Kho¸ luËn tèt

L« ThÞ B¶o

Chuyªn nghµnh vi

1

Líp K30b-


Khoá luận tốt

Chuyên nghành vi
Trườngưđạiưhọcưsưưphạmưhàưnộiư2

---------

Lôưthịưbảoưkhá

Phânưlập,ưtuyểnưchọnưvàưtốiưưuưhóaưmôiưtrườngưdinhưdưỡn
chếưtạoưmàngư

Khóaưluậnưtốtưnghi

Chuyênưngành:ưVi

Hàưnộiưư200

Lô Thị Bảo


7

1.2. Phân loại Acetobacter.................................................................

8

1.2.1.Các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn.........................................

8

1.2.2. Lược sử phân loại Acetobacter.................................................

9

1.3. Đặc điểm chung của Acetobacter.................................................

11

1.3.1. Đặc điểm khuẩn lạc Acetobacter..............................................

13

1.3.2. Đặc điểm màng vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng

13

1.3.3. Nhu cầu dinh dưỡng của chủng Acetobacter...........................

14


22

2.1.2. Thiết bị - hoá chất....................................................................

22

2.2. Phương pháp nghiên cứu..............................................................

24


2.2.1. Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter ...................................

24

2.2.2. Tuyển chọn Acetobacetr cho màng ........................................

25

2.2.3. Tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter thuần khiết.........................

25

2.2.4. Phân biệt vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram................

26

2.2.5. Phương pháp xác định khả năng tổng hợp axit....................

27


39

3.2.1. Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum.........

39

3.2.2. Khảo sát khả năng tạo axit axetic của vi khuẩn ................

39

3.2.3. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng ...............

42

3.2.4. Khảo sát khả năng tạo màng của vi khuẩn A.xylinum...........

43

3.3. Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển A. xylinum H6 .......

47

3.4. Tối ưu hoá môi trường dinh dưỡng cho chủng vi khuẩn H6 ........

51

3.4.1. Thiết lập mô hình toán học...................................................

52

Bảng 2.2. Cách sử lý màng……………………………………………….

34

Bảng 3.1. Quan sát thời gian dặc điểm màng tạo thành……………………..37
Bảng 3.2. Hàm lượng axit axetic của một số chủng…………………………40
Bảng 3.3. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn A. xylinum……………... 42
Bảng 3.4. Khảo sát khả năng tạo màng của vi khuẩn A. xylinum…………

43

Bảng 3.5. Khảo sát khả năng tạo màng của H6……………………………...45
Bảng 3.6. Tương quan giữa nồng độ pha loãng……………………….

48

Bảng 3.7. Thời gian nuôi cấy và hàm lượng tế bào………………………… 49
Bảng 3.8. Các yếu tố và mức khảo sát………………………………………53
Bảng 3.9. Ma trận thực nhiệm……………………………………………….54
Bảng 3.10. Kiểm tra sự thích ứng của mô hình……………………………...56
Bảng 3.11. Tối ưu hoá môi trường………………………………………

57

Bảng 3.12. Diện tích vết thương còn lại trong thực tế………………………59

Hình:
Hình 1.1. Cơ chế của quá trình oxy hoá rươụ etylic ………………………...19
Hình 3.1. Mẫu khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter nhóm 1……………………38
Hình 3.2. Mẫu khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter nhóm 3……………………38

Acetobacter (còn gọi là vi khuẩn giấm).
Vi khuẩn Acetobacter xylinum khi nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng,
trong điều kiện nuôi cấy tĩnh sẽ hình thành một lớp một lớp màng trên bề mặt
thoáng của dung dịch, màng này có bản chất là cellulose kết hợp với tế bào vi
khuẩn Acetobacter xylium. Công thức cellulose do vi khuẩn sản xuất ra cũng
giống như cellulose của tế bào thực vật nhưng nó có một số tính chất ưu việt
hơn: độ dẻo dai, độ bền cơ học, khả năng polymer hoá cao…
Nhờ vào một số đặc tính lý hoá vượt trội mà màng BC ngày nay được
coi như một nguồn polymer sinh học mới, một nguồn nguyên liệu có tiềm
năng. Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra thêm một số tính năng đặc biệt
của màng như : bám chắc vào bề mặt khi nước bốc hơi lại có thể di chuyyển
qua, ngăn cản được sự xâm nhập của vi khuẩn… [7], [8]. Nhờ đó mà màng
BC được ứng dụng trong rất nhiều các lĩnh vực khác nhau: công nghệ thực
phẩm làm thạch dừa là đồ ăn tráng miệng khá phổ biến, trong công nghệ sản
xuất giấy chất lượng cao, trong y học làm màng thay thế cho da tạm thời ở
các bệnh nhân bỏng, một loại màng siêu thấm, trong khoa học vật liệu mới


với việc sản xuất micro chất lượng cao, tác dụng trong bảo vệ môi trường do
sản xuất ra EM (Effective Micorgamisms)... [11].
Ở Việt Nam việc nghiên cứu, sử dụng màng BC mới chỉ được quan tâm
trong thời gian gần đây và mới thu được những kết quả bước đầu (dùng màng
đắp lên vết thương hở, dùng màng đắp mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ) [7], [8].
Việc nghiên cứu ra một môi trường dinh dưỡng tối ưu nhất cho chủng vi
khuẩn Acetobacter xylinum phát triển, chế tạo màng sinh học trên quy mô
công nghiệp vẫn đang là hướng nghiên cứu được nhiều tác giả quan tâm.
Với mong muốn được tìm hiểu rõ hơn, tìm ra môi trường dinh dưỡng
tối ưu cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum và những ứng dụng hữu ích
của màng BC trên cơ sở kế thừa những kết quả thu được của các tác giả đã
nghiên cứu trước mà tôi quyết định chọn đề tài: “ Phân lập, tuyển chọn và



nghiên cứu lớp màng nhầy xuất hiện trên bề mặt bia, rượu vang và đưa đến
kết luận: màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn mà ông gọi tên là
Mycoderma aceti.
Cùng với những nghiên cứu trên về vi khuẩn Acetobacter, các nghiên
cứu tiếp theo cũng như những nghiên cứu sau này đều nhằm mục đích tìm
hiểu rõ thêm và tìm cách cải thiện quá trình lên men giấm. Từng bước nghiên
cứu những ứng dụng mới của vi khuẩn Acetobacter bằng cách phân lập các
chủng vi khuẩn thuần khiết, nghiên cứu các đặc điểm cấu tạo, sinh lý, sinh
hoá của chúng để tìm ra những chủng tốt nhất cho từng ứng dụng dựa trên cơ
sở là các tiêu chuẩn phân loại đã được đưa ra.
1.2. Phân loại Acetobacter
1.2.1. Các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn Acetobacter
Để phân loại vi khuẩn Acetobacter có mốt số tiêu chuẩn phân loại :
+ Đặc điểm phân lập: là nơi cư trú có liên quan đến điều kiện môi
trường sống.
+ Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, khả năng
di động, vỏ nhầy, màu sắc khi tế bào nhuộm Gram…
+ Đặc điểm nuôi cấy: dựa vào trạng thái, đặc điểm, đặc tính (trơn, xù
xì…), tính chất (đục, trong…), màu sắc…của vết mọc (khuẩn lạc) trên môi
trường thạch. Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng cần lưu ý đến sự biến đổi của
môi trường sau một thời gian nuôi cấy (môi trường đục hay trong, có mùi
thơm hay không mùi, có màu vàng nâu hay vàng nhạt).
+ Đặc điểm sinh hoá (theo khoá phân loại của Pasteur, 1950)
- Khả năng tạo catalase
- Khả năng tổng hợp các xeto từ các rượu bậc cao như: glyxerol,
manitol, sorbitol.
- Khả năng oxi hoá axetat thành CO2 và H2O.



10

Líp K30b-


Đến năm 1936, các tác giả Kenyver, Wanneil, Staniel cùng đề xuất ý
kiến ghép vi khuẩn Acetobacter vào họ Pseudomonas do chúng co hiện tượng
ghép cực xoắn ở phần di động.
Năm 1948, Vanghn tiếp tục nghiên cứu và công bố kết quả thu được
khi quan sát sự di động của nhiều loại vi khuẩn: Acetobacter aceti,
Acetobacter oxydans, Acetobacter zancens, Acetobacter melanoginum,
Acetobacter pasteurianum. Ông kết luận những loài trên đều thuộc một loại
có đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí của vi khuẩn Acetobacter trong họ
Pseudomonadacae.
Cùng năm 1948, Krassilhicov cũng như các tác giả Mỹ nghiên cứu về
xạ khuẩn và vi khuẩn đều thống nhất xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ
Pseudomonadacae.
Năm 1914, Bergeys đã đưa ra khoá phân loại. Trong đó ông phân
Acetobacter thành 2 loại:
Loại 1: có khả năng oxi hoá axit axetic thành CO2 và H2O bao gồm:
a/ Sử dụng muối amoni làm nguồn N duy nhất (dung dịch Hoyer) đại
diện là vi khuẩn Acetobacter aceti.
b/ Không sử dụng muối amoni làm nguồn N duy nhất
+ Trên môi trường dịch thể tạo thành màng nhầy chứa cellulose, đại
diện là : Acetobacter xylinum.
+ Trên môi trường dịch thể không tạo màng nhầy chứa cellulose, đại
diện là: Acetobacter pasteurianum, Acetobacter kneiziiganus, Acetobacter
rancens
Loại 2: không có khả năng oxi hoá axit axetic.

- Acetobacter có chu mao hoặc không có chu mao.
- Gluconobacter đơn mao.
Bergey (1989), Lapent et al (1990) thì Acetobacter và Gluconobacter là
2 giống vi khuẩn quan trọng nhất của họ Acetobacteriaceae. Hai giống này
giống rất phổ biến trong tự nhiên như trên bề mặt lá, hoa quả…Chúng đều có
khả năng tạo axetic từ rượu etylic. Ở tế bào Gluconobacter không có chu trình


Tricacboxylic (ATC) nên không thể diễn ra quá trình oxi hoá axetat song lại
có một chu trình khác thay thế (chu trình Glyoxylat). Ngược lại, ở tế bào
Acetobacter xảy ra các quá trình trên.
Khi so sánh hai giống trên với

những vi khuẩn thuộc giống

Pseudomonas thấy chúng có những điểm tương đồng. Cũng có một số điểm
mà hai giống trên khác Pseudomonas như: chịu được nồng độ axit cao hơn,
khả năng chuyển hoá pepton yếu hơn, không sinh sắc tố, ít di động hơn. Một
số loài vi khuẩn axetic khi phát triển trên môi trường nghèo chất dinh dưỡng
hay thời gian nuôi cấy lâu ngày (môi trường già) hình thái dễ bị biến đổi (tế
bào phình to, kéo dài hoặc phân nhánh) [1].
Khi tiếp tục nghiên cứu hai giống với các vi khuẩn thuộc Pseudomonas
để xếp chúng thành các nhóm độc lập và thu được một số kết quả.
Bảng 1.1. Những đặc điểm phân biệt, so sánh Acetobacter,
Gluconobacter với Pseudomonas
Đặc điểm so sánh
Gluconobacte
1. Vị trí tiên mao
+
2. Phát triển ở pH = 4.5


Dấu (+/-): có hoặc không

Vi khuẩn Acetobacter là những trực khuẩn hình que hay hình elip, đứng
độc lập hay xếp thành chuỗi, kích thước khoảng 0,6 – 0,8 m, có hoặc không
có tiên mao, sống và phát triển trong điều kiện hiếu khí bắt buộc hoá dị dưỡng
hữu cơ, không sinh bào tử, bắt màu Gram âm, thích hợp với pH = 5,4 – 6,8,


0

nhiệt độ 25 – 30 C, có khả năng oxi hoá rượu etylic thành axit axetic, khả
năng oxi hoá hoàn toàn các hợp chất hữu cơ (các loại đường và dẫn xuất của
chúng) để tạo thành các hợp chất xeton hoặc các axit hữu cơ tương ứng.
1.3.1. Đặc điểm khuẩn lạc Acetobacter
Khi nghiên cứu về khuẩn lạc của vi khuẩn axetic trên môi trường đặc,
người ta thấy rằng: khuẩn lạc đều đặn, đường kính khuẩn lạc trung bình 3mm
riêng 1 số loài như: Acetobacter aceti, Acetobacter xylinum có khuẩn lạc nhỏ
hơn đường kính d = 1mm, bề mặt trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên dày
và sẫm màu hơn xung quanh.
Nhưng một số loài khác thì khuẩn lạc có đường kính nhỏ hơn (d = 4 -5
mm), bề mặt trơn nhẵn không màu, mỏng như hạt sương nhỏ, có thể dùng que
nuôi cấy tách ra khỏi môi trường dễ dàng. Tuy nhiên cũng có những khuẩn lạc
ăn sâu vào môi trường, khó có thể gạt ra bằng que nuôi cấy.
1.3.2. Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng
Ở môi trường lỏng vi khuẩn Acetobacter có sự hình thành màng trên
mặt thoáng, màng tạo thành có độ dày mỏng khác nhau và đặc điểm của các
loại màng cũng khác nhau.
Có loại màng dày như sứa, nhẵn và trơn bóng, khi lắc nhẹ sẽ chìm
xuống đáy bình và có thể tiếp tục hình thành 1 lớp màng mới.

gia của các enzym đặc hiệu.
+ Con đường thứ hai: oxy hóa cơ chất đã được photphoril hóa trong
con đường pentozophotphat.
+ Con đường thứ ba: Entner – Doudoroff (ED).
+ Con đường thứ tư: chu trình Krebs hoặc Glyoxinat


1.3.5. Đặc điểm một số loài vi khuẩn Acetobacter
1.3.5.1. Acetobacter aceti
Trực khuẩn ngắn, kích thước 0,4 – 0,8 x 1 – 1,2 m, không di động
được, thường xếp thành chuỗi dài, bắt màu Gram âm, màu vàng với thuốc
nhuộm iot. Khuẩn lạc to, sáng trên gelatin với dịch lên men chứa 10 % đường
saccarozơ tạo thành màng nhầy, nhẵn. Chúng có khả năng phát triển trên môi
trường có nồng độ rượu cao (11 %) và có thể tích luỹ đến 6 % axit axetic
trong môi trường. Chúng thường phát triển trên môi trường bia với nhiệt độ
0

thích hợp là 30 C.
1.3.5.2. Acetobacter xylinum
Trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 2 m, tế bào đứng riêng rẽ
hoặc xếp thành từng chuỗi, không di động được, thuộc nhóm vi khuẩn Gram
âm, các tế bào được bao bởi chất nhầy tạo váng nhăn và dày khi gặp H2SO4
và thuốc nhuộm iốt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của cellulose), chúng có
thể tích luỹ 4,5 % axit axetic trong môi trường.
Khi nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum trên môi trường lỏng sẽ
hình thành trên bề mặt lớp màng , màng là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên
kết với phân tử cellulose. Trong tế bào xảy ra quá trình trao đổi chất nói
chung còn ở màng cellulose xảy ra quá trình trao đổi oxy và các chất dinh
dưỡng [9].
Vi khuẩn Acetobacter xylinum thường sống chung với nấm men trong

thường xếp đôi hoặc đứng riêng rẽ, có thể tạo váng nhầy và không bền vững.
Có khả năng tích luỹ trong môi trường đến 11,5 % axit axetic, do đó thường
được sử dụng để chưyển hoá rượu thành giấm theo phương pháp Đức
(phương pháp nhanh).
1.3.5.7. Acetobacter lindreni
Trực khuẩn xếp riêng rẽ tạo chuỗi, thỉnh thoảng có tế bào phồng to hình
cầu, không di động. Khuẩn lạc trên gelatin với dịch lên men tròn, nhỏ, màu
vàng, trên môi trường lỏng tạo váng màu nâu, nhớt. Thích hợp phát triển ở
0

25 C.
1.3.5.8. Acetobacter orleanense
Trực khuẩn dài trung bình, không di động, gặp điều kiện nhiệt độ cao
có thể sinh ra tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to.Tạo váng vi khuẩn rất dày
trên môi trường lỏng. Có thể phát triển trong môi trường có nồng độ rượu cao


(10 % - 12%) và tích luỹ đến 9,5% axit axetic. Thường được dùng để chuyển
hoá rượu vang thành giấm theo phương pháp Pháp (phương pháp chậm hay
0

0

phương pháp Orleans). Thích hợp phát triển ở 25 C – 30 C.
1.3.5.9. Acetobacter suboxydans
Có dạng hình que ngắn, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi ngắn,
không có khả năng di động, tạo thành những váng mỏng, dễ vỡ. Có khả năng
chuyển hoá glucozơ thành axit gluconic, oxy hoá rượu sobit thành socboza
- dùng để sản xuất axit ascorbic – vitamin C. Loại vi khuẩn này muốn phát
triển bình thường cần được cung cấp một số chất sinh trưởng: axit para

Trực khuẩn có kích thước 0,4 – 0.6 x 1,4 – 1,6 m, không di động.
Khuẩn lạc rượu vang trên gelatin tròn trịa, hơi nhô lên, sáng, ẩm ướt, nhớt.
0

0

Nhiệt độ thích hợp từ 25 C – 30 C [4]. Hầu hết các loài Acetobacter thường
0

0

phát triển tốt nhất ở 25 C – 30 C, đều có khả năng sử dụng muối phophat, đa
số đòi hỏi cung cấp thêm vitamin, chúng có khả năng oxy hoá rượu thành axit
và trong quá trình sinh trưởng, phát triển chúng tạo ra một lớp màng dày có
bản chất cellulose trên bề mặt môi trường nuôi cấy. Với những nghiên cứu
hiện nay cho thấy lớp màng này có thể được ứng dụng vào rất nhiều nghành
quan trọng có ý nghĩa thực tiễn trong cuộc sống. Đồng thời khả năng tạo
màng của các chủng vi khuẩn trên rất khác nhau vì vậy cần phải tuyển chọn ra
những chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng tốt nhất và phù hợp với mục
đích sử dụng của từng loại màng.
1.4. Cơ sở khoa học của quá trình lên men axetic
Quá trình lên men axetic là quá trình oxi hoá rượu etylic thành axit
axetic trong môi trường khác nhau dưới tác dụng của Acetobacter.
Sự chuyển hoá rượu etylic thành axit axetic bao gồm 2 giai đoạn:
+ Giai đoạn 1: rượu chuyển hoá thành axetaldehyt
+ Giai đoạn 2: axetaldehyt chuyển hoá thành axit axetic
Quá trình lên men này được mô tả cụ thể như sau:


Hình 1.1. Cơ chế quá trình oxy hoá rượu etylic thành axit axetic

màng BC là sự kết hợp giữa cellulose và tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum.
Cellulozơ này được hình thành từ rất nhiều sợi nhỏ, các sợi này được kết hợp
với nhau dựa trên liên kết hidro và lực vandecvan do vậy các sợi nhỏ liên kết
với nhau rất chặt, một phần quy định tính chất của màng BC.
So với cellulose của tế bào thực vật thì cellulose có trong BC có cùng
công thức hoá học (là một loại polysaccarit cao phân tử, có cấu trúc bền vững,
được cấu tạo từ rất nhiều đơn phân là các gốc  1,4 glucozit. Mỗi cellulose
thường chứa khoảng từ 140 – 1000 gốc glucozơ) [12]. Tuy nhiên, do quá trình
tổng hợp cellulose khác nhau nên chúng có sự khác biệt về tính chất lý hoá
như: độ bền cơ học, khả năng polymer hoá, độ tinh sạch…ưu việt hơn hẳn tế
bào thực vật. Riêng tính đàn hồi và độ bền cơ học của cellulose trong màng
BC đã được so sánh tương đương với nhôm.
Nhờ nhưng thuộc tính đặc biệt trên mà màng BC được sử dụng rất
nhiều ở các nước phát triển, ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như: thực
phẩm, công nghiệp, nông nghiệp, bảo vệ môi trường, công nghệ vật liệu mới


…và đặc biệt với y học, màng BC ở các nước trên thế giới được nghiên cứu
và ứng dụng trong trị bỏng, làm mặt nạ dưỡng da…
Ở Việt Nam, từ những năm 2000 nhóm nghiên cứu Huỳnh Thị Ngọc
Lan và cộng sự, bộ môn vi sinh, khoa Duợc của Đại học Y Duợc Thành Phố
Hồ Chí Minh đã có một công trình nghiên cứu về màng BC từ Acetobacter
xylium. Bước đầu nghiên cứu được một số các tính chất đặc biệt của màng BC
như: khả năng thấm hút tốt, độ thông thoáng cao, có khả năng ngăn cản vi
khuẩn xâm nhập…để là cơ sở cho việc chế tạo màng sinh học dùng trong trị
bỏng ở Việt Nam. Đặc biệt, với những tính chất quý của màng BC đã và đang
hứa hẹn những ứng dụng trong y học và công nghiệp mỹ phẩm, được coi là
một vật liệu polymer có triển vọng.



(mua từ viện bỏng Quốc gia).
2.1.2.3. Môi trường [6]
Các môi trường sử dụng có thành phần như sau:
Bảng 2.1. Thành phần môi trường
Thành phần

MT1

MT2

MT3

MT4

MT5

MT6

1. Glucozơ

20g

20g

20g

20g

20g


4. MgSO4.7H2O

2g

2g

2g

2g

0g

0g

5. CaCO3

7g

0g

0g

0g

0g

0g

6. Axit axetic


0

0

200ml

0

0

9. Cao nấm men

0

0

0

5g

3g

0

10. Pepton

0

6g



0

7,5mg

0

7,5mg

0

14. Nước dừa

0

0

0

0

0

1000ml

Chú ý: axit axetic, rượu etylic được bổ sung sau khi đã khử trùng môi trường
Trong đó: MT1 là môi trường phân lập vi khuẩn giấm.
MT2 là môi trường nhân giống cơ bản
MT3 …MT6 là môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng.