Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

HỒ MẠNH TƢỜNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT METAGENOMICS TRONG NGHIÊN CỨU HỆ
VI SINH VẬT VÙNG RỄ CÂY DÓ BẦU TẠI MỘT SỐ TỈNH CỦA VIỆT
NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
(Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm)

HÀ NỘI, 2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
1




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

HỒ MẠNH TƢỜNG

hiếm và chƣa đƣợc biết đến đã bị loại ra trong quá trình phân tích. Do đó, số
lƣợng và sự đa dạng của các sinh vật nhân sơ trong 1 gram đất phải lớn hơn rất
nhiều. Trong khi đó, phƣơng pháp nuôi cấy trực tiếp hoặc không trực tiếp để
khám phá và khai thác sự đa dạng của hệ vi sinh vật có trong đất. Nuôi cấy và
phân lập DNA của vi sinh vật là phƣơng pháp phổ biến nhƣng chỉ đƣợc từ 0,1
đến 1% vi sinh vật là có thể đƣợc nuôi cấy sử dụng các phƣơng pháp tiêu chuẩn,
vì vậy sự đa dạng của hệ vi sinh vật vẫn chƣa đƣợc khám phá hết.
Cây dó bầu (Aquilaria spp.) thuộc chi Trầm họ Trầm, bộ Bông là lớp Cây
gỗ lớn thuộc ngành Mộc Lan. Chi Trầm có tất cả 25 loài khác nhau phân bố chủ
yếu ở khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á và miền Nam Trung Quốc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
3




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Tại Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác trong rừng rậm nhiệt đới thƣờng xanh,
rừng ẩm nguyên sinh. Trầm hƣơng đƣợc sử dụng để chữa một số bệnh hiểm
nghèo, có tác dụng kháng khuẩn, có tính kháng sinh. Giá trị quan trọng nhất của
cây dó bầu là nguồn vật liệu sinh trầm hƣơng. Trầm hƣơng đƣợc coi là một loại
lâm sản ngoài gỗ có giá trị thƣơng mại quốc tế nhất. Trên thế giới, Trầm hƣơng
đƣợc sử dụng để chƣng cất tinh dầu trầm, một chất quan trọng cho ngành công
nghiệp mỹ phẩm cao cấp. Tinh dầu trầm có giá trị đặc biệt, đƣợc dùng trong
công nghệ chế biến các loại chất thơm, các loại nƣớc hoa cao cấp, giá trị.
Hệ vi sinh vật vùng rễ đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trƣởng và
phát triển của cây dó bầu. Tuy nhiên, vai trò của chúng chƣa đƣợc nghiên cứu


-

Xác định thành phần giới, họ, chi của các mẫu nghiên cứu

-

So sánh thành phần giới, họ, chi của các mẫu nghiên cứu.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
4




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

I.
1.1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Cây dó bầu và khả năng tạo trầm

1.1.1. Nguồn gốc, phân bố
Cây dó bầu (Aquilaria spp.) thuộc chi Trầm (Aquilaria), họ Trầm
(Thymelaeaceae), bộ Bông (Malvales), lớp Cây gỗ lớn thuộc ngành Mộc Lan.
Chi Trầm có tất cả 25 loài khác nhau, tuy nhiên chỉ có 15 loài có khả năng cho


Trầm hƣơng (A.crassna Pierre ex Lecomte); dó baillon (A. baillonii Pierre ex
Lecomte), dó bana (A. banaensae.Phamhoang.) (Phạm Hoàng Hộ 1992) và dó
quả nhăn (A. rugosa L.C. Kiet & Krbler) (Lê Công Kiệt et al., 2005). Trong đó,
cây dó bầu A. crassna là loài đƣợc trồng phổ biến nhất vì khả năng loại trầm tốt
nhất thế giới (Hoàng Cảnh 2006). Các loài dó baillon (A. baillon), dó bana (A.
banaensae) và dó quả nhăn (A. rugosa) đều là đặc hữu có thể bắt gặp tại một
vài địa điểm thuộc Quảng Trị, Thừa Thiên Huế và Quảng Nam. Trong kho đó,
dó quả nhăn (A. rugosa) là loài mới đƣợc phát hiện tại Kon Tum.

Hình 1.1. Phân bố dó bầu tại Việt Nam
Hiện nay, các cá thể trƣởng thành của trầm hƣơng cơ bản bị tuyệt diệt
trong tự nhiên. Vùng trọng điểm gây trồng cây dó trầm hiện nay ở nƣớc ta là
Bán Trung Bộ, Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, và Tây Nam Bộ.
Trong đó, vùng Bắc Trung Bộ tập trung chủ yếu tại Hà Tĩnh,vùng Nam Trung
Bộ tập trung chủ yếu tại Quảng Nam, vùng Tây Nguyên chủ yếu tập trung tại
Kon Tum, Đông Nam Bộ tập trung chủ yếu tại Bình Phƣớc, Tây Nam Bộ tập
trung chủ yếu tại Kiên Giang và An Giang.
1.1.2. Giá trị kinh tế, dược liệu và sinh thái
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
6




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Giá trị kinh tế: Giá trị quan trọng nhất của cây dó bầu là nguồn vật liệu


Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

kinh tế của nƣớc ta, đây còn là giải pháp phù hợp với quy luật sản xuất đi đôi
với bảo vệ môi trƣờng, kết hợp lợi ích trƣớc mắt với lợi ích lâu dài, làm giàu
trên cơ sở khai thác và tái tạo lợi thế đặc hữu, ƣu việt của tài nguyên quốc gia.
Hơn nữa, cây dó bầu còn có ý nghĩa tạo công ăn việc làm cho ngƣời lao động,
mở ra hƣớng phát triển kinh tế bền vững cho nông thôn, vùng sâu vùng xa (Thái
Thành Lƣợm 2009).
1.1.3. Khả năng sinh trầm của dó bầu
Sự tạo trầm trong tự nhiên của cây dó bầu là sự biến đổi của các phần tử
gỗ do tác động bệnh lý bởi vết nứt gãy, sự xâm nhập của các loài nấm…Có 3 giả
thuyết tồn tại đến sự tạo trầm liên quan đến các tác nhân bệnh lý, thƣơng tích
bệnh lý hoặc thƣơng tích không bệnh lý (Ng et al., 1997). Kết quả của nghiên
cứu không cung cấp đƣợc bằng chứng thuyết phục là tác nhân nào trong số 3 tác
nhân trên tác động đến sự tạo trầm của cây. Ngoài ra, nghiên cứu của Oldfield
et al. (1998) cho rằng quá trình tạo trầm có liên quan đến sự đáp ứng của cây với
nấm. Hơn nữa, Heuveling và Phillips (1999) cho rằng nó liên quan đến đáp ứng
với thƣơng tích. Nghiên cứu cho rằng sự xâm nhiễm của nấm có thể làm tăng sự
tạo trầm cũng nhƣ sự đáp ứng của tế bào chủ với vết sự phát triển của nấm xâm
nhiễm. Dó bầu có thể đƣợc xâm nhiễm tự nhiên bởi một vài các loại nấm nhƣ:
Aspergillus spp, Botryodyplodia spp, Diplodia spp, Fusarium bulbiferum, F.
laterium, F. oxysporum , F. solani, Penicillium spp, and Pythium spp. (Anon
1998; Soehartono and Mardiastuti 1997; Wiriadinata 1995). Sự tƣơng tác giữa tế
bào chủ với nấm hay các tác nhân khác để tạo thành trầm vẫn chƣa đƣợc nghiên
cứu kỹ. Sự tƣơng tác này xảy ra một cách tự nhiên năm này sang năm khác. Căn
cứ vào sự hóa nhựa nhiều hay ít mà có những sản phẩm nhƣ: Tóc, Trầm hƣơng
và Kỳ nam. Thực tế cho thấy những cây dó bầu sau khi chết rục thì lƣợng Kỳ

1.2.1. Vai trò của hệ vi sinh vật đối với môi trường và cây trồng
Các vi sinh vật đóng vai trò to lớn đối với các sinh vật sống trên trái đất.
Sự đa dạng của hệ vi sinh vật phản ánh sự phong phú về chức năng, cung cấp
các thành phần cần thiết cho tất cả các dạng sống tồn tại. Các vi sinh vật tham
gia vào hầu hết các chu trình sinh, hóa học trên tái đất từ xử lý rác thải tới thúc
đẩy sự tăng trƣởng và sinh sản của thực vật, động vật. Hơn nữa, vi sinh vật cung
cấp cho con ngƣời các sản phẩm nhƣ: thuốc, các loại sản phẩm lên men và góp
phần vào việc duy trì sức khỏe. Chỉ gần đây các nhà vi sinh vật học mới đánh
giá chính xác sự đa dạng trong hệ vi sinh vật do nhiều vi sinh vật không thể
đƣợc nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả dẫn đến các nhà vi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
9




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

sinh vật rất khó để tìm hiểu về các hệ vi sinh vật không thể phát hiện bằng các
phƣơng pháp truyền thống này. Vai trò của các vi sinh vật có thể đƣợc khái quát
nhƣ sau:
Microbial services: Các vi sinh vật là các sinh vật rất quan trọng trên trái
đất nhƣng vai trò của chúng ít đƣợc biết đến do chúng không thể đƣợc phát hiện
bằng mắt thƣờng. Vi sinh vật cung cấp cho con ngƣời không khí, thức ăn và
thực hiện hầu hêt các chức năng của cơ thể, trong khi đó rất ít ngƣời biết về vai
trò của chúng với cuộc sống. Có rất nhiều các ví dụ điển hình cho việc cung cấp
các thành phần thiết yếu của vi sinh vật cho các sinh vật khác (Madigan and
Martinko 2005).

tại dƣới dạng bền N2 nên các sinh vật không thể bẻ gẫy các liên kết này để sử
dụng đƣợc. Thực tế vi khuẩn là sinh vật duy nhất có thể bẻ gẫy các liên kết trong
N2 và cố định chúng (Handelsman 2007).
Duy trì sức khỏe con người: Các hệ vi sinh vật sống trong, trên cơ thể con
ngƣời rất cần thiết cho sức khỏe của vật chủ. Vi khuẩn trong hệ đƣờng ruột bảo
vệ con ngƣời khỏi sự tấn công của các mần bệnh, khi mà sự cân bằng của hệ vi
sinh vật đƣờng ruột bị phá vỡ thì sẽ kéo theo sự xuất hiện của rất nhiều bệnh
nhƣ: nhiễm trùng đƣờng ruột, ung thƣ ruột, béo phì và tiểu đƣờng những bệnh
này không gây ra bởi một sinh vật riêng lẻ mà liên quan tới các quá trình của hệ
vi sinh vật. Trong một số khía cạnh các chức năng của hệ vi sinh vật nhƣ là một
đơn vị trong đó mỗi vi sinh vật phụ thuộc vào các vi sinh vật khác cần thiết cho
cuộc sống và hiệu quả chức năng của hệ thống phụ thuộc vào sự tƣơng tác và
hợp tác giã mỗi thoành viên trong cộng đồng. Các hệ vi sinh vật liên quan tới cơ
thể con ngƣời là chủ đề của hai quá trình tiến hóa. Đầu tiên, chúng đồng tiến hóa
với con ngƣời qua hàng ngàn năm cộng sinh, do đó gen của con ngƣời đã đƣợc
sự hỗ trợ và dựa vào những gen những vi sinh vật này. Thứ hai, mỗi vi sinh vật
trong hệ tiên hóa trong thời gian sống của chúng. Tiến hóa của các hệ vi sinh vật
với loài ngƣời cũng nhƣ với sinh vật khác tạo ra sự phụ thuộc và giao tiếp giữa
chúng. Kết quả là cá vi sinh vật cần đƣợc nghiên cứu về cả hệ vi sinh vật mà
không chỉ nuôi cấy trong phòng thí nghiệm (Handelsman 2007).
Tổng hợp kháng sinh: Các vi sinh vật là nguồn cung cấp hầu hết các
kháng sinh để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Năm 1920, Alexander Fleming đã
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
11




Luận văn Thạc sĩ






Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

lý học thực vật phát hiện các hệ vi sinh vật cực kỳ phức tạp đóng vai trò ức chế
tác nhân gây bệnh, các nghiên cứu chỉ ra rằng các phức hệ vi sinh vật này có thể
góp phần vô cùng hữu ích cho sản xuất nông nghiệp. Không một vi sinh vật
riêng lẻ nào đƣợc phân lập lại có khả năng tƣơng tự, điều này cho thấy tác động
qua lại, hỗ trợ nhau trong quá trình ức chế tác nhân gây bệnh của các thành viên
trong hệ vi sinh vật đất. Các nghiên cứu trên cho thấy tiềm năng của hệ vi sinh
vật đất là rất lớn và nghiên cứu thành công hệ vi sinh vật này hứa hẹn mang lại
nhiều thành tựu to lớn trong lĩnh vực sản xuất các chế phẩm sinh học nhƣ phân
bón vi sinh hay tác động đến hệ vi sinh vật đất nhằm cải thiện và nâng cao chất
lƣợng cây trồng. Qua trên có thể thấy rằng Metagenomics là một bƣớc cách
mạng hóa ngành vi sinh vật vì nó đã mở ra một cửa sổ để nghiên cứu thế giới vi
sinh vật khổng lồ mà trƣớc đây chƣa đƣợc nghiên cứu.

1.2.2. Giới thiệu về công nghệ metagenomics
Thuật ngữ "metagenomics" lần đầu tiên đƣợc đƣa ra năm 1985 bởi
nhóm

nghiên

cứu

của

mới về cấu trúc và chức năng của hệ sinh thái cúng nhƣ sự đa dạng của đại
dƣơng và hệ tiêu hóa của con ngƣời. Nhƣ đã biết, chỉ có khoảng 0,1 đến 10%
trong tổng số lƣợng các loài vi sinh vật đã đƣợc quan sát trong tự nhiên là có thể
nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm. Những sinh vật không thể nuôi cấy
trên môi trƣờng nhân tạo này đôi khi là độc nhất và có những tiềm năng độc đáo
nhƣ phân hủy rác thải hay tổng hợp các hợp chất có thể sử dụng nhƣ là thuốc
hay kháng sinh. Metagenomics là một công cụ mạnh mẽ trong việc tiếp cận với
các nguồn tài nguyên vi sinh vật mà chƣa đƣợc khai thác về đa dạng sinh học
trong các mẫu thu từ môi trƣờng. Metagenomics đƣợc sử dụng nhƣ một công cụ
của hệ thống điều tra, phân loại và thao tác toàn bộ vật liệu gen phân lập từ môi
trƣờng. Quá trình đa bƣớc này dựa vào 4 bƣớc chính: (1) phân lập các vật liệu
gen; (2) thao tác trên các vật liệu gen này; (3) xây dựng thƣ viện gen; (4) phân
tích các vật liệu gen trong các thƣ viện metagenomic.
Metagenomics là một nghành nghiên cứu mới và có thể áp dụng rộng rãi
trong lĩnh vực Sinh học và Công nghệ sinh học. Mặc dù đã có những bƣớc phát
triển trong biểu hiện các gen khác nhau, xây dựng thƣ viện gen , nhƣng việc thiết
kế vector cần phải cải tiến hơn nữa. Các kỹ thuật phân tử hiện nay đã đƣợc chứng
minh là có đủ khả năng giải quyết các vấn đề về sản phẩm nhƣ: khám phá ra các
loại kháng sinh và các loại enzime mới. Các nghiên cứu gần đây về tảo biển
(Sargasso Sea) (Venter et al., 2004), Acid mine drainage (AMD) (Tyson et al.,
2004), đất (Tringe et al., 2005) đã sử dụng phƣơng pháp giải trình tự đoạn ngắn
(shotgun-sequencing) để phát hiện và thống kê các mẫu trong các mẫu môi trƣờng
khác nhau. Trong mỗi nghiên cứu, các mẫu môi trƣờng đƣợc thu thập và DNA
đƣợc tách chiết trực tiếp từ các mẫu này, sau đó chúng đƣợc nhân dòng trong E.coli
và các dòng nhân ngẫu nhiên này đƣợc giả trình tự. Tuy nhiên, những thƣ viện gen
này không thể giả thích chức năng của các gen của mỗi sinh vật trong trong hệ vi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
14






Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

1.2.3. Ứng dụng công nghệ metagenomic trong nghiên cứu đa dạng của
các hệ vi sinh vật đất

Hình 1.2. Các bƣớc thực hiện phân tích, đánh giá nguồn gen vi sinh vật
bằng công nghệ metagenomics
Hệ vi sinh vật trong môi trường đất: môi trƣờng đất rất phức tạp khi
nghiên cứu số lƣơng và sự đa dạng các loài trong hệ vi sinh vật. Một ví dụ nhƣ:
một gram của đất rừng có chứa khoảng 4x107 tế bào sinh vật nhân sơ, trong khi
đó 1 gram của đất trồng trọt và đồng cỏ có chứa khoảng 2x109 tế bào sinh vật
nhân sơ. Dựa trên việc phân lập DNA từ một vài mẫu đất khác nhau, số lƣợng
các sinh vật nhân sơ đƣợc xác định từ khoảng 2000 đến 18000 bộ gen trên một
gram đất. Số lƣợng này là rất thấp bởi vì các bộ gen của các loài hiếm và chƣa
đƣợc biết đến đã bị loại ra trong quá trình phân tích. Do đó, số lƣợng và sự đa
dạng của các sinh vật nhân sơ trong 1 gram đất phải lớn hơn rất nhiều (16177
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
16




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

khăn. Việc nghiên cứu metagenomic ở vi sinh vật đất phải thông qua việc xây
dựng thƣ viện DNA và xác định chức năng của các gen có trong thƣ viện này.
Những năm gần đây, các tiến bộ mới trong phƣơng pháp đọc trình tự đã mang
đến bƣớc đột phá mới trong việc xây dựng thƣ viện gen, giảm bớt đáng kể các
bƣớc thực hiện trong công nghệ metagenomics (Metzker 2010; Mardis 2008).
Công nghệ này đã góp phần xác định vai trò của các vi sinh vật khác nhau trong
phức hệ vi sinh vật đất, nghiên cứu phân tích hệ vi sinh vật của các mẫu đất khác
nhau và sản xuất các chế phẩm mới từ vi sinh vật đất. Trong các nghiên cứu gần
đây, nhiều gen mã hóa các enzyme có ích và kháng sinh đã đƣợc phát hiện nhờ
nghiên cứu phân tích thƣ viện gen của các vi sinh vật đất, việc xác định các gen
mới này đã nói lên tiềm năng to lớn của việc xây dựng và phân tích thƣ viện gen
của các vi sinh vật đất (Hardeman and Sjoling 2007; Lussier et al., 2011).
Nhƣ vậy mặc dù gặp phải những trở ngại khó khăn ban đầu nhƣ quá trình
tách DNA khỏi các tạp chất, số lƣợng khổng lồ các vi sinh vật tồn tại trong môi
trƣờng đất, xây dựng thƣ viện metagenomic, xác định chức năng của các gen
mới v.v… nhƣng cùng với những bƣớc phát triển đột phá trong phƣơng pháp
đọc trình tự và công cụ tin sinh học công nghệ metagenomics hiện nay đã đạt
đƣợc những thành tựu đáng kể và ngày càng đƣợc quan tâm phát triển hơn. Ứng
dụng công nghệ metagenomics đã xác định đƣợc phần lớn các vi sinh vật có mặt
trong môi trƣờng đất, so sánh mức độ đa dạng giữa các môi trƣờng khác nhau,
đánh giá sự thay đổi về cấu trúc thành phần của hệ vi sinh vật dƣới tác động của
các tác nhân khác nhau lên môi trƣờng. Ngày nay số lƣợng lớn dữ liệu thu đƣợc
từ công nghệ metagenomics đã đƣợc công bố rộng rãi, không những tạo điều

ứng dụng huỳnh quang phân tích tự động (Olsvik et al., 1993; Pettersson et al.,
2009). Các công nghệ đọc trình tự mới luôn hƣớng tới làm tăng dung lƣợng
(throughput), làm giảm thời gian và giá thành (Schadt et al., 2010). Mặc dù vậy,
phƣơng pháp Sanger (dựa trên cơ sở kết hợp của các dideoxynucleotide
(ddNTP) bằng DNA polymerase trong quá trình khuếch đại DNA in vitro) đƣợc
sử dụng rộng rãi trong nhiều năm trƣớc đây vẫn đƣợc thực hiện xen kẽ khi cần
thiết (Sanger et al., 1977).
Đọc trình tự đƣợc thực hiện sau phản ứng khuếch đại DNA (nhƣ ở
phƣơng pháp Sanger) đƣợc thay thế bằng đọc trình tự thực hiện ngay trong giai
đoạn tổng hợp sợi DNA bổ sung cho sợi khuôn (phƣơng pháp pyrosequencing)
(Nyrén, 2007; Ronaghi et al., 1996, 1998). Đây là công nghệ khởi đầu cho kỹ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
19




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

thuật “đọc trình tự bằng tổng hợp”, nền tảng của kỹ thuật đọc trình tự bộ gen hay
còn gọi là kỹ thuật đọc trình tự thế hệ mới sau này. Với ƣu thế thời gian đọc
nhanh, trình tự đọc đƣợc rất chính xác, cƣờng độ phát quang định lƣợng đƣợc
nên dù trình tự đọc đƣợc không dài (
Quá trình nhân bản trên pha rắn tạo ra tới 1000 bản copy giống hệt nhau của mỗi
template trong trạn thái đứng sát nhai (trong đƣờng kính < 1 µm). Vì quá trình
này không bao gồm việc ghi ảnh, thực hiện thao tác cơ học, hay đặt các hạt bead
vào các giếng, nên mật độ của các cluster trên đơn vị diện tích đƣợc đảm bảo.
Công nghệ giải trình tự bằng tổng hợp (SBS) sử dụng 4 nucleotide đánh
dấu huỳnh quang để giải trình tự hàng chục triệu cluster đồng thời trên bề mặt
flow-cell. Trong mỗi chu trình giải trình tự, một deoxynucloside triphosphate
đánh dấu (dNTP) đƣợc thêm vào chuỗi acid nucleic. Nhãn huỳnh quang của
nucleotide đóng vai trò nhƣ một khóa dừng phản ứng polymer hóa, do đó sau
khi mỗi dNTP đƣợc tích hợp, dye huỳnh quang đƣợc ghi lại để xác định
nucleotide và sau đó bị cắt bỏ để tổng hợp nucleotide tiếp theo. Vì cả 4 loại
dNTP gắn khóa dừng tổng hợp thuận nghịch có mặt đồng thời dƣới dạng đơn
phân tử, sự cạnh tranh ngẫu nhiên giúp giảm thiểu việc tổng hợp mất cân đối.
Việc xác định các base dựa trực tiếp vào cƣờng độ tín hiệu đo đƣợc trong mỗi
chu trình, từ đó giảm thiểu các sai số thô so với công nghệ khác.
Ưu nhược điểm của hệ thống
Phƣơng pháp giải trình tự của Illumina dựa trên số lƣợng cực lớn các
đoạn đọc trình tự đồng thời. Khối lƣợng mẫu lớn và độ bao phủ đồng nhất đƣợc
sử dụng để tạo ra một tổng thể và một độ tin cậy cao đƣợc đảm bảo trong việc
xác định các biến dị di truyền. Khối lƣợng mẫu lớn cho phép sử dụng các công
cụ thống kê và cho điểm, tƣơng tự nhƣ các phƣơng pháp truyền thống trong việc
xác định thể đồng hợp, dị hợp và phân biệt các lỗi giải trình tự. Mỗi base đọc thô
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
21




Luận văn Thạc sĩ






Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

giải mã hệ gen của các vi sinh vật, các virus, các tác nhân gây bệnh; phân tích,
phát hiện các điểm đột biến; phân tích các hệ gen phiên mã. Bên cạnh đó, với
các nghiên cứu về biểu hiện gen phục vụ công nghiệp dƣợc đáp ứng thuốc,
nghiên cứu sự tác động của thuốc tới tế bào, Ứng dụng của Illumina cho phép
thay thế các công cụ trƣớc đây, cụ thể nhƣ microarray. Ngoài ra các công nghệ
hiện nay vẫn đang cải tiến liên tục, cho phép phát triển nhiều hơn nữa các ứng
dụng phục vụ trong đa dạng các lĩnh vực (Ayman and Weinbrecht 2013).
1.4.

Các nghiên cứu metagenomics trên thế giới và Việt Nam

Các nghiên cứu từ trƣớc cho thấy rằng phần lớn các vi sinh vật tồn tại
trong môi trƣờng xung quanh chúng ta không thể nuôi cấy trên môi trƣờng nhân
tạo trong phòng thí nghiệm và do đó không thể xác định trình tự DNA cũng nhƣ
nghiên cứu phân tích (Amann et al., 1995). Những nghiên cứu đầu tiên về
metagenomics đã tập trung phân tích trình tự 16S rRNA, những trình tự này
thƣờng ngắn, mang tính bảo thủ cao trong cùng một loài và khác nhau giữa các
loài (Woese 1987; Beja et al., 2002). Các nhà khoa học đã phát hiện nhiều trình
tự 16S rRNA đƣợc tìm thấy không thuộc về bất kỳ loài nào đã đƣợc phân lập
trƣớc đây. Điều này cho thấy rằng đã có rất nhiều loài vi sinh vật bị bỏ sót
không đƣợc nghiên cứu đến. Phân tích trình tự các đoạn 16S rRNA thu trực tiếp
từ môi trƣờng tự nhiên cho thấy rằng bằng phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống,

nhau cho mỗi kg trầm tích biển, bao gồm cả thể thực khuẩn (Torsvik et al.,
2002; Turnbaugh et al., 2007; Tringe et al., 2005; Rusch et al., 2007). Về cơ
bản tất cả các virus đã đƣợc phát hiện trong các nghiên cứu này đều là những
loài chƣa từng đƣợc phát hiện. Năm 2004, Tyson và các đồng nghiệp tại Đại học
California, Berkeley đã xác định trình tự DNA của hệ vi sinh vật có trong nƣớc
thải nhiễm acid (Tyson et al., 2004). Đây là một bƣớc tiến quan trọng xác định
đƣợc bộ gen hoàn chỉnh, hoặc gần nhƣ hoàn chỉnh của một số vi khuẩn mà trƣớc
đây chƣa nuôi cấy thành công (Hugenholz 2002).
Từ năm 2003, Venter đã đi vòng quanh trái đất bằng đƣờng biển nhằm thu
thập các mẫu và sử dụng công nghệ metagenomics với mục đích xác định các
genome (và theo đó là các sinh vật) mới. Dự án thí điểm, tiến hành trong vùng
biển Sargasso, phát hiện DNA của gần 2000 loài khác nhau, trong đó có 148 loài
vi khuẩn chƣa bao giờ đƣợc xác định trƣớc đây (Venter et al., 2004). Phân tích
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
24




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

hệ sinh vật đất sử dụng công nghệ metagenomics xuất hiện chậm hơn so với
những nghiên cứu phân tích hệ sinh vật biển do trong đất thƣờng tồn tại những
hợp chất liên kết với DNA hoặc ức chế phản ứng PCR, gây khó khăn cho việc
nhân bản các mẫu DNA từ đất (Daniel, 2005). Tuy nhiên trong những năm gần
đây những tiến bộ đáng kể trong nghiên cứu hệ vi sinh vật đất, xây dựng các thƣ
viện gen của các vi sinh vật này đã giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về hệ sinh
vật phức tạp này (Kakirde et al., 2010; Parachin et al., 2011).