ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ
NHIÊN
---------------------

BÙI THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT
SỐ
GLYCOSIDE TIM TRONG DƢỢC PHẨM VÀ DƢỢC LIỆU

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ
NHIÊN
---------------------

BÙI THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT
SỐ
GLYCOSIDE TIM TRONG DƢỢC PHẨM VÀ DƢỢC LIỆU

Chuyên ngành : Hoá Phân Tích
Mã số

: 60440118

Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN! ............................................................................................................1
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................3
1.1. Khái quát chung về các hợp chất glycoside tim...............................................3
1.1.1. Cấu tạo, tên gọi.....................................................................................................3
1.1.2. Tác dụng của các hợp chất glycoside tim ......................................................9
1.1.3. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng ...............................................................9
1.1.4. Tính chất của glycoside tim.............................................................................10
1.1.5. Phân bố trong tự nhiên......................................................................................12
1.1.6. Một số loại thuốc chứa glycoside tim...........................................................13
1.2. Khái quát về digoxin và digitoxin ..................................................................13
1.2.1. Digoxin .................................................................................................................14
1.2.2. Digitoxin...............................................................................................................15
1.3. Các phƣơng pháp xác định glycoside tim ......................................................15
1.3.1. Phƣơng pháp sắc kí xác định glycoside tim................................................15
1.3.2. Phƣơng pháp khác xác định glycoside tim..................................................17
1.3.3. Phƣơng pháp chiết tách các glycoside tim ra khỏi nền mẫu thực .........20
1.3.4. Phƣơng pháp định tính và định lƣợng. .........................................................21
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ................................................................................23
2.1. Mục tiêu và đối tƣợng nghiên cứu ................................................................23
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu..........................................................................................23
2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu .......................................................................................23
2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị .........................................................................24
2.2.1. Chất chuẩn............................................................................................................24
2.2.2. Hoá chất ................................................................................................................24

3.3.2. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp ............................................47
3.4. Phân tích mẫu thực tế .....................................................................................48
KẾT LUẬN ...............................................................................................................52 TÀI
LIỆU THAM KHẢO........................................................................................52 Tiếng
Việt:.................................................................................................................53 Tiếng
Anh:.................................................................................................................53


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 3.1: Phổ UV của 2 glycoside tim .....................................................................32
Hình 3.2: Sắc đồ tách các glycoside tim ở các tỉ lệ dung môi pha động khác nhau......37
Hình 3.3: Sắc đồ tách các glycoside tim ở các tốc độ dòng pha động khác nhau.....38
Hình 3.4: sắc đồ của digoxin ở điều kiện tối ƣu. ......................................................40
Hình 3.5: Sắc đồ của digitoxin ở điều kiện tối ƣu. ...................................................41
Hình 3.6: Sắc đồ tách các chất glycoside tim ở ở điều kiện tối ƣu. ..........................42
Hình 3.8: Đƣờng chuẩn của 02 glycoside tim nghiên cứu trong luận văn................45
Hình 3.9: Sắc đồ của mẫu thực .................................................................................51


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

DANH MỤC BẢNG BIỂU


RP-HPLC: Reversed-phase performance liquid chromatography
RSD: Relative standard deviation
PDA: Photo-diode - array
SD: Standard deviation
UV: Ultraviolet
UV- VIS: Ultraviolet visible


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

MỞ ĐẦU

Ra đời từ rất sớm phƣơng pháp sắc kí lỏng - lỏng đƣợc phát triển mạnh vào
cuối thế kỉ 20. Vào những năm 1970, sắc kí đƣợc phát triển mạnh và đã đạt đƣợc
những thành tựu đáng kể nhƣ tách đƣợc các hỗn hợp các chất cực kì giống nhau nhƣ các
nguyên tố đất hiếm, các ankaloid, các hydrocacbon trong các mẫu dầu.
Ngày nay rất nhiều cải tiến đã đƣợc thực hiện để nâng cao độ nhạy của
phƣơng pháp, nhƣ sử dụng pha tĩnh mới, detector có độ nhạy cao. HPLC (sắc kí lỏng
hiệu năng cao) là một kỹ thuật không thể thiếu trong phân tích để quản lí một mảng các
chất phân tích mà phƣơng pháp khác không thể đáp ứng đƣợc. Với việc áp dụng đƣợc
cho nhiều loại đối tƣợng chất phân tích, từ không phân cực nhƣ: các chất thơm PAHs,
các axit béo, các dƣợc phẩm (digoxin, gitoxin, diginatin,…), các mẫu sinh học trong
phân tích lâm sàng (theobromine, theophilline,..) đến phân cực nhƣ: axit amin,
phenol,…, phƣơng pháp RP - HPLC - UV ( RP - HPLC: sắc kí lỏng hấp phụ pha ngƣợc Reversed-phase performance liquid chromatography) có độ nhạy tốt, độ chọn lọc cao
và hiệu quả tách cao, pic cân đối. Thêm vào đó pha động thƣờng là hỗn hợp của nƣớc
và các dung môi phân cực nên rẻ tiền, kinh tế.
Đây là một phƣơng pháp rất thành công [6,7].
Glycoside tim là một nhóm chất bắt đầu đƣợc sử dụng trong y học bởi bác sĩ


Bùi Thị Tâm

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Khái quát chung về các hợp chất glycoside tim.
1.1.1.

Cấu tạo, tên gọi.

Glycoiside tim cũng nhƣ các glycosid khác, cấu trúc hóa học gồm 2 phần:
aglycon và phần đƣờng [9].
a) Phần aglycon: có thể chia làm 2 phần:
Nhân hydrocarbon và mạch nhánh (vòng lacton).
* Nhân hydrocarbon
Nhân hydrocarbon có cấu trúc steran: 10, 13-dimethyl cyclopentanoper
hydrophenanthren. Đính vào nhân này có các nhóm chức oxy.

18
11

1

17
16

19
1
2
3



Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

một số chất do bản chất tự nhiên không có nhóm OH này nhƣ các chất diffugenin,
strophanthilin A, β-anhydro-uzarigenin.
Sự oxy hóa (gắn nhóm OH hoặc carbonyl) còn có thể xảy ra thêm ở các vị trí
nhƣ 1, 5, 11, 12, 16, 19. Mức độ oxy hóa ở C-19 có thể là CH2OH, CHO, COOH. Các
chất có mức độ oxy hóa khác nhau này thƣờng cùng tồn tại trong cùng một cây. Chất Gstrophanthidin có đến 6 OH trong phần aglycon. Nhóm OH có thể bị acyl hóa ví dụ
oleandrigenin, gitalixigenin. Có trƣờng hợp các nhóm OH gần nhau tƣơng tác với
nhau để tạo nhóm chức epoxy, ví dụ adynerin. Nhóm OH ở C-11 có thể tác dụng với
COOH ở C-19 để tạo thành vòng lacton ví dụ chất sarmentosigenin E có trong
Strophanthus sarmentosus.
* Vòng lacton
Phần glycon của glycosid tim ngoài khung hydrocarbon nói trên, đặc biệt còn
có một vòng lacton nối vào vị trí C-17 của khung. Vòng lacton này đƣợc coi là mạch
nhánh.

Hầu hết các chất có tác dụng sinh học đều có vòng lacton ở hƣớng β. Một số
ít ở hƣớng α do enzym epimerase có mặt trong cây chuyển hóa mà thành. Có hai loại vòng
lacton: loại thứ nhất có 4 carbon với một nối đôi ở vị trí α-β, những aglycon nào có
vòng lacton này thì có 23 carbon và đƣợc xếp vào nhóm

4


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

(xa aglycon) [9].
Dƣới đây là tên gọi, công thức cấu tạo của một số glycoside tim.
Bảng 1.1: Tên gọi, công thức cấu tạo của một số glycoside tim [21]
TT

Tên gọi

Công thức cấu tạo

M
(g/mol)

584
1

2

G -strophathin

872

Kstrophanthoside

550
3

Convallatoxin

4



Digitoxin

9

Lanatoside A

969

985
10

Lanatoside B

7


Luận văn thạc sĩ

11

Lanatoside C

12

Gitoxin

Bùi Thị Tâm

985

digoxin và digitoxin. Ở liều điều trị có tác dụng cƣờng tim, làm chậm nhịp tim và điều
hòa nhịp tim. Các tác dụng trên đƣợc gọi là tác dụng theo quy tắc 3R của Potair:
Renforcer

= cƣờng.

Ralentir

= chậm .

Regulariser = điều hoà.
Nếu quá liều sẽ gây nôn làm chảy nƣớc bọt, mờ mắt, tiêu chảy, yếu các cơ,
loạn nhịp tim, và có thể gây tử vong. [9, 21].
Glycoside tim còn đƣợc gọi là glycoisid digital vì glyciside của lá cây
Digitalis đƣợc dùng đầu tiên trên lâm sàng để chữa bệnh tim [9].
1.1.3.

Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng

Phần quyết định tác dụng lên tim của glycosid tim là phần aglycon bao gồm
nhân steroid và vòng lacton chƣa bão hòa. Cả hai phần đều quan trọng:
- Nếu vẫn giữ vòng lacton nhƣng thay nhân steroid bằng nhân benzen,
naphtalen… tác dụng lên tim sẽ mất.
- Nếu vẫn giữ nguyên nhân steroid mà thay đổi vòng lacton nhƣ: bão hòa nối
đôi, mở vòng, thay vòng lacton bằng vòng lactam thì tác dụng mất hoặc giảm đi rất
nhiều.
Sự hấp thu qua dạ dày, tá tràng, ruột, phụ thuộc vào số lƣợng nhóm OH của
phần aglycon, nói cách khác là phụ thuộc vào tính ái dầu của nó. Digitoxin dễ hấp thu
qua đƣờng tiêu hóa, tái hấp thu qua thận, gan và có tính tích lũy trong cơ thể vì aglycon
(digitoxigenin) chỉ có 2 nhóm OH. Ouabain có nhiều nhóm OH tự do trong phần aglycon

Glycosid tim là những chất kết tinh đƣợc, một số ở dạng vô định hình hoặc
lỏng sánh. Đa số không mầu, một số có màu (anthraglycosid đỏ, da cam flavonoid
glycosid màu vàng). Chúng có vị đắng, có năng suất quay cực.
Độ tan: Phụ thuộc vào mạch đƣờng dài hay ngắn và các nhóm ái nƣớc trong
phần aglycon. Glycosid thƣờng tan trong nƣớc, ROH, hỗn hợp cồn - nƣớc,..Tan ít trong
Clorofom,…không tan trong dung môi hữu cơ phân cực kém nhƣ :ether,
benzen,…
* Tính chất hoá học

10


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

Glycosid tim có đƣờng 2-desoxy sẽ rất dễ bị thủy phân khi đun với acid vô
cơ 0,05N trong methanol 30 phút, trong khi những glycosid khác trong điều kiện đó khó
bị thủy phân.
Glycosid tim dễ bị thủy phân bởi các enzym. Các enzym, thƣờng có sẵn
trong cây, có khả năng cắt các đơn vị đƣờng cuối mạch (xa aglycon) thƣờng là glucose
để chuyển thành các glycosid thứ cấp nhƣ enzym digilanidase trong lá Digitalis
lanata, digipurpidase trong lá Digitalis purpurea, strophanthobiase trong hạt
Strophanthus courmontii, scillarenase trong Urginea maritima.
Vòng lacton 5 cạnh hay 6 cạnh dễ bị mở bởi tác dụng của kiềm rồi tạo thành
dẫn xuất iso không tác dụng. Dƣới đây là cơ chế tạo thành dẫn xuất iso của nhóm
cardenolid [9].

Vòng lacton 5 cạnh còn phản ƣƣng với các dẫn chất nitro (thơm), tạo các sản
phẩm mau dùng để điṇ h tinh, Glycosid tim + nitro (thơm) (OH‾) màu. Ví dụ:

Màu đỏ tía

NO
2

NO2

Glycosid tim +

OH
NO2

- Phản ứng Legal:

NO2

NaOH

màu cam
Gl
yc
osi
d
ti
m
+
Na
2{F
e(
C


yxo

t
ự

cánh

se,

cứng

allo

n
h
i
ê
n

Chryso

se,

lina

ribo

spp.


tổng

loại

hợp

bọ

thành

nói

glycosi

trên

d tim.

[9].

Ngƣời ta tìm thấy
glycosid tim trong các họ
thực vật: Apocynaceae,
Asclepiadaceae,
Celastraceae, Clusiaceae,
Euphorbiaceae,
Leguminosae, Liliaceae,
Meliaceae, Moraceae,
Ranuculaceae,
Scrophulariaceae,

hoặc rệp Aphis nerii sống

m

có các
đƣờng

trên cây Asclepias
curassavica. Chúng thu

n

nhận cardenolid từ cây để

h

làm chất bảo vệ chống kẻ

ƣ

thù ăn thịt. Tuy nhiên gần
đây ngƣời ta phát hiện các

l

12


Luận văn thạc sĩ


này.

13


Luận văn thạc sĩ

1.2.1.

Bùi Thị Tâm

Digoxin

Công thức: C41H64O14 (780,95)

Tính chất vật lý:
-

Là chất kết tinh không màu

-

Tan trong cồn, pyridin, hay hỗn hợp chloroform - alcolhol, tan nhiều
trong cồn nóng 80%,..

-

Độ tan trong nƣớc 64,8 mg/L ở 25 °C và điểm nóng chảy ở 249 °C.

-

- Tan tốt trong cồn, chloroform, …
- Tan ít trong nƣớc (1gam/100 lít ở 20oC)
- Không tan trong dung môi hữu cơ benzen, ether….
Dƣợc tính:
Digoxin là một glicozit tim chiết xuất từ cây mao địa hoàng (Digitalis).
- Là chất độc bảng A
- Có cấu trúc và hiệu ứng tƣơng tự nhƣ digoxin.
1.3. Các phƣơng pháp xác định glycoside tim
1.3.1.

Phương pháp sắc kí xác định glycoside tim

Phƣơng pháp sắc kí để nghiên cứu các glycoside tim rất đƣợc quan tâm, vì:
thứ nhất các glycoside tim là các hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc sử dụng ngày
càng gia tăng trong thuốc, thứ hai, chúng còn đƣợc nghiên cứu về cấu trúc và thể tích
lƣu trong sắc kí. Hơn nữa điều kiện tối ƣu tách các glycoside cũng đƣợc quan tâm.
F.erni và R.W.Frei đã đƣa ra quy trình tách các glycoside tim trong thuốc
bởi sắc kí pha ngƣợc, với điều kiện: cột pha ngƣợc C18, kích cỡ hạt 10m, dài 30
cm, ID 3,5mm, pha động là 37% acetonitrin trong nƣớc, tốc độ dòng pha động 1,4
ml/phút, thể tích vòng mẫu 25l, detector đặt ở bƣớc sóng 220nm. Thời gian phân
tích là 25 phút [14]. Youichi fujii, Hitomi fukuda, Yumiko Saito và Mitsuru

15


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

Yamazaki đƣa ra quy trình tách và định lƣợng các glycoside tim trong thuốc bằng

Grazia Bellardi, Assunta Bertaccini, Stefania Benvenuti phân tích xác định và tách trong
lá cây mao địa hoàng với phƣơng pháp HPLC trên cột LiChrospher RP- 18 (125 mm ×
4.0 mm I.D.), Zorbax SB-C18 (150 mm × 4.6 mm I.D.); SB-Aq (150 mm × 4.6 mm
I.D.,); Symmetry C 18 (75 mm × 4.6 mm I.D., For the Symmetry C18 trong điều kiện
dung môi pha động là hỗn hợp acetonitrin và nƣớc, chạy
gradient từ 0- 35phút với tỉ lệ H2O/ACN là 80:20, từ phút 35 đến 40 tỉ lệ H2O/ACN
là 70:30 và tỉ lệ H2O/CAN bằng 60:40 đựơc giữ trong 3 phút, nhiệt độ cột đặt ở 20 oC,
thể tích bơm mẫu 10l, tốc độ dòng là 1ml/phút, detector đặt ở bƣớc sóng
220nm. Tổng thời gian phân tích mẫu là 48 phút, thứ tự ra khỏi cột: digoxigenin;
2,deacetyllanatoside C; 3,digoxigenin-bis-digitoxoside; 4,gitoxigenin; 5, digoxin; 6,

16