BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MAN THANH LONG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA CÂY BÁT GIÁC LIÊN
(DYSOSMA DIFFORMIS)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI 2018


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MAN THANH LONG
Mã sinh viên: 1301253

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA CÂY BÁT GIÁC LIÊN
(DYSOSMA DIFFORMIS)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1.PGS.TS. Bùi Hồng Cƣờng
2.DS. Nguyễn Thị Dung
Nơi thực hiện:
1.Viện Dƣợc liệu
2.Bộ môn Dƣợc học cổ truyền


1.1. Tổng quan về chi Dysosma ................................................................................. 2
1.1.1. Về vị trí phân loại........................................................................................... 2
1.1.2. Về đặc điểm thực vật chung .......................................................................... 2
1.1.3. Về thành phần hóa học ................................................................................. 2
1.1.4. Về tác dụng sinh học và độc tính .................................................................. 5
1.1.5. Về tác dụng, công dụng và một số bài thuốc trong YHCT .......................... 8
1.2. Tổng quan về cây Bát giác liên (Dysosma difformis) ...................................... 10
1.2.1. Về vị trí phân loại......................................................................................... 10
1.2.2. Về đặc điểm thực vật và phân bố ................................................................ 10
1.2.3. Về thành phần hóa học ............................................................................... 11
1.2.4. Về tác dụng sinh học ................................................................................... 13
1.2.5. Về công dụng và bài thuốc trong YHCT..................................................... 13
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 15
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu và phƣơng tiện nghiên cứu...................................... 15
2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................. 15
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu .............................................................................. 15
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................. 16
2.2.1. Phương pháp chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn .............................. 16
2.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học ............................................................ 16
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................. 19
3.1. Kết quả chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn ............................................ 19
3.1.1. Chiết xuất ..................................................................................................... 19
3.2. Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất trong phân đoạn ethyl
acetat từ dịch chiết Bát giác liên. ............................................................................ 20
3.2.1. Phân lập một số hợp chất từ cắn ethyl acetat ............................................. 20
3.2.2. Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập .......................................................... 22


3.2.3. Xác định các hợp chất phân lập
được ........................................................25

YHCT: Y học cổ truyền
δ: Độ dịch chuyển hóa học


DANH MỤC BẢNG

TRANG

Bảng 1.1. Các chất phân lập được từ một số loài Dysosma

3

Bảng 1.2. Công dụng của một số loài Dysosma

9

Bảng 3.1. Khối lượng các cắn phân đoạn dịch chiết ethanol

19

Bảng 3.2. Kết quả SKLM của 2 chất với 3 hệ dung môi

24

Bảng 3.3. Đối chiếu phổ 13C-NMR, 1H-NMR của hợp chất 1 với dữ liệu

25

Bảng 3.4. Đối chiếu phổ 13C-NMR, 1H-NMR của hợp chất 2 với dữ liệu


20

Hình 3.2. Sắc ký đồ của cắn ethyl acetat (EtOAc) và 7 phân đoạn

21

Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat

22

Hình 3.4. Sắc ký đồ của PĐ2, hợp chất 2, PĐ1, hợp chất 1 hệ I

23

Hình 3.5. Sắc ký đồ của PĐ2, hợp chất 2, PĐ1, hợp chất 1 hệ II

23

Hình 3.6. Sắc ký đồ của PĐ2, hợp chất 2, PĐ1, hợp chất 1 hệ III

24

Hình 3.7. Hợp chất 1 phân lập được

26

Hình 3.8. Cấu trúc hóa học và phổ NMR của hợp chất 1

27


liên (Dysosma difformis)” được thực hiện với mục tiêu sau:
- Chiết xuất, phân lập 1-2 chất tinh khiết từ phần dưới mặt đất của loài Bát giác
liên (Dysosma difformis) thu hái ở Sa Pa, Lào Cai.
- Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được.

1


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chi Dysosma
1.1.1. Về vị trí phân loại
Theo khung phân loại ngành Ngọc lan, vị trí phân loại của chi Dysosma được
thể hiện như sau [1], [3]:
Giới thực vật: Plantae
Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta
Lớp Ngọc lan: Magnoliosida
Bộ Hoàng liên: Ranunculales
Họ Hoàng liên gai: Berberidaceae
Chi: Dysosma
Theo Shaw, chi Dysosma được bao gồm trong chi Podophyllum [25], nên theo
nhiều công bố gần đây, một số loài thuộc chi Podophyllum được sắp xếp thuộc chi
Dysosma.
1.1.2. Về đặc điểm thực vật chung
Cây thảo, sống lâu năm. Thân rễ bò, nhiều mấu, nhiều rễ con. Phần trên mặt đất
thẳng, có lá bắc lớn bao quanh gốc. Lá hình khiên, xẻ sâu hoặc chia 3-9 thùy. Hoa mọc
thành cụm hoặc chùm tán. Lá đài 6, thoái hóa. Cánh tràng 6, màu đỏ tía. Cuống hoa rủ
xuống, chiều dài như nhau. Bao phấn hướng trong, tự khai. Nhụy hoa đơn độc, bầu 1
ô, nhiều lá noãn, đầu nhụy hình cầu. Quả mọng màu đỏ hoặc tím đỏ. Hạt nhiều, phần
thịt quả ít [25].
1.1.3. Về thành phần hóa học


thân rễ

podophyllotoxin

[45]

glucosid,

(Podophyllum

deoxypodophyllotoxin,

hexandrum)

dimethylpodophyllotoxin

4´glucosid,

4´-

demethylisopicropodophyllon,
podophyllotoxon,

picropodophyllotoxin,

isopicropodophyllon,

4´-



podophyllotoxin,

dehydropodophyllotoxin,

diphyllin,

podophyllotoxone, quercetin, quercetin 3-Oglucopyranoside, kaempferol, kaempferol 3-Oglucopyranoside, acacetin.
Dysosma

Rễ

podophyllotoxin,

α-peltatin,

versipellis

podophyllotoxin

(Podophyllum

demethylpodophyllotoxin,

versipelle)

deoxypodophyllotoxin,

[22],


picropodophyllotoxin-4-O-β-D-glucopyranosyl
(1→6)-β-D-glucopyranosid,
quercetin,

daucosterol,

quercetin-3-O-β-D-glucopyranosid,

kaempferol,

kaempferol-3-O-β-D-

glucopyranosid, β-sitosterol.
Dysosma

Thân

Sikkimotoxin.

[13]

aurantiocaulis rễ
(Podophyllum
sikkimense)

R2

R1

Podophyllotoxin: R1=OH, R2=H, R3=CH3

O

O

O

H3CO

H3CO

OCH3

OCH3
OR

OR

α-peltatin: R=H

Podophyllotoxon: R=CH3

β-peltatin: R=CH3

4´-Demethylpodophyllotoxon: R=H

Hình 1.1. Một số hợp chất lignan trong một số loài Dysosma

4



5


diisobutyl ester), BADE (1,2-benzendicarboxylic acid, ester diisooctyl), Polyneuridin,
PODD (Deoxypodophyllotoxin), β-sitosterol và POD (Podophyllotoxin) có khả năng
chống oxy hoá ở một mức độ nhất định. PODD, POD và Polyneuridin có khả năng
chống oxy hoá mạnh hơn với các giá trị IC50 và FRAP là 9,61 ± 0,81 và 2923,98 ±
21,89 μM; 9,98 ± 0,24 và 2847,27 ± 14,82 μM; 13,37 ± 0,35 và 2404,32 ± 36,88 μM
so với chất đối chứng ASA (Ascorbic acid) với các giá trị là 60,78 ± 1,22 và 1267,5 ±
30,24 μM ( p< 0,01) [40].
 Tác dụng kháng virus
Việc điều tra hoạt tính kháng virus của các lignan phân lập từ các loài Dysosma
bắt đầu bằng việc sử dụng một dịch chiết cồn chống lại chứng chuột bạch (một loại
bệnh do papillomavirus gây ra) [37]. Bedows và Hatfield đã chỉ ra rằng
podophyllotoxin, deoxypodophyllotoxin, và β-peltatin có hoạt tính chống lại virus sởi
(virus ARN) và virus Herpes simplex I (HSV-I, virus ADN). Họ đề xuất rằng hoạt tính
này có thể là do sự phá vỡ các tế bào vi khuẩn gây cản trở sự nhân lên của virus [12].
Ngoài ra, một số dẫn chất podophyllotoxin từ dịch chiết của một số loài
Dysosma cho thấy sự ức chế sự sao chép của HIV do ức chế virus sao chép ngược
[10]. Macrae và cộng sự đánh giá hoạt tính kháng virus của podophyllotoxin, αpeltatin, và diphyllin trên Cytomegalovirus murin (MCMV, virus ADN) và virus
Sindbis (virus ARN). Podophyllotoxin (241 nM) và α-peltatin (250 nM) cho thấy có sự
ức chế tốt đối với virus MCMV (74 và 85%) và ức chế thấp kém virus Sindbis (3 và
5% tương ứng) [37].
Castro cùng cộng sự đã tổng hợp một số dẫn xuất podophyllotoxin (sửa đổi ở
vòng E) và đánh giá khả năng chống lại virus herpes simplex II (HSV-II). Trong các
chất tạo ra, có hai dẫn chất của podophyllotoxin có hoạt tính cao ở hàm lượng 23 và 25
μg/ml [36].
 Tác dụng bảo vệ gan
Bằng cách đo các thông số sinh hóa khác nhau (như alanin aminotransaminase,
aspartat aminotransaminase, lactat dehydrogenase và các enzym chống oxy hóa trong

này đều có hoạt tính diệt côn trùng đối với Culex pipiens molestus (95% tỷ lệ chết ở 20
ppm và 85% tỷ lệ chết ở 500 ppm) và đối với ấu trùng Epilachna sparsa orientalis
(90% tỷ lệ chết ở 20 ppm) [29]. Theo một nghiên cứu khác của Russell và cộng sự với
β-peltatin-A-methyl ether đã đưa ra kết quả 98% tỷ lệ chết của ruồi nhà (Musca
domestica) ở 100 ppm trong chế độ ăn uống được xác định về mặt hoá học [46].
Do tác động ức chế miễn dịch rõ nét bởi etoposid và các chất tương tự
podophyllotoxin (được phân lập từ các loài Dysosma), các nghiên cứu đã dẫn tới sự
7


phát triển của CPH 82, là hỗn hợp của hai podophyllotoxin glucosid. CPH 82 là một
thuốc chống huyết khối không có cấu trúc steroid, được sử dụng trong điều trị viêm
khớp dạng thấp [52]. Ngoài ra, một số loài thuộc chi Dysosma còn có tác dụng diệt
nấm, chống sốt rét [50].
1.1.4.2. Độc tính
Phần lớn các loài của chi Dysosma (D. difformis, D. majorensis, D. veitchii, D.
versipellis) đều có mức độ gây độc trung bình [27]. Nghiên cứu trên chuột thí nghiệm
của X Xu và cộng sự (2013) đã chỉ ra rằng ngộ độc cấp tính Dysoma versipellis
(Podophyllum versipelle) có thể gây ra sự thay đổi bệnh lý đa cơ quan. Có mối tương
quan chặt chẽ giữa độc tính và liều lượng. Các mô và các cơ quan đích là não, tim, gan
và thận [53].
Nghiên cứu của Wei-Fong Kao và cộng sự (1992) đã chỉ ra một số tác dụng
phụ, độc tính có thể gặp phải khi sử dụng dịch chiết Dysosma pleiantha (Podophyllum
pleianthum) bao gồm buồn nôn, nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng, giảm tiểu cầu, giảm
bạch cầu, xét nghiệm chức năng gan bất thường, mất điều hòa cảm giác, thay đổi ý
thức và ngứa ran ngoại vi hoặc tê liệt [31].
1.1.5. Về tác dụng, công dụng và một số bài thuốc trong YHCT
1.1.5.1. Tác dụng, công dụng
Theo Dewick (1996), việc sử dụng các loài Dysosma bắt nguồn từ nền văn hoá
Trung Quốc, nơi những cây này đã được dùng từ hơn 2000 năm trước như là một loại


(P. pleianthum)

hạch to, khối u, đau đầu mạn tính, u xơ gan, đau
thắt lưng.

Dysosma emodi

Bảo vệ gan, chống ung thư, kháng nấm, có khả [51]

(P. hexandrum)

năng ức chế ADN, ARN và tổng hợp protein,
chữa các vết thương, vết loét.

Dysosma versipellis

Bảo vệ gan in vivo, điều trị mụn nhọt, ung thư [30], [39],

(P. versipelle)

vú, tràng nhạc, chữa rắn cắn.

Dysosma

Gây nôn, xổ, gây độc tế bào, chống ung thư, [19], [32],

aurantiocaulis

điều trị bệnh thiếu máu cục bộ, điều trị táo bón [45], [47]

cữu [8] có tên khoa học là Dysosma difformis (Hemsley & E. H. Wilson) T. H. Wang
(tên

đồng

nghĩa

là

Dysosma

tonkinensis (Gagnepain)

Hiroe;

Podophyllum

tonkinense Gagnepain; Podophyllum difforme Hemsley & E. H. Wilson; Podophyllum
triangulum Handel-Mazzetti) thuộc chi Dysosma, họ Hoàng liên gai (Berberidaceae),
bộ Hoàng liên (Ranunculales), lớp Ngọc lan (Magnoliosida), ngành Ngọc lan
(Magnoliophyta) [1], [3].
1.2.2. Về đặc điểm thực vật và phân bố
Cây thảo, cao 15 cm đến 30 cm. Thân rễ thường hình trụ, cứng, chia nhiều đốt,
có nhiều rễ nhỏ hình sợi, nhiều xơ. Phần trên mặt đất thẳng, có màu đỏ tía, nhẵn,
đường kính 0,5 - 1 cm. Lá mọc xen kẽ, thường có 1 - 2 cái, phiến lá hình khiên chéo,
có kích thước khác nhau, chủ yếu không phân thùy. Nhánh trên cùng với 1 lá (“nhất
chi hoa”) nên có dạng cuống dài. Cuống lá khác nhau về chiều dài, nhẵn, 20 - 40 cm.
Mặt trên phiến lá có màu đỏ tía kích thước 5 - 11 x 7 - 15 cm, phiến lá mỏng, cả hai bề
mặt nhẵn, gốc lá thường tròn. Mép lá rải rác có hoặc rất ít răng cưa. Hoa mọc từ gần
cuống lá, hình lồng đèn. Cụm hoa có từ 2 - 5 hoa. Cuống 1 - 2 cm, rủ xuống, phủ một

Năm 2014, Jie Zhang (Trung Quốc) cùng các cộng sự đã đồng thời xác định
được 5 hợp chất có hoạt tính sinh học từ thân rễ cây bát giác liên (Dysosma difformis)
bằng HPLC gồm 4 flavonoid là quercetin (5), kaempferol (4), rutin (6) và quercitrin
(7); và một lignan: podophyllotoxin (1) [54].

11


R2
O

OH
O
O

HO

O
O

OR1
OH

OCH3

O

OCH3
OCH3



O

H

H3CO

H

O

OCH3

H3CO

OCH3

O

OCH3
OCH3

Picropodophyllotoxin (2)

Podophyllotoxin (1)

Hình 1.3. Một số thành phần hóa học có trong Bát giác liên (Dysosma difformis)
Ở Việt Nam, nghiên cứu về cây bát giác liên nói chung và thành phần hóa học
của loài này nói riêng là một vấn đề mới. Cho đến nay, chỉ có một nghiên cứu về cây
bát giác liên của tác giả Cao Thanh Mai (2014) đã công bố. Nghiên cứu đã mô tả được

mg/kg. Do có độc tính lớn nên podophyllotoxin không thể được sử dụng trực tiếp trên
lâm sàng. Người ta cải tiến cấu trúc hóa học, dùng các chất có độ độc thấp hơn và đã
được ứng dụng có kết quả trên lâm sàng trong điều trị một số bệnh ung thư [8], [30].
Các chất flavonoid trong Dysosma difformis bao gồm kaempferol, quercetin,
rutin và quercitrin có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau: như kháng virus, kháng
khuẩn, chống viêm, giảm ho, lợi đờm trong viêm phế quản mạn tính, chống ung thư và
các hoạt động chống oxy hoá [8], [54], [39].
1.2.5. Về công dụng và bài thuốc trong YHCT
1.2.5.1. Tính vị, công năng

13


Bát giác liên có vị đắng, cay, tính bình, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, hóa
đờm, tán kết, khử ứ, tiêu thũng. Có độc nhẹ [8].
1.2.5.2. Công dụng
Ở Trung Quốc, bát giác liên được sử dụng khá phổ biến trong y học cổ truyền
với các công dụng: điều trị vết thương nhiễm độc bắt đầu sưng lên, nhọt, chấn thương,
loại trừ vết bầm tím, rắn cắn, bệnh tràng nhạc, Herpes zoster, đau họng, đờm ho, ho
lao, hen, thương hàn, suy nhược cơ thể, đổ mồ hôi, nôn ra máu, đau dạ dày [5], [8].
Ở Việt Nam, bát giác liên ít được sử dụng. Một số địa phương thường dùng bát
giác liên để chữa rắn cắn, sưng tấy, áp xe, mụn nhọt, lở ngứa, sưng yết hầu. Liều dùng:
3 - 9 gam sắc nước uống trong ngày, hoặc chế thành hoàn tán. Dùng ngoài bằng cách
giã nát cây tươi đắp tại chỗ hoặc rễ mài lấy nước bôi. Dùng ngoài không kể liều lượng
[5], [8]. Ngoài ra, bát giác liên (Dysosma difformis) còn có công dụng giải độc gan,
tiêu đờm, chữa quai bị, loại trừ vết bầm tím, bệnh tràng nhạc [2].
Chú ý: phụ nữ có thai không được dùng [8].
1.2.5.3. Bài thuốc
Ung thư vú: bát giác liên, hoàng đỗ quyên mỗi vị 15 gam, tử bối kì 30 gam,
ngâm trong 500 ml rượu vang trắng trong 7 ngày, ngày uống 2 - 3 lần, 10 - 15 ml/lần.



- Máy cất quay chân không Buchi Rotavapor R-200.
- Bình cầu dung tích 50 - 2000 mL.
- Ống nghiệm, ống effendorf đựng mẫu NMR.
- Bếp cách thủy (Memmert, WB - 14 LO).
- Hệ thống hứng mẫu tự động CF-2 Fraction Collector.
- Hệ thống chấm mẫu CAMAG Linomat 5.
- Máy quang phổ UV-Vis Cary 1E.
- Cột sắc kí: các loại cột đường kính từ 1 - 10 cm, dài từ 30 - 100 cm.
- Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm, 366 nm (Vilber lourmat, CN-15-LC).
- Sắc ký cột Silica gel F254 cỡ hạt 60 - 200 µm (Merck), Sephadex LH-20, sắc
ký cột pha đảo RP-18 (30 - 50 µm, Merck).
- Máy đo phổ khối lượng LC/MS/MS-Water-API-ISI (Viện Hóa học, VAST).
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H- và

13

C-NMR) của hãng Bruker

(500MHz) (Viện Hóa học, VAST).
- Các trang thiết bị khác thuộc Viện Dược liệu, Bộ môn Dược học cổ truyền Trường Đại học Dược Hà Nội.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn
Theo phương pháp chiết xuất các lớp chất theo độ phân cực tăng dần của dung
môi.
Chiết xuất các hoạt chất từ dược liệu bằng ethanol (EtOH) 96% theo phương
pháp chiết nóng. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn. Hòa cắn vào
nước, lần lượt lắc phân đoạn với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan (Hx),
ethyl acetat (EtOAc), và n-butanol (BuOH).

các chất thu được từ các phân đoạn.
2.2.2.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập
Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (thử trên các hệ dung môi khác
nhau).

17