ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ
NGUYỄN THỊ THÙY DUNG
NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ CỐ ĐỊNH ADN ĐẦU DÒ ỨNG DỤNG
TRONG CẢM BIẾN ADN ĐỊNH HƯỚNG PHÁT HIỆN VI KHUẨN
STREPTOCOCCUS SUIS GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ NANO SINH HỌC
HÀ NỘI - 2017
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ
NGUYỄN THỊ THÙY DUNG
NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ CỐ ĐỊNH ADN ĐẦU DÒ ỨNG DỤNG
TRONG CẢM BIẾN ADN ĐỊNH HƯỚNG PHÁT HIỆN VI KHUẨN
STREPTOCOCCUS SUIS GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO
Chuyên ngành: Công nghệ Nano Sinh học
Mã số: Chuyên ngành đào tạo thí điểm
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ NANO SINH HỌC
Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Thị Hiên
‘HÀ NỘI - 2017
khảo của luận văn.
Hà Nội, ngày tháng năm 2017
Học viên
Nguyễn Thị Thùy Dung
MỤC LỤC
GIỚI THIỆU .................................................................................................................. 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
1.1. Cảm biến sinh học và xu thế ............................................................................... 3
1.1.1. Tổng quan cảm biến sinh học ......................................................................... 3
1.1.2. Cảm biến ADN ............................................................................................... 5
1.1.3. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi quang .............................................. 7
1.1.4. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi điện hóa .......................................... 9
1.1.5. Cảm biển ADN dựa trên bộ chuyển đổi từ ................................................... 10
1.1.6. Cảm biến sử dụng một lần ............................................................................ 11
1.2. Các phương pháp cố định đầu dò ADN .......................................................... 13
1.2.1. Phương pháp vật lý ....................................................................................... 14
1.2.2. Phương pháp hóa học ................................................................................... 14
1.2.3. Phương pháp sinh học .................................................................................. 17
1.3.
Giới thiệu vi khuẩn Streptococcus suis ............................................................ 18
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 20
2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị ................................................................................. 20
2.1.1. Vật liệu ......................................................................................................... 20
2.1.2. Hóa chất và dung dịch .................................................................................. 20
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ..................................................................... 22
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 59
DANH MỤC VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
Từ viết tắt
Viết đầy đủ
ADN
Axit Deoxiribonucleic
APTES
(3-Aminopropyl)triethoxysilane
bp
base pair
AMR
Từ điện trở dị hướng (Anisotropic magnetoresistance)
EDC
1–Ethyl–3–(3–dimethylaminipropyl) carbodiimide
ELISA
Succinic acid anhydride
S.suis
Streptococcus suis
UVO
Ultraviolet Ozone
16S rARN
Axit Ribonucleic 16S ribosome
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các chất nối sử dụng để cố định ADN với đế .............................................. 16
Bảng 2.1. Trình tự các đoạn ADN ................................................................................. 20
Bảng 2.2. Các hóa chất .................................................................................................. 21
Bảng 2.3. Các dung dịch................................................................................................ 22
Bảng 2.4. Các thiết bị, dụng cụ ..................................................................................... 22
Bảng 2.5. Bảng tổng hợp các đặc tính riêng của 2 cặp mồi .......................................... 25
Bảng 2.6. Tên các mẫu .................................................................................................. 26
Bảng 2.7. Nồng độ ADN toàn phần tách từ khuẩn lạc của S.suis và các liên cầu khuẩn
khác ................................................................................................................................ 31
Bảng 2.8. Thành phần mẫu PCR 1 ................................................................................ 32
Bảng 2.9. Thành phần mẫu PCR 2 ................................................................................ 33
Bảng 2.10. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 1 và PCR 2 .................................................... 33
Bảng 2.11. Thành phần gel acrylamide (đệm TBE) 15% (gel cô và gel tách) .............. 34
Bảng 2.12. Các mẫu phân tích bằng phương pháp FTIR .............................................. 36
bề mặt chip..................................................................................................................... 12
Hình 1.13.a. Phương pháp vật lý. b. Phương pháp hóa học. c. Phương pháp sinh học.13
Hình 1.14.a. Cấu trúc nhóm thiol. b. Cố định ADN có nhóm thiol lên đế vàng. .......... 14
Hình 1.15. Sơ đồ chức năng hóa đế và cố định ADN ................................................... 15
Hình 1.16. Cấu trúc của một số chất nối thường dùng .................................................. 16
Hình 1.17. Cố định đầu dò ADN bằng EDC và NHS ................................................... 17
Hình 1.18.a. Cố định streptavidin lên đế. b. Cố định ADN đầu dò có gắn biotin lên đế
đã phủ streptavidin. ....................................................................................................... 17
Hình 1.19. Sơ đồ cố định ARN có nhóm biotin lên bề mặt đế được chức năng hóa bởi
streptavidin. ................................................................................................................... 18
Hình 1.20. Vi khuẩn liên cầu lợn qua kính hiển vi điện tử ........................................... 18
Hình 2.1. Sơ đồ chế tạo thẻ sử dụng một lần SPA ........................................................ 26
Tên sản phẩm được tạo thành qua mỗi bước được liệt kê trong bảng 3.1. ................... 26
Hình 2.2. Thẻ SPA và diện tích tiến hành cố định đầu dò SPA .................................... 29
Hình 2.3. Mẫu bệnh phẩm được cấy trên môi trường thạch máu .................................. 30
Hình 2.4. Minh họa góc thấm ướt ................................................................................. 35
Hình 2.5. Sơ đồ hệ chụp ảnh góc thấm ướt ................................................................... 35
Hình 3.1. Phổ FTIR của màng PDMS qua các bước chức năng hóa ............................ 38
Hình 3.2. Góc thấm ướt của các bề mặt thẻ sau mỗi bước biến đổi .............................. 39
Hình 3.3. Kết quả chạy chương trình ClustalX 2.0.11 chọn đoạn ADN đặc trưng cho
gen 16S rARN của loài S.suis........................................................................................ 40
Hình 3.4. Sơ đồ vị trí các cặp mồi và sản phẩm PCR ................................................... 41
Hình 3.5. Điện di sản phẩm PCR 198 bp của cặp mồi SF-SR trên gel agarose 1.5%. L:
Thang ADN 100 bp (ThermoFisherTM SM0242). Ss01-Ss05, Ss07, Ss08, Ss10, Ss11:
các chủng S.suis. Các đối chướng LM: Listeria monocytogenes. Sa01, Sm01,Sv01,
Spn02: các loài thuộc giống Streptococcus. .................................................................. 42
Hình 3.6. Điện di sản phẩm PCR gen 16S rARN sử dụng cặp mồi SF2-SRB trên gel
polyacrylamide 15%. L: Thang ADN 50 bp (ThermoFisherTM SM0371). Ss07, Ss08,
Với xu thế phát triển hiện nay là tìm ra các vật liệu mới, kỹ thuật mới kế thừa
và phát triển hơn các phương pháp truyền thống để cho ra kết quả xét nghiệm mẫu
bệnh phẩm một cách nhanh chóng, chính xác và độ nhạy cao đang là vấn đề bức thiết
và đáng quan tâm. Một trong các xu hướng nghiên cứu phát triển gần đây các cảm biến
sinh học trong phân tích y sinh là chế tạo và phát triển các thẻ sử dụng một lần, trên
đó cố định các đầu dò sinh học và sử dụng cảm biến làm bộ phận phát hiện. Ở các cảm
biến truyền thống, các đầu dò ADN được cố định trực tiếp trên bề mặt cảm biến và
mẫu cần phân tích được xử lý ngay trên bề mặt cảm biến, do đó chất lượng bề mặt cảm
biến sẽ bị kém đi sau mỗi lần sử dụng và khó có thể tái sử dụng lại được nên giá thành
cho một mẫu phân tích khá cao. So với các cảm biến truyền thống thì hệ thống phân
tích y sinh với các thẻ dùng một lần trong có nhiều ưu điểm hơn. Trước hết, quá trình
xử lý và đánh dấu mẫu được thực hiện trên thẻ, sau đó thẻ được đưa vào cảm biến để
phát hiện, do đó không làm ảnh hưởng đến chất lượng của cảm biến sau mỗi lần sử
dụng. Nhờ vậy, cảm biến có thể sử dụng để phát hiện nhiều mẫu, chỉ cần thay thẻ cho
mỗi mẫu phân tích. Một ưu điểm khác của việc sử dụng thẻ dùng một lần là có thể
phát hiện các loại mẫu phân tích khác nhau trên một cảm biến chỉ cần sử dụng các thẻ
khác nhau với các loại đầu dò khác nhau đặc hiệu loại mẫu cần phân tích đó. Bên cạnh
đó, việc chế tạo các thẻ dùng một lần thường không phức tạp, ít tốn kém và quan trọng
hơn là chúng phù hợp với quy mô sản xuất công nghiệp hiện đại.
Streptococcus suis (S.suis) là liên cầu khuẩn gây bệnh ở lợn, gọi tắt là liên cầu
lợn, là một tác nhân gây bệnh nghiêm trọng ở lợn xảy ra ở nhiều nơi trên thế giới và
gây tổn thất lớn về kinh tế. Năm 1960 phát hiện ra ca nhiễm bệnh ở người đầu tiên sau
đó số lượng bệnh nhân nhiễm ngày càng gia tăng. Biểu hiện lâm sàng của bệnh là:
viêm màng não (biểu hiện chủ yếu), xuất huyết, viêm phổi, viêm cơ tim và viêm khớp;
người bệnh nặng có thể tử vong. Theo Hướng dẫn Giám sát và phòng, chống bệnh liên
cầu lợn ở người của Bộ Y Tế ngày 7 tháng 11 năm 2014, tỉ lệ tử vong từ 5% tới 20%.
Cũng theo báo cáo của Cục Y tế dự phòng, năm 2016 vừa qua bệnh do liên cầu lợn đã
giảm 19.4% từ 514,299 trường hợp năm 2015 xuống còn 414,587 trường hợp. Tử vong
do bệnh này cũng giảm tới 58% từ 17 trường hợp năm 2015 xuống còn 7 trường hợp
năm 2016. Bệnh có thời kỳ ủ bệnh kéo dài từ vài giờ đến 3 ngày và có thể dẫn đến tử
1.1.1. Tổng quan cảm biến sinh học
Cảm biến sinh học (biosensor viết tắt của biological sensor) là loại thiết bị phân
tích bao gồm phần cảm nhận sinh học kết hợp với bộ chuyển đổi tín hiệu (hình 1.1)
chuyển một tín hiệu sinh học thành một tín hiệu điện, nhiệt hoặc quang... Theo IUPAC
(International Union of Pure ADN Applied Chemistry) “Cảm biến sinh học
(biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định
lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm phân tử nhận biết sinh học
(bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi”.
Hình 1.1. Cấu tạo cảm biến sinh học (internet)
Cấu tạo của một cảm biến sinh học gồm 3 phần chính:
1. Đầu thu sinh học (bioreceptors/sensitive biological elements) là các nhân tố
sinh học hoặc giả sinh học như các thụ thể tế bào, enzymes, kháng thể, tế bào,
ADN, ARN... được cố định trên bề mặt của cảm biến sinh học có tác dụng
tương tác đặc hiệu với chất cần phân tích;
2. Bộ phận chuyển đổi tín hiệu (transducer/detector element): làm việc dựa trên
một số nguyên lý như quang, điện hóa, lý hóa, điện áp...giúp chuyển các biến
đổi sinh học giữa đầu thu sinh học và các chất cần phân tích thành các tín hiệu
có thể đo đạc được;
3. Bộ phận xử lý, đọc tín hiệu ra (electronic system/biosensor reader device): bộ
phận này có tác dụng chuyển thành các tín hiệu điện để máy tính và các thiết bị
khác có thể xử lý, được đánh giá mà bộ phận có giá thành cao nhất cấu tạo nên
một cảm biến sinh học.
Ngoài ra, còn cần có một vài bộ phận phụ khác để cấu thành nên một thiết bị
cảm biến sinh học đầy đủ như tác nhân cố định (recognition), giúp gắn các đầu thu có
bản chất sinh học lên giá đỡ hoặc bề mặt đế - bản chất vô cơ.
Cảm biến sinh học được phân loại dựa vào bản chất các đầu thu sinh học, gồm
các loại chính như cảm biến sinh học có đầu thu làm từ enzyme, các kháng
cuộc sống hơn trong tương lai gần.
5
Triệu đô la
Năm
Hình 1.2. Biểu đồ nhu cầu sử dụng cảm biến sinh học từ năm 1996 tới 2018 [34]
1.1.2. Cảm biến ADN
Cảm biến ADN là cảm biến sinh học sử dụng đầu thu sinh học là các đoạn
ADN. Phân tử ADN là một chuỗi xoắn kép gồm hai sợi đơn ADN có trình tự bổ sung
với nhau, mỗi sợi đơn ADN là một chuỗi nucleotide (hình 1.3.a). Mỗi nucleotide gồm
ba thành phần nhóm photphat, đường deoxyribose và một trong bốn bazơ (A, C, G và
T). Hai sợi đơn kết hợp với nhau nhờ các liên kết hydro hình thành giữa các bazơ bổ
sung nằm trên hai sợi, A bổ sung cho T và C bổ sung cho G. Mỗi sợi đơn có một trình
tự định hướng với một đầu 5’ photphat tự do, đầu kia là 3’ hydroxyl tự do (quy ước là
5’- 3’) (hình 1.3.b). Hướng của hai sợi đơn trong chuỗi xoắn kép ngược nhau, nên
được gọi là hai sợi đối song song.
6
Đầu 5’
Liên kết hydro
Đầu 3’
Đầu 3’
a)
Người ta phân chia đầu dò làm hai loại phụ thuộc vào chiều dài của chúng là
đầu dò gen (gene probe) (dài hơn 500 nucleotide chứa toàn bộ hay phần lớn trình tự
gen đích, thường được tạo ra bằng phương pháp PCR từ các gen đích) và đầu dò
oligonucleotide (oligonucleotide probe) (được tổng hợp nhân tạo bằng thiết bị tổng
hợp với chiều dài nhỏ hơn 100 nucleotide). Trong cảm biến ADN, người ta thường
dùng các đầu dò oligonucleotide với chiều dài từ 18 đến 50 nucleotide để nhận biết
gen đích.
Quá trình lựa chọn đầu dò oligonucleotide cho cảm biến ADN có thể thực hiện
sử dụng những trình tự gen đã biết, với các điều kiện chú ý sau. 1. Chiều dài đầu dò
thường dao động trong khoảng 18 – 50 nucleotide, kích thước dài hơn sẽ khiến thời
gian lai lâu hơn và hiệu suất tổng hợp thấp, kích thước ngắn hơn sẽ làm giảm độ đặc
hiệu của đầu dò. 2. Thành phần G – C nên từ 40 – 60%, nguy cơ lai không đặc hiệu
tăng khi tỉ lệ G – C nằm ngoài khoảng trên. 3. Tránh sự có mặt của các vùng bổ sung
bên trong mẫu dò vì chúng có thể tạo cấu trúc “kẹp tóc” (hair-pin) và ngăn cản quá
trình lai (hình 1.5). 4. Tránh các trình tự chứa các đoạn nucleotide đơn liên tiếp (ví dụ
như AAAA). Một khi trình tự đạt những yêu cầu trên, vẫn cần thiết phân tích trình tự
trên máy tính. 5. Nên so sánh trình tự đầu dò với các vùng trình tự nguồn hay hệ gen
nguồn cũng như so sánh với các trình tự bổ sung của các trình tự nguồn đó. Nếu độ
tương đồng với các vùng (không phải đích) > 70% hoặc >=8 nucleotide trong một
hàng được quan sát, mẫu dò đó không đủ điều kiện sử dụng. Tuy nhiên, để xác định
điều kiện lai tối ưu, nên tiến hành lai đầu dò với các ADN đích và ADN đối chứng
trong các điều kiện lai được tối ưu.
Hình 1.5. Cấu trúc kẹp tóc (hair pin) (internet)
Cảm biến sử dụng đầu dò ADN có thể kết hợp với các bộ chuyển đổi khác
nhau: bộ chuyển đổi quang, bộ chuyển đổi điện hóa, bộ chuyện đổi từ.
1.1.3. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi quang
Cảm biến dựa trên bộ chuyển đổi quang là loại phổ biến nhất cho cảm biến nói
chung và cảm biến ADN nói riêng, với các ưu điểm như độ chính xác cao, độ nhạy cao
9
đổi cường độ ánh sáng phản xạ khi có sự lai hóa của đoạn ADN đầu dò và ADN đích
trên bề mặt lớp cảm biến làm bằng màng vàng (hình 1.7) [24]. Loại cảm biến này có
ưu điểm là: độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhưng cũng có nhược điểm là giá thành cao.
b)
c)
a)
Hình 1.7.a. Cấu trúc cảm biến SPR. b. Đồ thị phụ thuộc cường độ ánh sáng phản xạ
vào góc tới trước và sau khi có phân tử ADN đích lai với đầu dò trên bề mặt cảm biến.
c. ADN đầu dò và ADN đích trên bề mặt cảm biến SPR [24].
1.1.4. Cảm biến ADN dựa trên bộ chuyển đổi điện hóa
Cảm biến ADN dựa trên chuyển đổi điện hóa được biết đến như một công cụ
hứa hẹn với nhiều ứng dụng hữu ích vào chẩn đoán bệnh, kiểm định môi trường,
nghiên cứu trong sinh học bởi độ nhạy cao, giá thành thấp, dễ dàng tương thích với các
công nghệ vi chế tạo hiện đại cũng như có thể cầm tay [7, 42]. Cách phát hiện ADN sử
dụng cảm biến ADN với bộ chuyển đổi điện hóa có thể tiến hành theo phương pháp
đánh dấu đoạn ADN đích. Chia ra làm hai loại là cảm biến ADN sử dụng chất chỉ thị
oxi hóa – khử (redox indicator) và cảm biến ADN sử dụng hạt nano. Phương pháp sử
dụng chất chỉ thị oxi hóa – khử nhận biết sự bắt cặp ADN dựa vào sự khử của chất chỉ
thị oxi hóa – khử (chất hữu cơ) được gắn vào đoạn ADN đích hoặc ADN đầu dò. Khi
có sự kết cặp của ADN đầu dò và ADN đích sẽ hình thành đoạn xoắn kép, dẫn đến
nồng độ chất chỉ thị tăng ở bề mặt cảm biến làm thay đổi tín hiệu điện hóa trong quá
trình đó (hình 1.8 ) [40].
Hình 1.11.a. biểu thị máy đo đường huyết On-Call EZ II xuất xứ từ Mỹ đang một sản
phẩm theo phương pháp đo trực tiếp thịnh hành trên thị trường với giá thành hợp lý
cũng như tiết kiệm thời gian (kết quả chính xác sau 10 giây). Hình 1.11.b. biểu thị cấu
trúc que thử gồm là tấm nhựa gồm 2 điện cực, hai lớp bảo vệ, một lớp kết dính,một
điện cực hoạt động chính gắn enzym glucose oxidase (GOD) và chất trung gian. OnCall EZ II hoạt động dựa trên nguyên tắc của cảm biến điện hóa. Sau khi mẫu máu đưa
vào que thử glucose trong máu được oxi hóa nhờ xúc tác đặc hiệu của enzym glucose
oxidase (C6H12O6 + O2 => C6H10O6 + H2O2). Mỗi phân tử glucose phản ứng sẽ có 2
điện tử được trao đổi và vận chuyển qua phần tử chất trung gian (chất trung gian giúp
điện tử di chuyển nhanh). Dưới tác dụng của điện thế giữa 2 điện cực sẽ xuất hiện
dòng điện. Thông qua tín hiệu dòng điện xác định được nồng độ glucose trong máu.
Bộ phận vi xử lý cho hiển thị số trên màn hình.
12
b)
a)
Hình 1.11.a. Máy đo đường huyết On-Call EZ II. b. Cấu trúc que thử. (internet)
Bên cạnh đó, để quản lý bệnh nhân tiểu đường người ta còn sử dụng cảm biến
sinh học đo glucose trong nước mắt (VD: Noviosense) hoặc có thể là cảm biến không
phải là cảm biến sinh học (không dùng đầu thu sinh học) như IR, siêu âm… Loại cảm
biến khác có tên là máy đo đường huyết gián tiếp (không xâm lấn). Như vậy, người
bệnh sẽ không bị đau khi đo chỉ số đường huyết và tiết kiệm được chi phí que thử.
Hệ thống sử dụng chip một lần Biacore là một trong những công cụ hữu ích cho
việc nghiên cứu và phân tích các mối quan hệ giữa các chất như protein, nucleic acids,
carbohydrates, lipids…Hệ thống này giúp phân tích thông tin quan trọng thông qua sự
liên kết của các chất (hình 1.12).
a)
Kỹ thuật cố định ADN đầu dò lên bề mặt cảm biến sinh học có ảnh hưởng lớn
đến độ nhạy, độ chính xác, độ ổn định của cảm biến. Quá trình cố định đoạn ADN cần
thỏa mãn các yêu cầu như: không ảnh hưởng đến cấu trúc các phân tử ADN, không
làm biến đổi và ít ảnh hưởng đến các tính chất của lớp màng bề mặt, liên kết tạo ra bền
trong điều kiện sinh lý. Hiện nay, có ba phương pháp cố định ADN lên bề mặt đế phổ
biến được nghiên cứu và phát triển là phương pháp vật lý, phương pháp hóa học và
phương pháp sinh học (hình 1.13). Mỗi phương pháp cố định có ưu và nhược điểm
riêng. Tùy mục đích sử dụng mà chúng ta lựa chọn phương pháp phù hợp.
a)
b)
c)
Hình 1.13.a. Phương pháp vật lý. b. Phương pháp hóa học. c. Phương pháp sinh học.
(internet)
14
1.2.1. Phương pháp vật lý
Phương pháp vật lý hay còn được gọi là phương pháp hấp phụ ADN lên bề mặt
của màng đã được chức năng hóa. Bản chất của các liên kết là các liên kết tĩnh điện.
Tuy nhiên các liên kết tĩnh điện lại phụ thuộc chủ yếu vào độ pH và nồng độ muối của
dung dịch, nên khi thay đổi dung dịch đệm với độ pH và nồng độ muối cao hơn, tương
tác giữa ADN và màng chức năng sẽ bị suy yếu và kết quả là ADN có thể bị tách khỏi
màng chức năng. Khả năng hấp phụ phụ thuộc vào các điều kiện: nhiệt độ, nồng độ
ADN ban đầu, diện tích bề mặt tiếp xúc của màng chức năng. Như vậy, phương pháp
vật lý tương đối đơn giản, ADN gắn trên màng đã chức năng bền trong môi trường mà
chúng vừa tạo thành, nhưng không bền khi thay đổi môi trường; khó kiểm soát được
số lượng, định hướng vị trí phân tử ADN liên kết với bề mặt đế (hình 1.14.b).
Cố định ADN nguyên thể lên bề mặt đế đã được chức năng hóa là phương pháp
tương đối đơn giản và phổ dụng để tạo phức hợp vì chỉ cần sử dụng ADN nguyên thể
với nhóm photphat ở đầu 5’. Khi đó, bề mặt đế đã được chức năng hóa cần có nhóm
chức amin. Dưới tác dụng của chất xúc tác N-methyl-imidazole (MIA) và sự có mặt
của chất carbodiimide tan trong nước EDC (1–Ethyl–3–(3–dimethylaminipropyl)
carbodiimide), nhóm photphat ở đầu 5’ của ADN nguyên thể được kích hoạt để phản
ứng với nhóm amin trên bề mặt màng đã được chức năng hóa tạo thành liên kết cộng
hóa trị bền.
Khi cố định ADN biến đổi có nhóm amin và thiol lên bề mặt đế đã được chức
năng hóa, tùy thuộc vào các nhóm chức trên bề mặt màng đã được chức năng hóa mà
người ta lựa chọn các chất nối (crosslinker) khác nhau (bảng 1.1) [2]. Trong số đó,
EDC là một loại carbodiimide tan trong nước được sử dụng phổ biến nhất trong hóa
sinh hữu cơ và công nghệ sinh học nano để nối nhóm carboxyl và amin tạo thành liên
kết amide. Các chất nối NHS và DSS (hình 1.16) [2]. không tan trong nước nên phải
hòa tan chúng trong dung môi hữu cơ như DMSO trước khi trộn lẫn với ADN trong
dung dịch đệm. Để không phải sử dụng dung môi hữu cơ trong phản ứng, người ta đã
tổng hợp các chất nối tan trong nước Sulfo-NHS và BS3 dựa trên nền hai chất kể trên.
Copyright: Tài liệu đại học ©