TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===o0o===

TRẦN THỊ THU YẾN

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG
GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
NẠP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 5/2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===o0o===

TRẦN THỊ THU YẾN

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG
GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE
NẠP BERBERINE HYDROCHLORIDE TẠO RA TỪ
GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY
TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp của mình, tôi xin cam
đoan:
1. Đề tài của tôi không sao chép bất cứ tài liệu nào có sẵn.
2. Đây là công trình của bản thân tôi nghiên cứu thực tiễn. Kết quả
trong khóa luận này đảm bảo tính chính xác và trung thực.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Trần Thị Thu Yến


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Từ đầy đủ

G. xylinus

Gluconacetobacter xylinus

BH

Berberine Hydrochloride

VLC

Vật liệu cellulose

ĐHSP

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài......................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .................................................................... 2
NỘI DUNG.................................................................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 4
1.1. Đặc điểm, tính chất và ứng dụng của vật liệu cellulose.......................... 4
1.1.1.Đặc điểm cấu trúc màng cenllulose vi khuẩn......................................... 4
1.1.2. Tính chất của vật liệu cellulose............................................................. 5
1.1.3. Ứng dụng của vật liệu cellulose............................................................ 5
1.2. Giới thiệu về thuốc Berberine Hydrochloride .......................................... 6
1.2.1. Nguồn gốc ............................................................................................ 6
1.2.2. Cấu trúc ............................................................................................... 6
1.2.3. Tác dụng được lý và ứng dụng.............................................................. 7
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc Berberine Hydrochloride .......... 8
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam................................... 8
1.3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc Berberine Hydrochloride .......................... 8
1.3.2. Tình hình nghiên cứu0.3 vật liệu cellulose............................................ 9
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................... 11
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 11
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................... 11
2.1.2. Nội dung nghiên cứu........................................................................... 11


2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................. 11
2.1.4. Nguyên liệu – hóa chất ....................................................................... 12
2.1.5. Môi trường lên men tạo vật liệu cellulose ........................................... 12
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 13
2.2.1. Phương pháp lên men thu vật liệu cellulose từ một số môi trường...... 13

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 34


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần của các môi trường lên men tạo VLC........................ 12
Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch Berberine
Hydrochloride ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau (n=3)................ 15
Bảng 3.1. Lượng thuốc Berberine Hydrochloride hấp thu vào VLC ở các
môi trường với độ dày khác nhau tại thời điểm 2 giờ.................... 22
Bảng 3.2. Hiệu suất hấp thu thuốc Berberine Hydrochloride vào các
VLC khác nhau với độ dày màng khác nhau ở thời điểm 2 giờ..... 23
Bảng 3.3. Tỷ lệ giải phóng thuốc Berberine Hydrochloride (%) từ màng
chuẩn trong các môi trường pH khác nhau (n = 3) ........................
23
Bảng 3.4. Tỷ lệ giải phóng BH của màng nước dừa già (n = 3) .................... 25
Bảng 3.5. Tỷ lệ giải phóng BH (%) từ màng gạo (n = 3) .............................. 27
Bảng 3.6. Tỷ lệ giải phóng thuốc BH ra các VLC ở các độ dày khác nhau
trong cùng 24 giờ với pH = 2........................................................ 29
Bảng 3.7. Tỷ lệ giải phóng thuốc ra các VLC ở các độ dày khác nhau
trong cùng 24 giờ với pH = 6,8..................................................... 30
Bảng 3.8. Tỷ lệ giải phóng thuốc BH ra các VLC ở các độ dày khác nhau
ở thời điểm 24 giờ tại pH = 12...................................................... 31


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của vật liệu cellulose ................................ 4
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Berberine .................................................... 7

chủ yêu là cây vàng đằng. Ngoài ra, còn được tìm thấy ở một số cây họ hoàng
(hoàng liên, thỏ hoàng liên, hoàng bá…) [1],[5]. Berberine thường được sử
dụng để điều trị các bệnh lý liên quan đến rối loạn đường tiêu hóa: hội chứng
lỵ, tiêu chảy, viêm ống mật, viêm ruột [13]. Ngoài ra, Berberine còn có tác
dụng tốt trong việc điều trị một số bệnh mãn tính như tiểu đường, viêm khớp,
giảm cholesterol trong máu, hạ đường huyết và viêm đại tràng. Theo một vài
nghiên cứu gần đây Berberine còn có thể ngăn chặn sựu phát triển của các tế
bào ung thư mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường ở nồng độ nhất
định [21].
Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus) là vi khuẩn có thể sản xuất một
loại polysacarid ngoại bào được gọi là vật liệu cellulose (VLC). VLC có cấu
trúc hóa học giống với cellulose thực vật nhưng lại có một số đặc tính tốt như:
độ bền cơ học, khả năng thấm hút cao, đường kính sợ nhỏ, độ tinh khiết cao,
khả năng polymer hóa lớn, có khả năng tát sử dụng và an toàn sinh học [2],
[7]… Do đó, vật liệu cellulose được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khoa
học công nghệ khác nhau. Trên thế giới, đã có một số nghiên cứu về VLC
như: Huang và các cộng sự đã sử dụng vật liệu cellulose nạp Berberine và
nghiên cứu giải phóng in vitro của Berberine trong môi trường dạ dày – ruột
mô phỏng; kết quả thu được cho thấy Berberine giải phóng kéo dài từ vật liệu
cellulose nạp Berberine [21]. Tuy nhiên, việc nghiên cứu và ứng dụng vật liệu
cellulose còn ở mức độ khiêm tốn, mới chỉ dừng lại ở bước đầu nghiên cứu.

1


Với mục đích tạo ra VLC lên men từ vi khuẩn G. xylinus nuôi cấy trong
một số môi trường nạp Berberine Hydrochloride, sau đó khảo sát, đánh giá sự
giải phóng thuốc. Đó là lý do tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu so sánh khả năng
giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp Berberine Hydrochloride tạo ra từ
Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong một số môi trường.”

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm, tính chất và ứng dụng của vật liệu cellulose
1.1.1. Đặc điểm cấu trúc màng cenllulose vi khuẩn
Hiện nay, Gluconacetobacter xylinus là loài vi khuẩn có khả năng tổng
hợp màng cellulose từ nguồn cabohydrat có hiệu quả nhất trong tự nhiên [15].
G. xylinus thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, hiếu khí bắt buộc, hóa dị dưỡng.
G. xylinus có dạng trực khuẩn, kích thước khoảng 2 µm, đứng riêng lẻ hoặc
xếp thành từng chuỗi và không có khả năng di động. Tế bào thường được tìm
thấy trong dịch rượu, giấm, nước ép hoa quả, trong đất. Ngoài ra, khả năng
tổng hợp cellulose rất lớn.
Trên môi trường nuôi cấy lỏng, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn
G. xylinus sử dụng đường để chuyển hóa tạo một lớp màng cellulose dẻo dai,
dày, có màu trắng trong hơi ngả vàng. Màng này có bản chất là tập hợp các vi
khuẩn liên kết với phân tử cellulose [27].
Vật liệu cellulose và cellulose thực vật tương tự nhau về mặt hóa học
tuy nhiên cấu trúc và đặc tính lại khác nhau. VLC là một chuỗi polymer do
các glucopyranose nối với nhau bởi liên kết β – 1,4 – glucan xếp song song
quanh trục. VLC gồm nhiều sợi siêu nhỏ, đường kính 1,5 nm. Các sợi này kết
hợp với nhau tạo thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100
nm, rộng 3 – 8 nm [21]. Đặc tính cấu trúc của vật liệu cellulose phụ thuộc rất
nhiều vào môi trường nuôi cấy.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cơ bản của vật liệu cellulose


1.1.2. Tính chất của vật liệu cellulose
- Ở điều kiện nuôi cấy tĩnh trong môi trường thể dịch, vật liệu cellulose
được tạo thành có tính chất như: khả năng kết tinh cao, độ polymer hóa lớn
nên VLC có độ bền cơ học cao, khả năng thấm và hút nước tốt do đó có thể

được làm màng bao xúc xích, làm màng bảo quản dừa tươi, thịt tươi được sơ
chế tôi thiểu ở nhiệt độ mát, vật liệu ổn định huyền phù, có tác dụng như chất
làm đặc trong nước ép, mứt kẹo, kem, salad,…
- Trong lĩnh vực mỹ phẩm: sản phẩm VLC vừa có khả năng giữ ẩm cao
lại không bám lại trên da sau khi rửa và không gây tác dụng phụ như sản
phẩm dưỡng da khác. Vì vậy, chúng được làm mặt nạ dưỡng da, móng tay
nhân tạo, kem dưỡng da, sơn móng tay,…
- Trong lĩnh vực môi trường: VLC được ứng dụng làm miếng xốp làm
sạch những vết dầu tràn; làm chất hấp thu trong các vật liệu để loại bỏ chất
độc hại; quần áo, dày dép tự phân hủy,…
1.2. Giới thiệu về thuốc Berberine Hydrochloride
1.2.1. Nguồn gốc
Berberine, tên khác là Berberine sulfate hoặc chlorhydrate. Berberine là
một alkaloid được chiết xuất từ cây Hoằng đằng (còn có tên vàng đắng, hoàng
liên, tên khoa học là Coptis teet) là loại cây dây leo than gỗ có phân nhánh,
mọc hoang ở nhiều nơi. Trong Hoằng đằng có nhiều alkaloid dẫn xuất của
izoquinolein, chủ yếu là Berberine tỷ lệ từ 1,5 – 2,3 %. Alkaloid Berberine có
thể được tìm thấy trong thân cây, vỏ cây, rễ và thân rễ (thân cây dưới lòng
đất) của cây [5], [8], [15].
Berberine thường có lẫn các tạp chất alkaloid khác như: palmatin,
jatrorrhizine. Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2 %, jatrorrhizin không
quá 5% [1], [5], [15].
1.2.2. Cấu trúc
Berberine thuộc nhóm isoquinol có khung protoberberine [1].
Isoquinolin còn được gọi là benzo pyridine hay 2 – benzamin là một họp chất
hữu cơ thơm heterocylic.
Công thức cấu tạo:


Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Berberine

bệnh động kinh với khả năng chống co giật, trong các trường hợp tổn thương
não do tắc mạch máu não gây ra, Berberine Hydrochloride bảo vệ các tế bào
thần kinh và có tác dụng chống trầm cảm. Đặc biệt, Berberine Hydrochloride
còn có tác dụng chống ưng thư, nó được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển
của nhiều loại tế bào ung thư mà không gây tác động đến sự phát triển của tế
bào bình thường ở nồng độ nhất định [25].
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định của thuốc Berberine Hydrochloride
- Chỉ định: Viêm đường ruột, tiêu chảy, lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ,
viêm ống mật, các chứng đau mỏi mắt và ngứa mắt do dị ứng [10].
- Chống chỉ định: quá mẫn cảm với các thành phần của thuốc, phụ nữa
có thai và cho con bú vì có khả năng gây co bóp tử cung làm ảnh hưởng tới
thai nhi [1], [10].
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc Berberine Hydrochloride
1.3.1.1. Trên thế giới
Trên thế giới đã có những công trình nghiên cứu về berberin như sau:
Huilixing và Jianping Ye đã xác định hiệu quả và tính an toàn của
berberin trong điều trị bệnh nhân tiểu đường loại 2 [22].
Ryan Bradley, ND, MPH và Bill Walter, ND đã nghiên cứu về berberin
trong điều trị bệnh tiểu đường [26].


Jianping Ye, Weiping Jia đã tìm hiểu về tác dụng và cơ chế của
berberin trong điều trị bệnh tiểu đường [23].
1.3.1.2. Ở Việt Nam
Đã có một số công trình nghiên cứu ở biệt Nam về thuốc Berberine
Hydrochloride như sau:
Đinh Thị Liên, Vũ Thanh Thảo, Trần Cát Đông, Trần Thành Đạo –
Khảo sát tác động kháng staphylococcus aureus của phối hợp berberin và
kháng sinh β – lactam [4].

bỏng bao gồm: cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số màng trị bỏng như màng
ối, da ếch, trung bì da lợn, màng chitosan,… Từ năm 2000, tác giả Nguyễn
Văn Thanh [7] và cộng sự đã có một số công trình nghiên cứu về VLC, đây là
cơ sở để chế tạo màng sinh học dùng trong điều trị bỏng [7].


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc Berberine
Hydrochloride của vật liệu cellulose lên men từ ba môi trường (môi trường
chuẩn, môi trường nước dừa già, môi trường nước vo gạo)
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
- Hình thành VLC từ 2 môi trường: môi trường chuẩn, nước dừa già,
nước vo gạo.
- Nạp thuốc Berberine Hydrochloride vào VLC.
- Với các môi trường pH khác nhau, nghiên cứu giải phóng thuốc
Berberine Hydrochloride.
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị:
- Máy đo quang phổ UV – Vis 2450 (shimadzu – Nhật Bản)
- Cân phân tích (Sartorius – Thụy Sỹ)
- Cân kỹ thuật – Sartorius TE 3102 S
- Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA – Nhật Bản
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức)
- Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức)
- Máy nước cất 2 lần (Hamilton – Anh)
- Bể bồn nhiệt (Đức)
- Tủ lạnh Daewoo, tử lạnh sâu

Nước dừa già
Nước vo gạo
Nước cất 2 lần
Dịch giống G. xylinus

MTC
20 g
5g

Môi trường
MTD
30 g
10 g
0,3 g

MTG
30 g
10 g
0,3 g

2,7 g
0,5 g

0,5 g

2%
1000 ml

2%




Hình 2.1. Sơ đồ tinh chế thu VLC
2.2.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng
Mục đích: Kiểm tra và đảm bảo rằng sau khi xử lý, VLC đã được loại
bỏ các chất độc hại và đã có sự tồn tại của đường glucose trong VLC.
Nguyên tắc: Sử dụng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sựu hiện
diện của đường D – glucose, nếu xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì có đường D
glucose trong màng.


Tiến hành:
- Dịch thử của VLC các loại sau khi đã xử lý hóa học.
- Mẫu đối chứng: là nước cất và dung dịch D – glucose.
- Cho mỗi ống 1 ml thuốc thử Fehling vào các ống nghiệm chứa mẫu thử.
- Sau đó, đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 – 15 phút. Quan sát kết tủa
xuất hiện trong ống nghiệm.
2.2.4. Phương pháp xác định đường chuẩn
Chuẩn bị dung dịch cồn 96° và các dung dịch với nồng độ Berberine
Hydrochloride ở (mg/ml) khác nhau là: 5%, 10%, 20%, 30%, 40% trong dung
dịch cồn 96°.
Đo cường độ quang phổ của các dung dịch đã pha ở bước sóng 345 nm
bằng máy đo quang phổ UV – Vis 2450 [14], [21].
Bằng phần mềm Excel 2010 xây dựng đồ thị đường chuẩn là lập
phương trình đường chuẩn Berberine Hydrochloride.
Thực hiện 3 lần đo như trên rồi lấy kết quả trung bình.
Kết quả trung bình giá trị OD 345 nm của các nồng độ thuốc khác nhau
được thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch Berberine Hydrochloride ở
các nồng độ (mg/ml) khác nhau (n=3)


10

0,712

0,714

0,710

0,712 ± 0,002

3

20

1,523

1,522

1,532

1,526 ± 0,006

4

30

2,031

2,299