid,
saponin, acid hữu cơ...[17], [23], [26]. Tộc người Pako,Vân Kiều và một số nơi
khác đã sử dụng Mán đỉa để điều trị các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp, viêm gan,
xơ gan, bệnh gan mật, tiêu hóa kém, viêm họng, viêm thanh quản, viêm amidan cấp
tính [5]. Theo một số tài liệu, Mán đỉa còn có tác dụng kháng nấm, kháng vi khuẩn
[38], kháng virus [14],[15],[23], tác dụng gây độc tế bào ung thư [27],[30], khả
năng kháng oxy hóa [32], [38].
Cho đến nay, ở Việt Nam mới có công trình nghiên cứu của tác giả Nguyễn
Thị Hoài về sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết metanol [5] nhưng vẫn


13

C – NMR, HSQC – NMR, HMBC – NMR,


5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài
Kết quả nghiên cứu này cung cấp thông tin khoa học đầu tiên về thành phần hóa
học và hoạt tính sinh học của cây Mán đỉa (Archidendron clypearia (Jack) I. Niels)
thu hái ở vùng rừng núi của huyện Đakrông, tỉnh Quảng Trị, Việt Nam. Các nghiên
cứu đều dựa trên các phương pháp thường quy và được xử lí số liệu thống kê.
6. Cấu trúc luận văn
Luận văn chia thành các chương sau:
Mở đầu
Chương 1. Tổng quan: Giới thiệu vài nét về họ trinh nữ, thuộc chi
Archidendron F.Mueller, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Archidendron F.
Mueller và loài Mán đĩa Archidendron clypearia (Jack) I. Niels, thành phần hóa học
và hoạt tính sinh học, tác dụng và công dụng của chi Archidendron F. Mueller và
loài Mán đĩa Archidendron clypearia (Jack) I. Niels.
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đưa ra đối tượng nghiên
cứu và sử dụng một số phương pháp nghiên cứu như xác định hoạt tính kháng oxy
hóa, định tính các nhóm chức hữu cơ bằng các phản ứng hóa học đặc trưng, tiến
hành phân lập bằng sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, xác định cấu trúc của các hợp chất
dựa trên dữ liệu các phổ.
Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận: Trình bày các kết quả nghiên cứu
bao gồm kết quả thử hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng metanol và các cao phân
đoạn, chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các cấu tử từ phân đoạn có hoạt
tính kháng oxy hóa cao nhất.
Kết luận.



(28 loài)

Enterolobium C. Martius

(1 loài)

Adenanthera C. Linnaeus (2 loài)

Leucoena J. Lamarck

(1 loài)

Albizia A. Durazzini

Mimosa C. Linnaeus

(4 loài)

(17 loài)


Archidendron F. Mueller

(18 loài)

Neptunia J. Loureiro

Calliandra G. Bentham


1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

Loài
Archidendron pellitum
(Gagn.) I. Niels
Archidendron clypearia
(Jack.) I. Niels
Archidendron tetraphyllum
(Gagn.) I. Nielsen
Archidendron quocense
(Pierre) I. Niels.
Archidendron turgidum
(Merr.) I. Niels
Archidendron bauchei
(Gagn.) I. Niels
Archidendron lucidum
(Benth.) I. Niels

Hoàng Liên Sơn, Gia Lai,
Kontum
Từ Thanh Hóa, Huế đến
Cam Ranh
Quảng Bình, Quảng Trị,
Thừa Thiên Huế.
Vĩnh Phúc, Phú Thọ

Doi bầu dục

Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hà
Tây, Hòa Bình, Thanh Hóa
Gia Lai, Kon Tum

Doi Kerr

Bắc Cạn, Thái Nguyên

Cứt ngựa

Từ Cao Bằng, Lạng Sơn,
đến Quảng Bình, Quảng
Trị, Thừa Thiên Huế.
Phú Yên, Khánh Hòa

Archidendron chevalieri
Doi Chevalier
(Kost) I. Niels.
Archidendron tonkinensis I. Doi Bắc Bộ
Niels.

Doi Đà Lạt
Gia Lai, Kontum, Lâm
(Kost.) I. Niels.
Đồng
Các loài Archidendron phân bố khắp cả nước, tập trung nhiều ở miền Bắc,

miền Trung và khu vực Tây Nguyên. Tại khu vực Quảng Trị, Thừa Thiên Huế có
thể tìm thấy một số loài như A. clypearia (Jack) I. Niels, A. bauchei (Gagn.)
I.Niels, A. lucidum (Benth.) I. Niels, A. balansae (Oliv) I. Niels, A. robinsonii
(Gagn.) I. Niels, A. poilanei (Kost.) I. Niels, A. occultatum (Gagn.) I. Niels.
1.1.4. Sơ lược về đặc điểm cây Mán đỉa – Archidendron clypearia
Cây thường thấy trong các rừng đầm lầy, rừng phủ xanh trên đất sét, rừng thưa
và các rừng hỗn giao rụng lá, vùng núi ở độ cao giữa 0 đến 1700m. Cây ưa sáng,
mọc nhanh, ưa đất chua, ưa ẩm, nảy chồi mạnh. Tái sinh hạt khỏe dưới tán rừng có
độ tán che thấp.
Ở Việt Nam, cây mọc hoang ở nhiều tỉnh phía Bắc, các tỉnh miền Trung cho
tới các tỉnh Nam bộ như Đồng Nai, Bạc Liêu, Phú Quốc, Quảng Trị, Huế...[4].
Mán đỉa thuộc loại cây nhỡ hay cây gỗ cao 10-15m, nhánh ngang, có cạnh. Lá
kép, mang 4-5 cặp cuống bậc hai, mỗi cuống bậc hai mang 3-8 đôi lá chét hình bình
hành, hình trái xoan hay hình ngọn giáo ngược, gốc hình nêm không cân đối. Đầu lá
nhọn và thường có mũi, hơi có lông mịn ở hai mặt hoặc có lông tơ ở mặt dưới.
Ra hoa vào tháng 3-4, cụm hoa chùm tán hay chùy ở ngọn, phân nhánh đến 3
lần, có lông. Các cuống mang tán gồm khoảng 10 hoa có cuống 1-3mm. Đài hình
chén hay hình phễu, tràng hình phễu hay hình chuông, ống nhị bằng ống tràng. Bầu
có lông mịn hay lông tơ.
Có quả vào tháng 6-8, quả cỡ 20 x 1 cm, dẹp, xoắn theo hình trôn ốc, màu cam
vàng ở mặt ngoài, đỏ ở mặt trong, có lông mềm hay lông tơ. Hạt hình bầu dục hay
hình cầu, có vỏ màu đen lam.




A. dulce

[29]
[31]

b. Nhóm saponin
Bảng 1.3. Các hợp chất saponin có trong chi Archidendron
Eliptoside A-J
Pitheduloside A-G
Pithelucoside A-C

A. ellipticum
A. dulce
A. lucidum

[15]
[33]
[27]

A. dulce

[36]

3-O-[beta-D-glucopyranosyl (1-2)-alpha-Larabinopyranosyl]-28-O-[beta-D-xylopyranosyl(16)-beta-D-glucopyranosyl]-echinocystic acid.
3-O[alpha-L-arabinopyranosyl (1-2)][alpha-L
arabinopyranosyl (1-6)]2-acetoamido-2-deoxybeta-D-glucopyranosyl oleanolic acid
3-O[alpha-L-arabinopyranosyl (1-2)][alpha-L

A. racemosum

Metyl panmitat
Metyl stearat

A.

[17]

Axit glucuronic

cauliflorum
A. mangense

[18]

Djenkolic axit (S,S’-

A. jiringa

[39]

và các dẫn
xuất của
acid
Hợp chất
khác

methylenebiscysteine)
Lectin
’
3-O[6 -O-palmitoyl-β-D-glucosyl]-

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của một số cấu tử đã phân lập được từ các loài
thuộc chi Archidendron F.Mueller.
Thành phần hóa học chính của chi Archidendron là flavonoid và các
saponin. Flavonoid thường có hoạt tính chống độc, tạo phức với ion kim loại, bảo
vệ chức năng gan, kháng oxy hóa tốt; còn các saponin có tác dụng chống viêm, một
số có tác dụng ức chế virus [14], [23], kháng nấm và kháng khuẩn [38]. Từ các
thành phần đó phần nào đã giải thích các tác dụng kháng oxy hóa, kháng viêm,
chống dị ứng và kháng nấm… của các loài trong chi Archidendron.
1.1.5.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Archidendron clypearia
Cây Mán đỉa mới được nhà khoa học Trung Quốc quan tâm nghiên cứu trong
vài năm trở lại đây. Cây được người dân đưa vào sử dụng làm thuốc từ lâu. Năm
2013, ở Việt Nam đã có nghiên cứu về thành phần hóa học và một số tác dụng sinh
học của cây Mán đỉa của tác giả Nguyễn Khánh Thùy Linh [8], với sự hướng dẫn
của PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài. Cho đến nay, tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa
học cũng như tác dụng sinh học cây Mán đỉa Archidendron clypearia (Jack) I. Niels
được tìm thấy không nhiều.


Qua các tài liệu tham khảo được, thành phần chủ yếu của Mán đỉa
(Archidendron clypearia) là flavonoid, saponin, acid hữu cơ...[23]. Theo tổng quan
tài liệu, các hoạt chất đã phân lập từ Mán đỉa được trình bày ở bảng 1.5.
Bảng 1.5. Một số hoạt chất phân lập được từ Mán đỉa
ST Nhóm hoạt
T
chất
1
2
3
4
5

7-O-galloyltricetifavan
7,4’-di-O-galloyltricetifavan
Myricitrin (myricetin-3-O-alpha-L-rhamnopyranoside)
Quercitrin (quercetin-3-O-alpha-L-rhamnopyranoside)
Quercetin

Acid hữu cơ
và dẫn xuất
của acid

Oleanolic acid
Ursolic acid
Acid gallic
Methyl gallate
Saponin
Alpha-amyrin
Sterol
Beta- Sitosterol
Hydrocarbon Tritriacontane

TLTK

[43]

[41]
[14]
[25]
[26]

[43]

jiringa với nồng độ ức chế tối thiểu (100mg/mL) tác dụng chủ yếu trên Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis and Microsporum gypsum, hạt của A. jiringa chứa
lectin, có khả năng ức chế các loài nấm Exserohilum turcicum, Fusarium oxysporum,
Corynespora cassicola và các loài vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans [30]. Lectin có tác dụng trên
cả vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương [21]. Vỏ cây A. racemosum chứa 3-O[alpha-L-arabinopyranosyl

(1-2)][alpha-L-arabinopyranosyl

(1-6)]-2-acetoamido-2-

deoxy-beta-D-glucopyranosyl acid oleanolic, có khả năng chống lại Trichophyton
mentogrophytes, Candida albicans và Saccharomyces cerevisiae [38].
c. Hoạt tính chống ung thư, gây độc tế bào ung thư
Với tình hình bệnh ung thư gia tăng hiện nay thì tác dụng gây độc tế bào ung
thư đang là vấn đề nhận được quan tâm của nhiều nhà khoa học. Dịch chiết metanol
của hạt A. jiringa ở nồng độ 200mg/mL được cho rằng có khả năng ức chế tối thiểu


là 30% virus Epstein-Barr [31]. A. ellipticum ở đảo Great Nicbar, Ấn Độ [36] chứa
các saponin ester elliptoside A-J có khả năng gây độc tế bào đặc biệt đối với tế bào
ung thư thận [15]. Rễ loài A. lucidum cũng có khả năng gây độc tế bào chọn lọc trên
dòng tế bào ung thư buồng trứng A2780 ở người với giá trị IC50 là 1,72 mol/l [31].
Bên cạnh các tác dụng nêu trên, các loài trong chi này còn có nhiều tác dụng
khác. Một nghiên cứu của Ibrahim cùng cộng sự cho thấy việc sử dụng trước dịch
chiết A. jiringa ở trên chuột giúp đẩy lùi các tổn thương dạ dày do etanol gây ra
[21], ngoài ra quả A. jiringa còn dùng để chữa bệnh tiểu đường, cao huyết áp, sỏi
bàng quang. Theo nghiên cứu của một số nhà khoa học ở Malaysia, quả A. jiringa
có tác dụng điều trị đái tháo đường hiệu quả, tuy nhiên nếu dùng ở liều cao có thể
gây nên phì đại và tổn thương tim, thận, gan và tuyến tụy [36]. Lá cây A.ducle có

men Cyclooxydase, hạn chế sản xuất prostaglandin - là chất trung gian gây viêm.
Kết quả phân tích HPLC còn cho thấy một thành phần trong dịch chiết
metanol Mán đỉa là Quercetin có hoạt tính ức chế sản xuất prostaglandin [18].
- Tác dụng kháng virus
Trong một nghiên cứu về 21 loại thảo dược truyền thống sử dụng ở miền N am
Trung Quốc trong hoạt động chống lại virus Herpes simplex type 1 (HSV-1) đã cho
thấy dịch chiết nước của Mán đỉa có khả năng chống lại virus Herpes simplex type 1
do có chứa nhiều chất thuộc nhóm polyphenol [14]. Bên cạnh đó, dịch chiết nước của
dược liệu này cũng có khả năng ức chế virus viêm gan B vịt trong ống nghiệm [14].
Hai dẫn xuất flavan được phân lập từ dịch chiết metanol của Mán đỉa là 7-Ogalloyltricetifavan và 7,4’-di-O-galloyltricetifavan có khả năng chống lại virus hợp
bào hô hấp (RSV), virus cúm A (H1N1), virus Coxsackie B3 (Cox B3), virus
Herpes simplex type 1 (HSV-1) với các giá trị IC 50 lần lượt là 5 và 10 µg/ml, 15,7
và 30 µg/ml, 12,5 và 25 µg/ml, 30 và 20 µg/ml [14]. Ngoài ra dịch chiết Mán đỉa
còn có Quereetin cũng có khả năng chống lại virus hợp bào hô hấp [23].
- Tác dụng chống dị ứng
Dịch chiết etanol của Mán đỉa đã được chứng minh là có tác dụng chống dị ứng
do đặc điểm giàu các chất polyphenol, bên cạnh đó còn ức chế các 2,4dinitrofluorobenzene gây ra phản ứng quá mẫn chậm. Hợp chất2(-)-epigallocatechin-7gallate, 3(-)-5,7,3’,4’,5’-pentahydroxyflavan, 5(-)-tetrahydroxyflavan-7-gallate có trong
Mán đỉa đã được chứng minh có khả năng ức chế đáng kể sự giải phóng histamin và
tham gia vào quá trình chống dị ứng [15].
1.2. Tổng quan về hoạt tính kháng oxy hóa


1.2.1. Khái niệm về chất kháng oxy hóa
Trong khoa học thực phẩm, chất kháng oxy hóa là một chất hoặc một nhóm
hợp chất có trong thực phẩm, khi hiện diện ở nồng độ thấp có khả năng làm giảm
đáng kể hoặc ngăn ngừa các tác động có hại của các loại phản ứng oxy hóa trong
chức năng sinh lý bình thường ở người [19].
Theo định nghĩa này, không phải các chất khử tham gia vào phản ứng hóa học
là chất kháng oxy hóa mà chỉ đề cập đến những hợp chất có khả năng bảo vệ các
mục tiêu sinh học chống lại quá trình oxy hóa.


Gốc tự do

Hình 1.2. Cơ chế chuyển electron của chất kháng oxy hóa.
- Cơ chế chuyển hydro:

Chuyển H
+

AH

+

.

A

Chất kháng oxy hóa

Hình 1.3. Cơ chế chuyển H của chất kháng oxy hóa.
Chất kháng oxy hóa chuyển electron hoặc hydro cho gốc tự do làm cho gốc tự
do trở nên bền [46]. Khi một phân tử gốc tự do nhận thêm một electron từ một phân
tử kháng oxy hóa, các gốc tự do trở nên ổn định và không còn khả năng gây ra hại
nữa. Ngoài ra chất kháng oxy hóa còn giúp hạn chế sự phân hủy các hydroperoxide.
1.2.3.3. Một số chất kháng oxy hóa hay sử dụng
a. Axit gallic [35]
Axit gallic thuộc nhóm axit trihydroxybenzoic (là dạng axit phenolic), là một
axit hữu cơ, danh pháp là 3,4,5- trihydroxylbenzoic axit, có trong lá chè và nhiều
loại thực vật khác. Axit gallic có thể ở cả dạng tự do hay là một phần của tannin.
O


2,6–di–tert–butyl–p–cresol;

2,6–di–tert–butyl–4–

metylphenol.
CH3 OH
H3C C
CH3

CH3
C CH3
CH3

CH3
Hình 1.6. Công thức cấu tạo của BHT


BHT được tạo thành từ phản ứng 4–metylphenol với 2–metylpropen (xúc tác:
axit sunfuric).
BHT hoạt động tương tự như là một vitamin tổng hợp, chủ yếu ngăn chặn quá
trình oxy hóa.
RO.2

+

ArOH →

RO.2


Vitamin C là một chất kháng oxy hóa rất quan trọng, giúp làm lành vết
thương, tăng sức đề kháng cho cơ thể.
Vitamin C cũng có hoạt động cùng với các chất kháng oxy hóa khác và có khả
năng tăng cường hiệu lực kháng oxy hóa của vitamin E vì vitamin C phục hồi, tái
tạo vitamin E từ dạng bị oxy hóa trong cơ thể.
Tuy nhiên, trong vài trường hợp, vitamin C gây hại cho cơ thể vì nó có thể
đóng vai trò là chất tiền oxy hóa. Đặc biệt, khi ở nồng độ cao và có các ion kim loại
chuyển tiếp (Fe3+, Cu2+), vitamin C sẽ đóng vai trò là chất tiền oxy hóa xúc tác cho
phản ứng Fenton, tạo các gốc tự do HO. và H2O2.
1.2.4. Đánh giá khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp hóa học
1.2.4.1. Đánh giá dựa vào khả năng cho electron
a. Phương pháp đánh giá qua khả năng kết hợp với Fe(II) [5]


Fe(II) ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác cho phản ứng sinh ra gốc tự do.
Khi cho Fe(II) tác dụng với thuốc thử Ferrozin sinh ra phức màu, có cực đại
hấp thụ tại bước sóng 562 nm.
Mẫu thử sẽ khóa Fe(II) vào dạng phức, không cho Fe(II) tồn tại ở dạng tự do
nên làm mất khả năng xúc tác của Fe(II).
Hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu thử sẽ được thể hiện qua việc ngăn chặn sự
tạo thành phức chất có màu của Fe(II) với thuốc thử Ferrozin.
b. Phương pháp đánh giá qua lực kháng oxy hóa tổng (Total antioxidant
capacity) theo mô hình phospho molybden [35]
Dựa trên quá trình khử Mo(VI) về Mo(V) trong môi trường axit, tạo thành
phức Mo(V) có màu xanh lá cây, độ hấp thụ quang của dung dịch sau phản ứng
được đo ở bước sóng 695 nm.
Lực kháng oxy hóa tổng được biểu diễn theo độ hấp thụ của phức tạo thành
giữa mẫu và Mo(V).
1.2.4.2. Đánh giá dựa vào khả năng cho H
a. Phương pháp đánh giá qua hàm lượng malonyldialdehyde (MDA) [40]

thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, xác
định tên khoa học là Archidendron clypearia (Jack) I. Niels.
Mẫu được thu hái tại huyện Đakrông, tỉnh Quảng Trị vào tháng 6/2013. Sau
khi thu mẫu, nguyên liệu được rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy khô ở 50 – 60 0C, sau đó


xay thành bột thô và bảo quản nơi khô thoáng.

Hình 2.1. Hình ảnh cây Mán đỉa
2.2. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Mán đỉa Archidendron clypearia
(Jack) I. Niels thu thập theo định hướng kháng oxy hóa bảo vệ gan.
2.3. Cách tiếp cận và nội dung nghiên cứu
2.3.1. Cách tiếp cận
- Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa của cao toàn phần, các cao phân đoạn
và chất phân lập được từ cây Mán đỉa Archidendron clypearia (Jack) I. Niels.
- Từ phân đoạn có hoạt tính kháng oxy hóa tốt, tiến hành phân lập các cấu tử
và xác định công thức cấu tạo của các cấu tử phân lập được.
2.3.2. Nội dung nghiên cứu
- Chiết xuất cao toàn phần metanol và các cao phân đoạn có độ phân cực tăng
dần.
- Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao toàn phần và các cao phân đoạn
+ Sàng lọc in vitro hoạt tính kháng oxy hóa bảo vệ gan của cao toàn phần và
các cao phân đoạn


+ Đánh giá khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp lực kháng oxy hóa
khử Mo(VI) về Mo(V)
+ Đánh giá khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp bắt gốc tựu do DPPH
- Phân lập và xác định công thức hóa học của một số cấu tử đã phân lập.

2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu
2.5.1.1. Lấy mẫu
- Mẫu được thu hái tại huyện Đăkrông, tỉnh Quảng Trị
- Bộ phận sử dụng: phần trên mặt đất của cây Mán đĩa (lá và cành)
2.5.1.2. Định danh
- Thu mẫu có đầy đủ các bộ phận cần thiết như cành, lá, hoa, quả.
- Làm tiêu bản mẫu khô, sử dụng để phục vụ công tác xác định tên khoa học.
- Xác định tên khoa học dựa trên phân tích hình thái thực vật, đối chiếu
với các tài liệu phân loại thực vật.
Nội dung này do TS. Nguyễn Thế Cường chuyên ngành thực vật học của Viện
Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam thực hiện.
2.5.1.3. Xử lý mẫu
Sau khi thu hái, mẫu nguyên liệu được làm sạch, phơi khô tự nhiên, sấy ở 60
0

C, sau đó xay thành bột thô và bảo quản nơi khô thoáng.

2.5.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng oxy hóa bảo
vệ gan in vitro [16], [33]
Chuột BALB/c khoẻ mạnh được sử dụng để tách tế bào gan. Gây chết chuột
bằng etanol 800, sau đó sử dụng panh, kéo mổ chuột, tách lấy gan. Gan chuột sau
khi tách được rửa bằng PBS (Phosphate Buffered Saline) có 10% kháng sinh PSF
(Penicillin-Streptomicin-Fungizone) (Invitrogen), sau đó dùng panh, kéo, kim tiêm
gạt, tách tế bào gan trong PBS. Thu dịch có tế bào gan, ly tâm, loại bỏ dịch nổi. Cao
tế bào được hoà trong NH4Cl để phá vỡ hồng cầu. Sau khi ly tâm, các tế bào thu
được hòa lại vào môi trường MEME có 10% FBS (Fetal Bovine Serum) và các
thành phần cần thiết khác. Sau khi được phân lập, tế bào gan sẽ được đưa vào đĩa
thí nghiệm 96 giếng với mật độ 1 x 104 tế bào/giếng để nuôi qua đêm trong tủ ấm

thuốc thử (nồng độ 0,6 M H2SO4, 28 mM NaH2PO4 và 4 mM (NH4)2MoO4 trong
nước cất), đậy kín và ủ 95 0C trong 90 phút. Sau đó, mẫu được làm lạnh về nhiệt độ
phòng. Độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng được đo ở bước sóng 695 nm.
Trong mẫu trắng, dung dịch cần phân tích được thay bằng nước cất. Lực kháng oxy
hoá tổng được biểu diễn theo độ hấp thụ quang của mẫu. Curcumin được sử dụng
làm chất so sánh.
Tiến hành thí nghiệm với chất chuẩn curcumin trong cùng điều kiện, theo quy
trình trên: thay 0,3mL mẫu khảo sát bằng 0,3mL chất chuẩn cùng nồng độ, thể tích


3 mL dd thuốc thử

0,3 mL mẫu

Hỗn hợp 1
Đậy kín và ủ 95 0C trong 90 phút
Làm lạnh về nhiệt độ phòng
Hỗn hợp 2
Đo quang λ = 695 nm
Mật độ quang A
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình đánh giá lực kháng oxy hóa tổng cộng theo mô hình phospho molybden

thuốc thử, phương pháp lên màu, tiến hành đo quang như sơ đồ trên, rồi lấy kết quả
mật độ quang và so sánh với kết quả của mật độ quang mẫu khảo sát.
2.5.4. Phương pháp đánh giá khả năng bắt gốc tự do DPPH in vitro [5]
Pha dung dịch DPPH nồng độ 100 µM trong metanol ngay trước khi dùng.
Hỗn hợp phản ứng 3000 µL, gồm hai thành phần: 1500 µL mẫu khảo sát pha loãng
lần lượt thành các nồng độ 100 µg/mL, 20 µg/mL, 4 µg/mL, 0,8 µg/mL và 1500 µL
DPPH, pha thành nồng độ 100 µM. Các hỗn hợp phản ứng được lắc trong 1 phút và
ủ trong bóng tối khoảng 30 phút ở 30 0C), rồi tiến hành đo quang ở bước sóng 517

khô này được đưa lên cột sắc ký, sau đó rửa giải bằng các hệ dung môi được lựa
chọn có độ phân cực tăng dần [14].
2.5.5.2. Phương pháp phân lập
Quá trình phân lập sử dụng phương pháp sắc ký cột, chủ yếu là sắc ký cột hấp
phụ và sắc ký cột lọc qua gel, sử dụng phương pháp nhồi cột ướt. Theo dõi quá
trình rửa giải bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
a. Sắc ký cột hấp phụ
Chất nhồi cột là silicagel pha thường (silicagel 60, 0,040 - 0,063mm (230-400
mesh ASTM), Merck), silicagel pha đảo YMC (silicagel 30-50 µm, FuJisilisa
Chemical Ltd.).
Nguyên tắc: Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử
trong hỗn hợp với hai pha không trộn lẫn: pha thứ nhất là chất hấp phụ đóng vai trò
pha tĩnh được nhồi trong cột thủy tinh, pha thứ hai là dung môi rửa giải cột, đóng
vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ dạng bột mịn. Đối với mỗi chất riêng biệt
trong pha hỗn hợp cần tách, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó
với dung môi rửa giải cột để lấy ra lần lượt trước hoặc sau. Có thể khai triển dung