BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER
LIÊN KẾT TÍNH KHÁNG BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ
TRÊN CÂY DỨA CAYENNE (Ananas comosus)
BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003-2007
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỒNG PHONG
CN. LƢU PHÚC LỢI
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007
iii
LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn:
- Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều
kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.
- Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực
tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua.
- TS. Trần Thị Dung và CN. Lƣu Phúc Lợi đã tận tình hƣớng dẫn và động viên
trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
- TS. Lê Đình Đôn đã hƣớng dẫn và góp ý cho tôi khi tiến hành chủng rệp tại
nhà lƣới.
- CN. Hồ Việt Thế và các anh chị phụ trách phòng CNSH thực vật thuộc
rệp sáp.
Xác định marker RAPD liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa
Cayenne.
Các kết quả thu đƣợc:
Kết quả cây phân nhóm di truyền cho thấy giữa nhóm Cayenne và đối
chứng Queen có hệ số tƣơng đồng là 0,9. Nhóm dứa Cayenne phân thành
2 nhóm nhỏ: nhóm 1 gồm 2 giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan,
nhóm 2 là giống Lâm Đồng. Mức tƣơng đồng giữa 2 nhóm khoảng 0,92.
Kết quả kiểm tra độ tin cậy bằng phần mềm winboot cho thấy cây phân
nhóm di truyền tạo ra là có độ tin cậy cao nhất.
Kết quả nuôi rệp sáp cho thấy rệp có thể phát triển tốt trên bí đỏ và trong
điều kiện 25-26
o
C rệp phát triển tốt hơn trong điều kiện 33-34
o
C.
Đã lây nhiễm đƣợc bệnh héo đỏ đầu lá lên dứa Cayenne với tỷ lệ 35,66%
cây có biểu hiện bệnh.
Chƣa phát hiện đƣợc marker liên kết rõ ràng với kiểu hình kháng bệnh
héo đỏ đầu lá. v
SUMMARY
Studying genetic diversity and detect markers associated with resistance
to wilt disease in cayenne pineapple by RAPD-PCR
Supervisor: Tran Thi Dung
1
; Luu Phuc Loi
vi
MỤC LỤC
CHƢƠNG TRANG
Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii
Tóm tắt .................................................................................................................. iv
Summary ................................................................................................................ v
Mục lục .................................................................................................................. vi
Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... x
Danh sách các hình và biểu đồ .............................................................................. xi
Danh sách các bảng ............................................................................................ xiii
Chƣơng 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu, nội dung và yêu cầu của đề tài ........................................................ 2
1.2.1. Mục tiêu ....................................................................................................... 2
1.2.2. Nội dung ....................................................................................................... 2
1.2.3. Yêu cầu ......................................................................................................... 2
Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3
2.1. Giới thiệu chung về cây dứa ........................................................................... 3
2.1.1. Phân loại và nguồn gốc ................................................................................ 3
2.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa ............................................................... 3
2.1.2.1. Việt Nam .................................................................................................. 3
2.1.2.2. Thế giới ..................................................................................................... 4
2.1.3. Các nhóm dứa chính ..................................................................................... 5
2.1.3.1. Nhóm Queen ............................................................................................. 5
2.1.3.2. Nhóm Tây Ban Nha .................................................................................. 6
2.1.3.3. Nhóm Cayenne .......................................................................................... 7
3.1.3. Dụng cụ và thiết bị .................................................................................... 23
3.1.4. Hóa chất ..................................................................................................... 24
3.1.5. Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 24
3.1.5.1. Ly trích DNA tổng số từ lá dứa .............................................................. 24
viii
3.1.5.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD .................................................................... 26
3.1.5.3. Thực hiện phản ứng RAPD .................................................................... 28
3.1.5.4. Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS và Winboot ........ 28
3.2. Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne ......................................... 30
3.2.1. Thời gian và địa điểm................................................................................. 30
3.2.2. Đối tƣợng ................................................................................................... 30
3.2.3. Dụng cụ ..................................................................................................... 30
3.2.4. Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 31
3.2.4.1. Nuôi rệp ................................................................................................... 31
3.2.4.2. Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh .............................................................. 31
3.2.4.3. Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa sạch bệnh .......................................... 32
3.3. Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo đỏ
đầu lá trên dứa Cayenne ....................................................................................... 33
3.3.1. Thời gian và địa điểm................................................................................. 33
3.3.2. Đối tƣợng ................................................................................................... 33
3.3.3. Dụng cụ và thiết bị ..................................................................................... 33
3.3.4. Hóa chất ..................................................................................................... 33
3.3.5. Phƣơng pháp .............................................................................................. 33
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 35
4.1. Đánh giá đa dạng di truyền của cây dứa Cayenne bằng kỹ thuật RAPD ...... 35
4.1.1. Kết quả ly trích DNA tổng số từ lá dứa ..................................................... 35
4.1.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD ....................................................................... 35
4.1.3. Thực hiện phản ứng RAPD ........................................................................ 36
4.1.4. Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS và Winboot ............ 40
x
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
EB extraction buffer
EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid
CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
dNTP
Deoxyribonucleotide triphosphate
OD Optical density
OUT Operational Taxonomic Unit
PCR Polymerase Chain Reaction
PMWaV Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus
QTL Quantivative Trait Locus
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
TAE Tris – Acetate – EDTA
TE Tris – EDTA
Tm Melting temperature
Hình 3.2 Dứa bệnh làm nguồn lây PMWaV ..................................................... 32
Hình 3.3 Vị trí thả rệp lên dứa sạch bệnh ........................................................ 33
Hình 4.1 Kết quả ly trích DNA dứa .................................................................. 35
Hình 4.2 Kết quả khảo sát nồng độ Taq polymerase ........................................ 36
Hình 4.3 Kết quả khảo sát nồng độ primer ....................................................... 36
Hình 4.4 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPAC10 ............................ 38
Hình 4.5 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPAH13 ............................ 38
Hình 4.6 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPB01 ............................... 39
Hình 4.7 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPB08 ............................... 39
Hình 4.8 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer S1384................................. 40
Hình 4.9 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer V20 .................................... 40
Hình 4.10 Cây phân nhóm di truyền dựa vào kết quả RAPD ........................... 41
Hình 4.11 Độ tin cậy của các phân nhóm ........................................................ 42
Hình 4.12 Các kiểu phân nhóm khác ................................................................ 43
Hình 4.13 Rệp phát triển trên bí sau 1 tháng .................................................... 44
Hình 4.14 Chuyển Rệp bằng đèn ...................................................................... 45
Hình 4.15 Rệp phát triển trên dứa bệnh 1 tuần sau khi chủng .......................... 46
Hình 4.16 Rệp bám vào mặt sau lá dứa bệnh .................................................... 46
Hình 4.17 Rệp phát triển trên dứa sau khi chủng ............................................. 47
xii
Hình 4.18 Dứa biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá. ................................................... 48
Hình 4.19 Kết quả phân tích RAPD các cây dứa biểu hiện và không biểu
hiện bệnh héo đỏ đầu lá với primer OPAC10 ................................................... 49
Hình 4.20 Kết quả phân tích RAPD các cây dứa biểu hiện và không biểu
hiện bệnh héo đỏ đầu lá với primer OPB08 ...................................................... 49
Biểu Đồ 4.1 Sự phát triển của rệp ở 25-26
o
C và 33-34
o
Bảng 2.1 Sản lƣợng dứa của 5 quốc gia trồng nhiều nhất ....................................... 4
Bảng 2.2 Quả tƣơi xuất khẩu ................................................................................... 5
Bảng 2.3 Quả tƣơi nhập khẩu ................................................................................... 5
Bảng 3.1 Các nghiệm thức trong tối ƣu hoá nồng độ Taq polymerase .................. 27
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng RAPD. ........................................................... 27
Bảng 3.3 Các nghiệm thức trong tối ƣu hoá nồng độ primer. ................................ 28
Bảng 4.1 Số band khuếch đại và band đa hình giữa dứa và lan ............................. 37
Bảng 4.2 Số band khuếch đại và band đa hình giữa dứa Cayenne và dứa Queen . 37
Bảng 4.3 Hệ số đồng dạng di truyền của 3 giống dứa Cayenne và các đối chứng 41
Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính
kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne (Ananas comosus) bằng phƣơng
pháp RAPD ” đƣợc thực hiện với hy vọng là cơ sở để thực hiện có hiệu quả việc lai
tạo giống đồng thời tạo cơ sở cho việc chọn ra giống dứa có khả năng kháng tự
nhiên đối với bệnh héo đỏ đầu lá, góp phần bảo vệ năng suất, phẩm chất của cây
dứa, mang lại hiệu quả kinh tế cho nông dân và xã hội.
2
1.2. Mục tiêu, nội dung và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu
Phân tích đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan,
Lâm Đồng tại Tp. Hồ Chí Minh.
Xác đinh marker RAPD liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa
Cayenne.
1.2.2. Nội dung
Đánh giá đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne tại Tp. Hồ Chí Minh.
Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne.
Xác Định marker liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá.
1.2.3. Yêu cầu
Ly trích DNA tổng số từ lá dứa.
Thực hiện PCR với mồi RAPD để xác định sự đa dạng di truyền của các giống
dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan, Lâm Đồng tại Tp. Hồ Chí Minh.
Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa.
Thực hiện PCR với mồi RAPD để xác định band đa hình liên kết tính kháng
bệnh héo đỏ đầu lá dứa.
đới có mùa đông tƣơng đối ẩm. Dứa đƣợc coi là một trong những cây ăn quả nhiệt
đới hàng đầu, loại quả “vua” rất đƣợc ƣa chuộng ở các nƣớc phƣơng Tây.
2.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa
2.1.2.1. Việt Nam
Ở nƣớc ta, dứa đƣợc trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nƣớc hiện khoảng
40.000 ha với sản lƣợng khoảng 500.000 tấn trong đó 90% là phía Nam. Các tỉnh
trồng dứa nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau, Cần Thơ, Long
An…; miền Bắc là Thanh Hóa, Ninh Bình, Tuyên Quang, Phú Thọ…; miền Trung có
Nghệ An, Quảng Nam, Bình Định… Năng suất quả bình quân một năm ở các tỉnh
phía Bắc khoảng 10 tấn/ha, phía Nam khoảng 15 tấn/ha.
Trong năm cây dứa ra hoa nhiều vụ. Ở miền Bắc vụ chính ra hoa tháng 2-3, thu
hoạch tháng 6-7, vụ trái ra hoa tháng 6-8, thu hoạch tháng 10-12. Ở miền Nam, dứa
có thể ra hoa quanh năm, song thƣờng tập trung vào tháng 4-5 và tháng 9-10. Từ khi
ra hoa đến thu hoạch trung bình khoảng 4-5 tháng. 4
Ngoài ăn tƣơi, quả dứa còn dùng chế biến thành dứa hộp và nƣớc dứa, là những
mặt hàng xuất khẩu lớn. Xác bã quả dứa sau khi chế biến dùng làm thức ăn gia súc và
phân bón. Thân lá dứa làm bột giấy.
2.1.2.2. Thế giới [18]
Sản lƣợng dứa hằng năm của thế giới tăng gấp 3 trong suốt 40 năm từ
3.833.137 tấn năm 1961 đến 13.738.735 tấn năm 2001 (d’Eeckenbrugge và Leal,
2001) và hiện nay đã vƣợt quá 13 tỉ tấn (FAOSTAT, 2001). 5 quốc gia sản xuất dứa
lớn nhất (bảng 2.1) chiếm khoảng 56% sản lƣợng của thế giới. Sản lƣợng của
Brazil, Columbia và Trung Quốc tăng gấp 3 từ 1980, trong khi Philippines và
Indonesia tăng nhẹ (Rieger, 2001).
Bảng 2.1 Sản lƣợng dứa của 5 quốc gia trồng nhiều nhất
Quốc gia Sản lƣợng 1999 (tấn)
Thái Lan 2 353 037
Sản phẩm dứa chủ yếu là dứa đóng hộp. Trong năm 1999, hơn 1 triệu tấn dứa
đóng hộp đƣợc xuất khẩu, chủ yếu từ Thái Lan, Philippines và Indonesia chiếm
khoảng 76%. Thái Lan là nƣớc xuất khẩu nhiều nhất chiếm 46% lƣợng xuất khẩu
toàn thế giới (FAOSTAT, 2001). Liên minh Châu Âu là 1 thị trƣờng lớn của quả tƣơi,
tiếp sau là Mỹ.
Bảng 2.3 Quả tƣơi nhập khẩu
Quốc gia
Nhập khẩu trong năm
1999 (Tấn)
European Union 330 502
Mỹ 283 090
Nhật 89 866
Canada 32 507
Singapore 19 962
Thế giới 1 031 980
2.1.3. Các nhóm dứa chính [8]
2.1.3.1. Nhóm Queen
Là loại đƣợc trồng chủ yếu ở nƣớc ta hiện nay.
Đặc tính đóng hộp kém, nhƣng dùng để ăn tƣơi và xuất khẩu tƣơi rất tốt. 6
Các đặc điểm về hình thái:
Lá: Đầy gai, lá ngắn hơn Cayenne.
Chồi: Nhiều chồi cuống, chồi nhỏ.
Dạng quả: Hình nón, mắt sâu.
Trọng lƣợng quả trung bình 1 kg.
Lõi nhỏ.
Màu vỏ trái khi chín: Vàng.
Màu vỏ trái khi chín: Vàng da cam.
Màu ruột khi chín: Vàng nhạt đến vàng.
Hƣơng vị: Ngọt, hơi chua, ít xơ, nhiều nƣớc, mềm.
Tính đề kháng: Mẫn cảm với bệnh héo đỏ đầu lá.
Năng suất cao.
Dứa Cayenne chứa rất nhiều nƣớc, vỏ lại mỏng nên rất dễ thối khi vận chuyển
đi xa. Tuy nhiên, nƣớc lại có tỉ lệ đƣờng cao, vị chua nhẹ (acid trong dứa Cayenne
thấp hơn dứa Queen), mùi thanh, rất hợp khẩu vị ngƣời phƣơng Tây. Mắt dứa
Cayenne lại rất cạn, gọt vỏ xong không cần lấy mắt có thể ăn ngay. Những ƣu điểm
trên rất thuận lợi cho việc chế biến, đóng hộp qui mô công nghiệp nên dứa Cayenne
là nguyên liệu chính cho ngành công nghiệp chế biến - xuất khẩu dứa và hầu nhƣ
toàn bộ diện tích dứa Cayenne ở nƣớc ta hiện nay đều là vùng nguyên liệu của các
nhà máy chế biến dứa.
Các giống Cayenne đƣợc trồng phổ biến hiện nay là giống Cayenne Thái Lan,
Cayenne Trung Quốc và Cayenne Lâm Đồng. Theo tài liệu của Viện cây ăn quả
miền Nam, giống Cayenne Thái Lan và Trung Quốc đều cho trái to và phát triển tốt;
tuy nhiên là giống mới nhập nội nên cần có thời gian để kết luận . Giống Cayenne
Lâm Đồng đã phát triển lâu đời ở Việt Nam , thích nghi với khí hậu nƣớc ta , phẩm
chất tốt nên phát triển trong giai đoạn hiện nay.
2.2. Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị
2.2.1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị
Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự
bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của 8
một loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền,
do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể,
làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác
với những cá thể khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền nhƣ vậy đƣợc gọi là
một chiều isozyme sẽ di chuyển (trên gel polyacrylamide hoặc gel tinh bột) về cực
dƣơng của điện trƣờng.
Isozyme đƣợc sử dụng trong nhiều mục đích khác nhau, đặc biệt trong nghiên
cứu đa dạng di truyền của thực vật và động vật, khoảng cách lan rộng của hạt phấn ,
định danh giống, kiểm tra phả hệ…
Kết quả mà chỉ thị isozyme đem lại khả quan hơn so với chỉ thị hình thái do số
lƣợng chỉ thị có thể phát hiện đƣợc nhiều hơn, tuy nhiên số lƣợng chỉ thị cũng vẫn
ít, không đáp ứng cho những nghiên cứu sâu rộng.
2.2.4. Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA
Là những chỉ thị đƣợc tạo ra nhờ phƣơng pháp cắt DNA bằng enzyme cắt giới
hạn (restriction enzyme) hoặc PCR. Các chỉ thị phân tử này có thể liên kết với một
gene nào đó trong nhiễm sắc thể.
Các chỉ thị DNA có nguồn gốc từ hai nhóm:
Chỉ thị dựa vào phƣơng pháp lai DNA: RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphisms).
Chỉ thị dựa vào phƣơng pháp PCR: SSCP (Single – Strand Conformation
Polymorphism), STS (Sequence – Tagged Sites), Microsatellites (SSR – Simple
Sequences Repeat), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism), DAF (DNA Amplification
Fingerpriting) …
Lợi ích của chỉ thị DNA so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme:
Đo lƣờng trực tiếp các vật liệu di truyền.
Có rất nhiều chỉ thị DNA trong quần thể.
Phân tích không bị ảnh hƣởng bởi môi trƣờng và giai đoạn phát triển của
đối tƣợng.
10
đơn giản, chi phí thấp, không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng, chất
lƣợng DNA tổng số không đòi hỏi quá tinh sạch, cho đa hình cao và thời gian thực
hiện ngắn.
Những hạn chế của kỹ thuật RAPD: Kỹ thuật RAPD không ổn định (độ lặp lại
thấp), cho đa hình cao nhƣng độ tin cậy lại thấp.
2.3. Các phƣơng pháp chủ yếu tạo cây phát sinh loài [3]
Tất cả các phƣơng pháp nghiên cứu sự đa dạng của quần thể đều cho kết qủa
cuối cùng là các dữ liệu phân tử phức tạp nhƣ các băng vạch trên bảng điện di hoặc
thông tin trình tự DNA, RNA, protein. Để lấy đƣợc các thông tin sinh học từ dữ liệu
thô này, các nhà khoa học cần đến sự hỗ trợ của máy tính với các phần mềm phân
tích dữ liệu thực nghiệm. Các thông số về độ đa dạng kiểu gene, độ đa dạng kiểu
hình, khoảng cách gene giữa các cá thể đƣợc tính toán theo phƣơng trình của Dice
(1979). Từ các thông tin này, cây phát sinh loài sẽ đƣợc xây dựng khi dùng các
phƣơng pháp UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic),
Neighbor Joining, Transformed distance, Neighbors-relation, Maximum parsimoni
hoặc Maximum likehood, Minimum evolution. Trong các phƣơng pháp trên thì
phƣơng pháp UPGMA là phƣơng pháp đơn giản nhất và đang đƣợc sử dụng phổ
biến nhất.
UPGMA phản ánh mức tƣơng tự kiểu hình giữa các OTU (Operational
Taxonomic Unit) (đại diện cho các cá thể ) với ca
́
c bƣớc sau: Trƣơ
́
c tiên tạo ma trận
tƣơng quan giữa các OTU từ dữ liệu đa hình; với ma trận trên, thuật toán sẽ nhóm
một cặp OTU có khoảng cách nhỏ nhất (có mức tƣơng đồng gene cao nhất) với giá
trị bằng nửa khoảng cách giữa hai OTU; sau đó, cặp đơn vị tiến hóa này đƣợc xem
nhƣ một OTU mới và khoảng cách giữa OTU mới này với một OTU khác là trung
bình khoảng cách giữa OTU đó với OTU còn lại trong nhóm. Thuật toán tiếp tục
Xác định đặc tính của phôi dứa (Ananas spp) bằng marker AFLP: 40 giống
(dòng) dứa đƣợc thu thập và xác định mức độ đa hình giữa các giống, đặc tính của
chúng. Sự phân nhóm di truyền đã chỉ rõ mối liên quan giữa các nhóm và sự khác
Copyright: Tài liệu đại học ©