TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

------

LÊ THỊ KIM HUYÊN

KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NHỮNG
CHỦNG NẤM COLLETOTRICHUM SPP. GÂY BỆNH
THÁN THƢ HẠI ỚT PHÂN BỐ Ở VÙNG ĐỒNG
BẰNG SÔNG CỬU LONG

Luận văn tốt nghiệp đại học
Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT

Cần Thơ, 2013


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

------

Luận văn tốt nghiệp đại học
Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT
Tên đề tài:

KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NHỮNG
CHỦNG NẤM COLLETOTRICHUM SPP. GÂY BỆNH

Cán bộ hƣớng dẫn

i


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

Hội đồng chấm điểm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ
ngành Bảo vệ Thực vật với tên:

“KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA
NHỮNG CHỦNG NẤM COLLETOTRICHUM SPP.
GÂY BỆNH THÁN THƢ HẠI ỚT PHÂN BỐ Ở VÙNG
ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG”
Do sinh viên Lê Thị Kim Huyên thực hiện và bảo vệ trƣớc hội đồng

Ý kiến của hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp:
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………
Luận văn tốt nghiệp hội đồng đánh giá ở mức: ………………………………

Cần Thơ, ngày… tháng… năm…

DUYỆT KHOA

Chủ tịch Hội Đồng


Các bạn lớp Bảo vệ Thực vật Khóa 35 đã gắn bó cùng tôi trong quá
trình học tập và rèn luyện, lời chúc sức khỏe, hạnh phúc và thành đạt.
Trân trọng!

Lê Thị Kim Huyên

iv


LƢỢC SỬ CÁ NHÂN
Họ và tên: Lê Thị Kim Huyên
Ngày sinh: 13/09/1991
Nơi sinh: Châu Phú, An Giang
Quê quán: xã Bĩnh Thủy, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
Quá trình học tập:
1997-2002: học tiểu học tại trƣờng tiểu học A Bình Thủy, xã Bình Thủy, huyện
Châu Phú, tỉnh An Giang
2002-2006: học THCS tại trƣờng THCS Bình Thủy, xã Bình Thủy, huyện Châu
Phú, tỉnh An Giang
2006-2009: học THPT tại trƣờng THPT Bình Mỹ, xã Bình Mỹ, huyện Châu Phú,
tỉnh An Giang
2009-2013: học đại học tại trƣờng Đại học Cần Thơ, ngành Bảo vệ Thực vật khóa
35, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng Dụng.

v


LÊ THỊ KIM HUYÊN, 2013. “KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA
NHỮNG CHỦNG NẤM COLLETOTRICHUM SPP. GÂY BỆNH THÁN THƢ
HẠI ỚT PHÂN BỐ Ở VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG”. Luận văn tốt

- Dựa vào sơ đồ phân nhánh cho thấy, 51 chủng nấm gây bệnh thán thƣ hại
ớt đƣợc chia thành 2 nhóm: nhóm 1 chỉ duy nhất 1 chủng nấm và dựa vào đặc điểm
hình thái khuẩn lạc, hình dạng bào tử có thể chúng thuộc loài Colletotrichum
capsici. Nhóm 2 là nhóm lớn gồm 50 chủng nấm còn lại và dựa vào đặc điểm khuẩn
lạc, hình dạng bào tử có thể chúng thuộc loài Colletotrichum acutatum. Nhóm 2
đƣợc chia ra thành 3 nhóm phụ 2A, 2B và 2C.

vii


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa ……………………………………………………………………….i
Trang duyệt luận văn ……………………………………………………………….ii
Lời cam đoan……………………………………………………………………….iii
Lời cảm tạ…………………………………………………………………………..iv
Lƣợc sử cá nhân…………………………………………………………………….v
Tóm lƣợc…………………………………………………………………………...vi
Mục lục…………………………………………………………………………....viii
Danh sách từ viết tắt………………………………………………………………...xi
Danh sách bảng………………………………………………………………….....xii
Danh sách hình…………………………………………………………………....xiii
MỞ ĐẦU……………….. ...........................................................................................1
CHƢƠNG 1

LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................2

1.1 NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA CÂY ỚT ...............................2
1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố ...........................................................................2
1.1.2 Yêu cầu về ngoại cảnh ................................................................................2


2.1 PHƢƠNG TIỆN ..............................................................................................14
2.2 PHƢƠNG PHÁP .............................................................................................15
2.2.1 Thu thập, phân lập và nuôi cấy mẫu nấm gây bệnh .................................15
2.2.1.1 Thu thập mẫu bệnh .............................................................................15
2.2.1.2 Phân lập và nuôi cấy nấm bệnh .........................................................15
2.2.1.3 Xác định và so sánh đặc tính sinh học của những chủng nấm gây
bệnh ................................................................................................................16
2.2.2 Phân tích sự đa dạng di truyền ..................................................................16
2.2.2.1 Ly trích AND ......................................................................................16

ix


2.2.2.2 Thực hiện phản ứng PCR ...................................................................17
2.2.2.3 Phân tích số liệu .................................................................................17
CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ THẢO LUẬN ..............................................................18

3.1 ĐẶC TÍNH SINH HỌC ..................................................................................18
3.2 ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM COLLETOTRICHUM
SPP. .......................................................................................................................26
CHƢƠNG 4

KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ.................................................................34

4.1 KẾT LUẬN .....................................................................................................34
4.2 ĐỀ NGHỊ .........................................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................35

Đặc điểm khuẩn lạc, hình dạng bào tử của 51 mẫu nấm

18

Colletotrichum spp. gây bệnh thán thƣ hại ớt thu thập tại một số tỉnh
Đồng bằng sông Cửu Long
Bảng 3.2

Mức độ tƣơng đồng của 51 chủng nấm Colletotrichum spp.

xii

29


DANH SÁCH HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Triệu chứng thán thƣ trên trái

4

Hình 1.2



Bào tử dạng thẳng mẫu nấm VL06.12-10

26

Hình 3.5

Sản phẩm PCR đƣợc khuyếch đại dựa vào kỹ thuật RAPD với

27

primer S1136: GTGTCGAGTC
Hình 3.6

Sơ đồ phân nhóm quan hệ di truyền của 51 chủng nấm
Colletotrichum spp. gây bệnh thán thƣ hại ớt phân bố ở vùng
ĐBSCL dựa trên kỹ thuật RAPD với 5 primer S1027, S1136, S1320,
S1265 và S1189. Phần trăm giá trị bootstrap từ 1.000 lặp lại đƣợc
ghi trên các nhánh.

xiii

28


MỞ ĐẦU
Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là một vùng nông nghiệp lớn nhất của cả
nƣớc do điều kiện đất đai, khí hậu thuận lợi. Không những chỉ cây lúa, cây rau màu
hiện nay đã và đang đƣợc gieo trồng với diện tích ngày càng tăng. Trong đó, ớt
đang đƣợc xem là loại cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao trong chiến lƣợc

LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA CÂY ỚT
1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố
Ớt là một loại quả thuộc chi capsicum, thộc họ Cà (Solanaceae) có nguồn
gốc từ châu Mĩ. Ngày nay ớt đƣợc trồng rộng rãi ở nhiều nƣớc và là một trong
những cây trồng quan trọng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Ratanacherdchai và
ctv., 2007).
Theo thống kê của FAO năm 2009 diện tích trồng ớt trên thế giới khoảng
1.870.000 hecta trong đó châu Á chiếm diện tích cao nhất. Ở nƣớc ta, tổng diện tích
trồng ớt khoảng 5.000 hecta cho một vụ trồng tại 18 tỉnh, thành từ Bắc vào Nam và
từ vùng cao đến vùng thấp (Le Dinh Don và ctv., 2007).
1.1.2 Yêu cầu về ngoại cảnh
1.1.2.1 Nhiệt độ
Nhiệt độ thích hợp cho ớt là 25-320C. Nhiệt độ cao trên 320C cây tăng
trƣởng kém, hoa dễ rụng (Trần Thị Ba và ctv.,1999).
1.1.2.2 Độ ẩm
Ớt rất thích hợp điều kiện thời tiết ẩm, ẩm trong điều kiện khô hạn sẽ kích
thích quá trình chín của quả. Độ ẩm thích hợp cho sự phát triển của cây ớt là 7080%. Độ ẩm quá cao sẽ làm cho ớt sinh trƣởng kém phát triển, còi cọc (Mai Thị
Phƣơng Anh, 1999).
1.1.2.3 Đất và dinh dưỡng
Cây ớt thích hợp với đất thịt nhẹ hoặc pha cát dễ thoát nƣớc. Tốt nhất là đất
bãi bồi hằng năm có ngập phù sa hoặc đất đồng có độ màu mỡ cao, thoát nƣớc và
giải nắng (Trần Khắc Thi, 2005).
1.1.2.4 Sâu bệnh hại trên ớt
Bệnh hại trên ớt gồm thối rễ do nấm Phytophthora capsici, thối gốc do nấm
Sclerotium rolfsii, héo do vi khuẩn Ralstonia solanacearum, bệnh thán thƣ do nấm
Colletotrichum spp., bƣớu rễ tuyến trùng Meloidogyne sp., bệnh virus,…
2


(Hình 1.1) về sau chuyển sang dạng hình elip hoặc tròn, lõm xuống, xếp đồng tâm
3


(Nguyễn Thị Quế Phƣơng, 2003; Sharma, 2006; Vũ Triệu Mân, 2007a; Phạm Thu
Thảo, 2007; Burgess và ctv., 2008; Roberts và ctv., 2009). Trên bề mặt vết bệnh
thƣờng ẩm ƣớt và đƣợc phủ bởi một khối bào tử. Trong một số trƣờng hợp vết bệnh
có thể có màu nâu sau hóa đen do sự hình thành gai cứng và hạch nấm (Roberts và
ctv., 2009). Nặng hơn, bệnh hiễm cả vào hạt, lúc này sẽ thấy nhiều tơ nấm bao
quanh hạt (Hình 1.2). Các hạt nhiễm thƣờng có màu rỉ sắt (Sharma, 2006). Ở mức
độ nặng, các vết bệnh có thể liên kết lại và gây hại toàn bộ bề mặt trái.

Hình 1.1 Triệu chứng thán thƣ trên trái (Nguồn: Nayaka và ctv., 2009)

Hình 1.2 Triệu chứng thán thƣ trên hạt (Nguồn: Nayaka và ctv., 2009)

Theo trung tâm nghiên cứu phát triển rau Á Châu (AVRDC), từ vết bệnh trên
trái bào tử nấm nhanh chóng đƣợc tạo ra và có thể lan khắp các ruộng trồng ớt, kết
quả dẫn đến 100% ruộng ớt bị nhiễm. Ngoài ra bệnh còn xuất hiện trên cành, lá với
4


triệu chứng là những đốm màu nâu xám không đều với đƣờng mép trên lá màu nâu
sẫm. Bệnh có thể nhiễm trên trái còn xanh nhƣng triệu chứng không xuất hiện cho
đến khi trái chín. Sự xâm nhiễm nhƣ vậy gọi là xâm nhiễm tiềm ẩn.
1.2.3 Các điều kiện ảnh hƣởng đến sự phát triển của bệnh
1.2.3.1 Nhiệt độ
Theo AVRDC (2004), sự xâm nhiễm có thể xảy ra ở nhiệt độ 10-300C.
Nhƣng nhiệt độ thích hợp là 20-240C.
Nhiệt độ khoảng 270C là tối hảo cho bệnh thán thƣ phát triển (Roberts và

chủng nấm và điều kiện ở địa phƣơng.
1.2.4 Tác nhân gây bệnh
Bệnh thán thƣ do nấm Colletotrichum spp. gây ra. Nấm Colletotrichum thuộc
lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), bộ nấm đĩa đài (Molanconiales), là nguyên
nhân gây hại trên nhiều loại cây trồng nhƣ: xoài, cây họ cà, dâu tây, bầu bí dƣa, một
số loại hoa kiểng,… (Agrios, 2005). Sợi nấm có vách ngăn và màng sinh chất trong
suốt. Ở giai đoạn sinh sản vô tính cho ra các bào tử đính. Bào tử đơn bào có dạng
hình thoi, hình liềm hoặc hình trụ, không màu; đĩa đài có gai cứng màu nâu sẫm
nhọn ở hai đầu có nhiều vách ngăn. Ở giai đoạn sinh sản hữu tính, nấm
Colletotrichum thuộc lớp nấm nang (Ascomycetes) có tên là Glomerella cũng cho
ra dạng bào tử đơn bào (Agrios, 1997, Barry B. Hunter, 1998 do Nguyễn Thị Quế
Phƣơng, 2003 trích dẫn). Nhiều loài nấm Colletotrichum khác nhau đƣợc tìm thấy
trên ớt. Bốn loài phổ biến là

Colletotrichum capsici, C. gloeosporioides, C.

coccodes, C. acutatum (AVRDC, 2003). Hai loài C. gloeosporioides, C. capsici
đƣợc tìm thấy tại Thái Lan cũng là hai loài gây hại chính tại Nam Mĩ và châu Á đặc
biệt là vùng nhiệt đới của châu Á. C. capsici xâm nhiễm trên trái chín còn C.
gloeosporioides xâm nhiễm cả trên trái xanh lẫn trái chín (Intra và ctv., 2011).
Ngoài 4 loài nấm nói trên tác nhân gây bệnh thán thƣ ớt còn có C. nigrum
(Vũ Triệu Mân, 2007b), C. trichellum, C. dematium (Hong và Hwang, 1998), và
một loài nấm mà chƣa có tác giả nào giám định trƣớc đây đƣợc Nguyễn Thị
Nghiêm và Nguyễn Thị Quế Phƣơng (2003) ghi nhận là C. corchori.

6


Bảng 1.1 Một số loài Colletotrichum spp. đã đƣợc ghi nhận trên một số nƣớc trên thế giới



acutatum. Trong đó, C. capsici là chủ

(2007)

yếu.
USA

C. acutatum

Roberts và ctv. (2001)

Đài Loan

C. acutatum, C. boninense, C.

Sheu và ctv. (2007)

gloeosporioides và C. capsici
Florida

C. gloeosporioides, C. capsici và C.

Roberts và ctv. (2009)

coccodes
Việt Nam

C. acutatum, C. trichellum, C.


cầu, có đƣờng kính từ 70-120 μm với nhiều gai cứng nằm rải rác, màu nâu đen có
vách ngăn và dài trên 150 μm (Sharma, 2006).
- Colletotrichum acutatum: Khuẩn lạc có màu hơi cam, sợi nấm mỏng manh. Bào tử
hình gậy, không vách ngăn, một đầu cùn (Verma và ctv., 2006; Förster và
Adaskaveg, 1999), kích thƣớc 8-16 x 2,5-4 μm, không có gai cứng. Đĩa áp có kích
thƣớc 6,5-11 x 4,5-7,5μm (Mordue, 1979; Sutton, 1980).
- Colletotrichum coccodes: Bào tử hình trụ, nhọn ở hai đầu, kích thƣớc 16-22 x 3-4
μm. Đĩa áp hình chùy, dài, màu hơi nâu, không đều, kích thƣớc 11-16,5 μm x 6-9,5
μm, trong điều kiện tối C. coccodes có khả năng hình thành gai cứng trong môi
trƣờng PDA (Sutton, 1980; trích dẫn Nguyễn Văn Đông, 2002).
1.2.5.2 Đặc tính sinh học
Vòng đời của các loài Colletotrichum spp. thƣờng bao gồm giai đoạn hữu
tính và giai đoạn vô tính. Nhìn chung, giai đoạn sinh sản hữu tính dẫn đến sự đa
dạng di truyền của quần thể nấm còn giai đoạn sinh sản vô tính có vai trò trong sự
phát tán của nấm. Sự kết hợp theo kiểu hữu tính trong các loài Colletotrichum spp.
thƣờng hiếm gặp trong tự nhiên. Chỉ có khoảng 11 trong số 20 loài Colletotrichum
spp. có giai đoạn hữu tính Glomerella (Chilton và Wheeler, 1949; Wheeler, 1954trích dẫn bởi Wharton và Diéguez-Uribeondo, 2004).
8


Các loài Colletotrichum spp. thƣờng có loại gene có khả năng chuyển đổi từ
dạng sống ký sinh bắt buộc (biotrophy) sang dạng sống hoại sinh (necrotrophy).
Giai đoạn đầu sau khi xâm nhiễm vào cây kí chủ, nấm sống bên trong dƣới lớp
cutin của cây kí chủ và phát triển trong vách tế bào biểu bì để lấy dinh dƣỡng sau đó
chúng phát triển trên bề mặt tế bào chết để sống theo kiểu hoại sinh. Đối với loài
Colletotrichum capsici, xâm nhiễm vào bên trong tế bào qua các ngã gian bào của tế
bào kí chủ, sau đó không ngừng gia tăng mật số bên trong mô và dần dần làm chết
hoàn toàn các mô này (Mendgen và Hahn, 2002). Nguyên nhân là do trong quá trình
phát triển, chúng tiết ra enzyme và độc tố để phân hủy vách tế bào và nguyên sinh
chất của tế bào kí chủ (Phạm Văn Kim, 2005). Loài Colletotrichum gloeosporioides


A: đĩa áp (appressorium);

Cu: biểu bì (cuticle);

PP: hình thành vòi xâm nhiễm (penetration pore and peg);
ILS: đốm sáng (internal light spot); PH: sợi nấm sơ cấp (primary hyphae);
E: mô biểu bì (epidermal); M: tế bào thịt lá (mesophyll cells); N: hoại sinh (necrotrophic);
SH: sợi nấm thứ cấp (secondary hyphae);

ScH: dƣới lớp biểu bì (subcuticular)

Bào tử (C) mọc mầm và hình thành đĩa áp (A), đĩa áp hình thành vòi xâm nhiễm (PP) xâm nhập
qua lớp biểu bì (Cu) của tế bào kí chủ và trên đĩa áp xuất hiện đốm màu sáng (ILS). Ở hình A, với
cách xâm nhiễm bán kí sinh, vòi xâm nhiễm xuyên qua tế bào biểu bì của kí chủ và phồng to lên
tạo ra khoang xâm nhiễm với sợi nấm có kích thƣớc lớn, đƣợc gọi là sợi nấm sơ cấp (PH), sợi nấm
này có thể định vị lan sang các mô biểu bì (E) và tế bào thịt lá (M) kế cận. Trong giai đoạn đầu của
sự định cƣ này, sự tƣơng tác giữa kí chủ và mầm bệnh là kí sinh bắt buộc. Tiếp theo sau là giai
đoạn hoại sinh (N), sự tƣơng tác đƣợc thể hiện qua sự hình thành sợi nấm thứ cấp mỏng (SH). Các
sợi nấm thứ cấp này đâm xuyên vào trong các tế bào và len lỏi theo các ngã gian bào đồng thời tiết
enzyme phân hủy vách tế bào và giết chết tế bào kí chủ. Ở hình B là cách xâm nhiễm kiểu hoại
sinh, sự định cƣ trong tế bào kí chủ bắt đầu ở bên dƣới lớp biểu bì (ScH), và thƣờng không có giai
đoạn kí sinh của sợi nấm bên trong vách hoặc nếu có thì giai đoạn này rất ngắn. Nấm lây lan nhanh
chóng qua các mô, đi vào trong tế bào và qua các ngã gian bào (Wharton và Diéguez-Uribeondo,
2004).

10